韋仕南, 周志楠, 駱金紅,敖 葉,陳 祥*

(1.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

努比亞山羊原產(chǎn)于非洲北部的埃及與蘇丹，屬肉乳兼用型品種，具有雙羔率高、體型大、生長快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點，引進(jìn)后與本地山羊雜交優(yōu)勢明顯。努比亞山羊的繁殖率為192.8%，多羔率高達(dá)93%，且隨著胎次的增加而增加，故其可作為研究繁殖性狀的理想山羊模型。NAC是L-精氨酸的天然衍生物，是L-半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的前體，分子式為CHNOS，分子量為163.2，能夠促進(jìn)還原型谷胱甘肽在細(xì)胞內(nèi)生物合成，提高機(jī)體的抗氧化作用。能調(diào)節(jié)雌鼠生育指數(shù)，減少胎兒植入后的損失，改善性腺激素紊亂和生殖功能。另外，NAC還可以通過降低顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡水平，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)胚胎著床及卵泡發(fā)育。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族是一種重要的促血管生成因子，包括VEGFA，VEGFB，VEGFC，VEGFD，VEGFE和VEGFF五種糖蛋白亞型，在胚胎血管系統(tǒng)的發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGFD能夠誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管的生長，并極顯著促進(jìn)血管生成和淋巴生成因子的形成，不僅如此，VEGFD還對血管系統(tǒng)退行性疾病的治療以及淋巴因子的恢復(fù)均起到重要作用。故針對基因的用途大多集中在疾病的臨床治療上，在繁殖方面研究較少。1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1)又叫做1，屬于血管內(nèi)皮生長因子受體成員之一，是一種酪氨酸激酶受體，VEGFR1與VEGFD親和力較高，兩者結(jié)合后能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育和成熟、增加造血干細(xì)胞，從而促進(jìn)血管發(fā)育和生成。在胚胎發(fā)育初期，VEGFR1首先在成血管細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，到胚胎發(fā)育晚期時VEGFR1的表達(dá)量隨著時間的增加而降低，此時，VEGFR1在內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及部分造血干細(xì)胞中均有表達(dá)。另外，病理學(xué)研究表明VEGFR1也能夠在支氣管上皮和肺泡上皮中高表達(dá)。與基因類似，VEGFR1的研究主要集中在病理方面。針對血管內(nèi)皮生長因子的病理學(xué)研究也較為熱門，但其對于山羊繁殖相關(guān)研究較少。故本試驗通過qRT-PCR技術(shù)檢測妊娠前期飼喂NAC努比亞山羊與1基因表達(dá)差異，為后續(xù)探究NAC對山羊繁殖調(diào)控機(jī)理及與1基因更為深入的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗動物由貴州省某畜牧業(yè)開發(fā)有限公司種羊場提供，將配種后的努比亞山羊母羊分為空白組、0.07 % 組各15只，配種后的第2天于飼糧中添加NAC飼喂，持續(xù)30 d。對空白組、0.07% 組努比亞山羊分別采取下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織，-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗儀器

PCR擴(kuò)增儀(C1000 Touch)、實時熒光定量PCR儀(型號為CFX96 Real-Time System)、凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)，均購自美國BIO-RAD有限公司；紫外可見分光光度計，購自美國Thermo Fisher有限公司；電泳儀(DYY-2C型)，購自北京市六一儀器廠。

1.3 試驗試劑

N-乙酰半胱氨酸(珠海市泛海生物技術(shù)有限公司，純度≥97 %)；Trizol試劑(貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；液氮、氯仿、0.5% 的TAE緩沖液、異丙醇、75% 的乙醇、瓊脂糖(貴州艾瑞特生物技術(shù)有限公司)；熒光試劑(擎科生物科技有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 組織樣品總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用Trizol RNA裂解法提取努比亞山羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織的RNA并使用分光光度計進(jìn)行測量。將質(zhì)量與濃度合格的組織RNA稀釋成同等濃度后(200 ng/μL)，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。將提取后的RNA按20 μL的體系(dNTP Mix，4 μL、5×RT Buffer，4 μL、primer Mix，2 μL、RNA，1 μL、DTT，2 μL、HiFiscript，1 μL、RNase-Free Water，6 μL)加入PCR小管，振蕩混勻，離心后，于PCR儀上42 ℃ 孵育50 min，85 ℃ 孵育5 min；反應(yīng)結(jié)束后，取1 μL 反應(yīng)產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進(jìn)行濃度和純度檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物的設(shè)計 根據(jù)Genbank上傳的基因(登錄號：XM_005701076.3)、1基因(登錄號：XM_018056600.1)mRNA序列利用NCBI在線軟件設(shè)計引物，以-基因(登錄號：NC_024323.1)為試驗的內(nèi)參基因，引物詳細(xì)信息見表1，設(shè)計完畢后將引物上下游序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.3 實時熒光定量PCR條件優(yōu)化及反應(yīng) 在各條件相同的情況下，對引物退火溫度和濃度進(jìn)行摸索、優(yōu)化，篩選佳退火溫度和引物濃度，確定最佳反應(yīng)體系及退火溫度，用于實時熒光定量PCR試驗。本試驗采用SYBR染料法檢測、1基因在NAC飼喂前后努比亞山羊下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織中的表達(dá)量。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×T5 Fast qPCR Mix，5.5 μL、Forward Primer，0.4 μL、Reverse Primer，0.4 μL、cDNA，1 μL、ddHO，2.7 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s；60 ℃ 退火10 s；72 ℃ 延伸15 s；進(jìn)行40個循環(huán)，95 ℃，15 s；最后從60 ℃ 按0.5 ℃ 增值到95 ℃ 進(jìn)行溶解曲線分析，熒光采集時間為10 s，每個樣品進(jìn)行3個平行試驗，檢測和1基因在NAC飼喂前后努比亞山羊5個組織中的表達(dá)情況，構(gòu)建組織表達(dá)譜。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法 本次試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2013進(jìn)行2法分析、1基因在努比亞山羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織中的差異表達(dá)量，試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析與獨立樣本檢驗，使用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗，分別在0.05與0.01兩個水平上判斷表達(dá)量之間的差異是否達(dá)到顯著與極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 VEGFD基因在不同組織中的表達(dá)

由圖1可知，基因在努比亞山羊被檢測的五個組織中均有不同程度地表達(dá)，其中基因在努比亞山羊NAC飼喂組表達(dá)量的順序依次為：垂體>下丘腦>子宮>卵巢>輸卵管，在空

圖1 VEGFD基因在不同組織中的表達(dá)量“*”表示兩組之間差異為顯著，“**”表示表示兩組之間差異為極顯著。下同。Fig. 1 Expression of VEGFD gene in different tissues“*” indicates that the difference between the two groups is significant,“**” indicates that the two groups the difference is bighly significant. The same below.

白組中的表達(dá)量依次為：垂體>子宮>輸卵管>卵巢>下丘腦；組間比較可知NAC飼喂組中基因在卵巢中的表達(dá)量極顯著高于空白組(<0.01)，NAC飼喂組在下丘腦中的表達(dá)量極顯著高于空白組(<0.01)，在垂體中的表達(dá)量顯著高于空白組(<0.05)；但是在輸卵管中基因在努比亞山羊NAC飼喂組中的表達(dá)量卻極顯著低于空白組(<0.01)。

2.2 VEGFR1基因在不同組織中的表達(dá)

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，1基因在努比亞山羊輸卵管中的表達(dá)量最高，在卵巢中的表達(dá)量最低，在NAC飼喂組中表達(dá)量由高到低依次為輸卵管>子宮>下丘腦>垂體>卵巢，而在空白組中的表達(dá)量由高到低依次為：輸卵管>垂體>下丘腦>子宮>卵巢。組間對比分析可知在努比亞山羊NAC飼喂組中，1基因在下丘腦，子宮以及輸卵管中的表達(dá)量極顯著高于空白組(<0.01)而其余組織間均未達(dá)到顯著性差異。

圖2 VEGFR1基因在不同組織中的表達(dá)量Fig. 2 The expression level of VEGFR1 gene in different rentals

3 討 論

繁殖性狀是山羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀，提高繁殖力是提高山羊養(yǎng)殖效率的重要保證，也能夠提高廣大山羊養(yǎng)殖戶的利益。NAC作為一種飼料添加劑現(xiàn)已被廣大研究學(xué)者投入使用，其在免疫調(diào)節(jié)、生殖調(diào)節(jié)、抑制炎癥方面均有一定的作用。在胚胎培養(yǎng)基中，添加NAC、乙?；?L-肉堿和α-硫辛酸作為抗氧化劑組合，能促進(jìn)小鼠早期胚胎的發(fā)育和提高胚胎的生存能力，此外，NAC還可以提高玻璃化冷凍后胚胎的壽命和生存率，使小鼠囊胚具有更高的體外發(fā)育潛能。NAC在動物繁殖方面的研究也受到了廣大研究學(xué)者的關(guān)注，在日糧中添加NAC能夠改善雞腸道組織的形態(tài)和能量狀況，提高冷應(yīng)激肉雞腸道抗氧化能力，有利于提高蛋雞的產(chǎn)蛋性能及雞蛋品質(zhì)。NAC對豬的生長性能也具有促進(jìn)作用，在產(chǎn)前母豬日糧中添加NAC可增加仔豬的總產(chǎn)仔數(shù)，降低仔豬出生后的死亡率，提升仔豬的性能，促進(jìn)胚胎發(fā)育。以上研究表明，NAC可能對動物的繁殖性能具有促進(jìn)作用。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測了NAC飼喂前后繁殖相關(guān)基因與1在努比亞山羊不同性腺組織表達(dá)量與產(chǎn)羔數(shù)的影響，結(jié)果表明，飼喂NAC后，基因在下丘腦、子宮、卵巢、垂體中的表達(dá)量均有所提高，相對于空白組，NAC飼喂能極顯著與顯著的提高了基因在下丘腦(<0.01)與垂體(<0.05)中的表達(dá)量。同樣的，在飼喂NAC后除垂體外，1基因在努比亞山羊不同性腺組織中的表達(dá)量也有所提高，極顯著提高了其在下丘腦、輸卵管、子宮中的表達(dá)量(<0.01)，而且，NAC飼喂組相對于空白組的平均產(chǎn)羔數(shù)提升了0.33只，這提示NAC可促進(jìn)繁殖相關(guān)基因在努比亞山羊性腺組織中的表達(dá)，進(jìn)而提高山羊的繁殖效率。宋天增等在日糧中添加 NAC，提高藏山羊母羊妊娠期第15和30日外周血液E2和P4濃度， Kazi等研究表明，在孕激素的作用下，1表達(dá)也增加，使得能夠充分發(fā)揮其效能，從而進(jìn)一步增加了內(nèi)膜微血管密度和血管通透性，使內(nèi)膜間質(zhì)明顯水腫，提供了胚胎著床所必須的條件。以上研究結(jié)果與本研究的最終結(jié)果一致。由以上研究推測，NAC提高努比亞山羊產(chǎn)羔率的機(jī)理為，通過提高努比亞山羊的外周血孕激素濃度，從而促進(jìn)1表達(dá)，使得努比亞山羊子宮快速增殖，為后期的胚胎著床提供所必須的條件，以此保證胚胎更好的存活，最終達(dá)到提升產(chǎn)羔率的目的。

目前基因組織表達(dá)圖譜尚未報道。吳書坡等利用RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，、1與2基因在長白豬心、肝、脾、肺、腎等組織的表達(dá)廣泛表達(dá)，但其在性腺組織中的表達(dá)量尚未探討。本研究發(fā)現(xiàn)，與1基因在努比亞山羊各性腺組織中也存在廣泛表達(dá)，VEGF是主要的促血管內(nèi)皮生長因子，而與1是其不同的亞型與受體，故其廣泛表達(dá)與各組織中與本試驗結(jié)果一致。Bower等研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中是必不可少的，能調(diào)節(jié)血管生成和淋巴管生成。但本研究發(fā)現(xiàn)，兩者在空白組卵巢中的表達(dá)量極微，針對卵巢組織的許多研究表明，VEGF蛋白在豬和羊的各時期卵泡、牛次級卵泡中的顆粒細(xì)胞、黃體、內(nèi)膜血管等均有表達(dá)，這與本研究結(jié)果不符。部分表明VEGF的不同亞型在不同通路中的作用不盡相同，梅興科等研究發(fā)現(xiàn)，及其1高表達(dá)于正常組織，低表達(dá)于患病組織，本研究推測采集的努比亞山羊卵巢組織存在著部分病變，故其在卵巢組織中的表達(dá)量過低，但具體機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

在努比亞山羊妊娠前期飼喂NAC后，能提高山羊的平均產(chǎn)羔數(shù)，且能提高繁殖相關(guān)基因VEGFD與VEGFR1在山羊性腺軸組織中的表達(dá)量。這提示NAC可能通過提高繁殖相關(guān)基因在努比亞山羊不同組織中的表達(dá)進(jìn)而對山羊的繁殖起調(diào)控作用。