劉思凡 楊津仲 楊雯 劉君

（海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)教研室，海南 ?？?571199）

陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis）是全球最常見的非病毒性性傳播疾病的病原，可感染人體泌尿生殖系統(tǒng)，多數(shù)感染者不會(huì)呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀，甚至沒有癥狀而呈帶蟲狀態(tài)，但感染后可引起非典型性盆腔炎、受精率降低、早產(chǎn)、新生兒體質(zhì)量偏低，罹患前列腺癌和宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加及感染HIV 等病原體的感染幾率上升[1-3]，是一種不容忽視的寄生蟲。陰道毛滴蟲對(duì)臨床常用的藥物甲硝唑產(chǎn)生抗藥現(xiàn)象被廣泛報(bào)道[4]，需要尋找其他有效的藥物進(jìn)行治療。

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）隸屬胡頹子科沙棘屬，主要分布在中國(guó)、印度等，是種富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的藥食兩用植物[5,6]，它的果實(shí)、種子、葉片及其提取物均可入藥，含有多種維生素、脂類、酚類化合物、類胡蘿卜素、生育酚和植物甾醇等藥用成分[7]，種子和漿果油可用于預(yù)防和治療胃潰瘍[8]、心血管疾病[9]、特應(yīng)性皮炎[10]和抗抑郁[11]等，沙棘果粉[12]及沙棘油[13]已被證實(shí)對(duì)陰道毛滴蟲具有殺滅作用，但尚無沙棘果汁的相關(guān)研究，本文旨在研究沙棘果汁對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲的殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沙棘本研究所用的沙棘果實(shí)采摘于新疆伊犁天山峽谷野生沙棘林，經(jīng)鑒定該沙棘種類為中亞沙棘[14]。據(jù)其果實(shí)的成熟程度將其分為成熟組和未成熟組2 組。

1.1.2 陰道毛滴蟲蟲株實(shí)驗(yàn)用蟲株為陰道毛滴蟲臨床分離株，經(jīng)藥敏檢測(cè)為甲硝唑敏感株。

1.1.3 主要儀器和試劑GHP9050 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（OLYMPUS）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone）；小牛血清（四季青）；甲苯胺藍(lán)（上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠）；血球計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)管；臺(tái)式低速離心機(jī)（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；青鏈霉素雙抗（Gibco）。

1.2 方法

1.2.1 沙棘果汁的制備沙棘果實(shí)采摘后經(jīng)挑選，除去破損變質(zhì)的果實(shí)及葉片、果梗等雜質(zhì)，流水沖洗后晾干表面水分，用榨汁機(jī)將其果汁榨出，經(jīng)濾紙過濾，制得沙棘果汁的原汁，保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 陰道毛滴蟲的體外培養(yǎng)將陰道分泌物中分離的蟲株接種至RPMI-1640 培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)，待蟲體密度達(dá)到一定密度時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 蟲體死活的鑒定以甲苯胺藍(lán)染液作為指示劑，在顯微鏡下可觀察到活蟲不被著色，死蟲被染成藍(lán)色。

1.2.4 沙棘果汁作用部位將純的沙棘果汁與陰道毛滴蟲按一定比例混合至果汁終濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%，滴加50 μL混合液與1 μL 5%的甲苯胺藍(lán)染液迅速混勻，鏡下觀察，計(jì)時(shí)，重復(fù)3 次。對(duì)死亡的蟲體進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡觀察從而判斷沙棘果汁作用部位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過GraphPad.Prism（V8，GraphPad Software Inc，Califonia，http://www.graphpad.com）作圖，分析采用F檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度、不同成熟度的沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲體外殺滅效果不論是成熟組的還是未成熟組的沙棘果汁，對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲致死時(shí)間均隨著濃度的升高而降低（見圖1）。成熟組內(nèi)不同濃度的沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲的殺滅時(shí)間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，F(xiàn)=57.73，R2=0.9665），未成熟組內(nèi)對(duì)應(yīng)濃度殺滅陰道毛滴蟲的時(shí)間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，F(xiàn)=163.3，R2=0.9879）；成熟組與未成熟組殺滅陰道毛滴蟲的時(shí)間長(zhǎng)短差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，F(xiàn)=776.9，R2=0.9974）。

圖1 不同濃度不同成熟度的沙棘果汁體外殺滅陰道毛滴蟲的時(shí)間

2.2 沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲作用部位的研究通過對(duì)沙棘果汁作用后的陰道毛滴蟲進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡觀察，電鏡圖像顯示，在陰道毛滴蟲蟲體表面出現(xiàn)大量的孔洞，而內(nèi)部細(xì)胞器、食物泡及細(xì)胞核等的膜則完好無損，這說明沙棘果汁主要是通過破壞蟲體表面細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)外溢引起蟲體的死亡（見圖2）。

圖2 電鏡下的沙棘果汁殺滅的陰道毛滴蟲

3 討論

1837 年人們發(fā)現(xiàn)并命名了陰道毛滴蟲，長(zhǎng)期以來由于這種寄生蟲是單細(xì)胞生物且個(gè)體小不易被檢獲，并且大多數(shù)感染者并不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此導(dǎo)致它對(duì)人類的危害被忽視[15]。雖然1959 年甲硝唑便開始在臨床上用于治療滴蟲病[16]，但WHO 在1990 年才推薦其為治療陰道毛滴蟲病的首選藥物，這種藥物具有使用方便、價(jià)格低廉、療效顯著等特點(diǎn)。然而在1962 年就開始出現(xiàn)臨床治療陰道毛滴蟲失敗的報(bào)道[17]。除此之外，在臨床上使用的藥物還包括奧硝唑、替硝唑等硝唑咪唑類藥物，但因?yàn)? 種藥物均為咪唑類藥物，對(duì)陰道毛滴蟲殺滅機(jī)制及對(duì)人體的毒副作用相似，因此人們一直都在尋找高效低毒的有效藥物以防治滴蟲病。目前已有多種植物及其產(chǎn)物，如植物的根、莖、花、葉的浸出液或提取物等，及人工合成半合成的化合物用于研究殺滅陰道毛滴蟲，包括小檗屬、小葉木屬、毛竹屬、毛竹屬、南竹屬、白屈菜屬、延胡索屬和血根屬[18]等。

沙棘在我國(guó)分布廣泛，不僅起到水土保護(hù)、防治風(fēng)沙的作用，并且沙棘植物本身的食用及醫(yī)用價(jià)值大。沙棘葉、沙棘果、沙棘油等被人們用來治療各種疾病的歷史悠久，在婦科方面沙棘油被用以治療宮頸糜爛，且效果較好，而沙棘籽油栓單用或聯(lián)合其他藥物用以治療滴蟲性陰道炎效果較好[19]，但沙棘油在提煉的過程中因工藝復(fù)雜、成本高，被稱為植物黃金，并且其成分復(fù)雜，分離提純難，因此在目前工藝下沙棘油在臨床上運(yùn)用受到制約。

在本研究中，采用沙棘果汁對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明高濃度的成熟沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲具有明顯的殺滅作用，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道中沙棘果粉對(duì)陰道毛滴蟲具有殺滅作用的定論一致，然而，在其報(bào)道中[12]觀察到死亡的陰道毛滴蟲細(xì)胞碎片，在本研究中并未觀察到陰道毛滴蟲的碎片，并通過對(duì)殺滅的陰道毛滴蟲做掃描電鏡和透射電鏡，圖像顯示陰道毛滴蟲的表面出現(xiàn)了大量的細(xì)胞孔洞，而蟲體內(nèi)部的細(xì)胞器、食物泡、細(xì)胞核等膜結(jié)構(gòu)完整，因此沙棘果汁確實(shí)是通過破壞陰道毛滴蟲蟲體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來殺滅陰道毛滴蟲。通過果粉與果汁2 種不同狀態(tài)的沙棘果實(shí)在體外作用于陰道毛滴蟲，證明果粉效果要優(yōu)于果汁，并且果粉在儲(chǔ)備、運(yùn)輸、貯藏、除菌等方面更優(yōu)于果汁，因此可為未來臨床上防治陰道毛滴蟲提供理論依據(jù)及治療選擇。