王筱雨， 色米熱·艾尼瓦爾， 李士軍

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011；2.新疆維吾爾自治區(qū)莎車(chē)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 喀什 844700）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒，有1個(gè)雙鏈線性DNA基因組[1]。EBV是一種普遍存在的病毒，主要通過(guò)血液和唾液傳播，會(huì)在宿主體內(nèi)引發(fā)潛伏性感染，還可能引起EBV感染相關(guān)疾病，如鼻咽癌、淋巴瘤、傳染性單核細(xì)胞增多癥、EBV相關(guān)的移植后淋巴組織增生性疾病。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EBV的方法主要有EBV特異性抗體檢測(cè)和EBV DNA定量檢測(cè)。血清學(xué)抗體檢測(cè)僅可反映病毒感染情況，而實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）可準(zhǔn)確反映機(jī)體內(nèi)EBV的復(fù)制情況，也是EBV DNA定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。多種臨床樣本均可以用于檢測(cè)EBV DNA載量，如血漿或血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞、全血、鼻咽拭子和組織樣本等[2]。血漿EBV DNA水平可用于疾病診斷和感染活動(dòng)期的評(píng)估，也可用于預(yù)后和治療評(píng)估，對(duì)EBV感染相關(guān)疾病的診斷和治療具有重要意義[3]。血漿EBV DNA檢測(cè)會(huì)受到外來(lái)因素或樣本本身等因素的影響，干擾是實(shí)驗(yàn)室誤差的重要來(lái)源，直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。溶血和脂血是最常見(jiàn)的內(nèi)源性干擾因素，可通過(guò)多種機(jī)制影響EBV DNA檢測(cè)結(jié)果[4-5]。在大多數(shù)情況下，溶血樣本是由采血過(guò)程不順、采血后劇烈搖晃、運(yùn)輸過(guò)程保存不當(dāng)、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后未及時(shí)離心等因素導(dǎo)致的。脂血樣本最常見(jiàn)的分析前因素是餐后或靜脈給藥后立即采血、患者的飲食和身體狀況，以及一些臨床治療使患者體內(nèi)存在較多的脂肪乳劑。本研究旨在探討溶血與脂血是否會(huì)對(duì)PCR法檢測(cè)EBV DNA的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，并分析其可能的原因，以規(guī)范實(shí)驗(yàn)室樣本接收和保存規(guī)則，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室人員正確處理臨床樣本，避免分析前因素造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2020年6月—2021年3月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院無(wú)肉眼可見(jiàn)溶血和脂血的EBV DNA陽(yáng)性樣本40例，隨機(jī)分為2組，每組20例（覆蓋低、中、高水平）。

1.2 方法

（1）模擬溶血樣本制備。將EBV DNA陽(yáng)性樣本（20例）與滅菌蒸餾水按照1∶1比例混合作為對(duì)照樣本。取1例EBV DNA陰性乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本，離心后棄去血漿，用0.9%氯化鈉溶液洗滌紅細(xì)胞數(shù)次，然后加入與棄去的血漿等量的滅菌蒸餾水溶解紅細(xì)胞，使血紅蛋白濃度為121.00 g/L；保留一部分原水平血紅蛋白溶液，將其與滅菌蒸餾水分別按1∶1和1∶3的比例稀釋成另外2個(gè)濃度梯度的血紅蛋白溶液；將20例EBV DNA陽(yáng)性樣本與血紅蛋白溶液進(jìn)行1∶1混合，制備成EBV DNA含量相同而血紅蛋白終濃度分別為60.50、30.25和15.13 g/L的模擬溶血樣本。（2）模擬脂血樣本制備。將EBV DNA陽(yáng)性樣本（20例）與0.9%氯化鈉溶液按照1∶1的比例混合作為對(duì)照樣本。收集不同患者的濃度為12.72 mmol/L且EBV DNA陰性的三酰甘油混合血漿，保留一部分原水平血漿，將其與0.9%氯化鈉溶液分別按2∶1和1∶2的比例稀釋成另外2個(gè)濃度的三酰甘油混合血漿；將20例EBV DNA陽(yáng)性樣本與三酰甘油混合血漿按照1∶1的比例混合，制備成EBV-DNA含量相同而三酰甘油終濃度分別為6.36、4.24、2.12 mmol/L的模擬脂血樣本。采用SLAN-96P實(shí)時(shí)熒光定量RCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）檢測(cè)EBV DNA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模擬溶血樣本EBV DNA PCR檢測(cè)結(jié)果

血紅蛋白濃度為30.25和60.50 g/L時(shí)，EBV DNA陽(yáng)性血漿溶血樣本和對(duì)照樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血紅蛋白濃度為15.13 g/L時(shí)，EBV DNA陽(yáng)性血漿溶血樣本和對(duì)照樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 模擬溶血樣本EBV DNA PCR檢測(cè)結(jié)果 g/L

2.2 模擬脂血樣本EBV DNA PCR檢測(cè)結(jié)果

EBV DNA陽(yáng)性血漿各濃度脂血樣本與對(duì)照樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 模擬脂血樣本EBV DNA PCR檢測(cè)結(jié)果 拷貝/mL

3 討論

PCR技術(shù)是一種快速、可靠的檢測(cè)技術(shù)，但由于患者臨床樣本具有多樣性，如溶血、脂血，可能會(huì)使PCR檢測(cè)結(jié)果受到影響[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，模擬溶血樣本和對(duì)照樣本在血紅蛋白濃度為30.25和60.50 g/L時(shí)，EBV DNA PCR檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而血紅蛋白濃度為15.13 g/L的模擬溶血樣本和對(duì)照樣本PCR檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073），提示溶血對(duì)EBV DNA檢測(cè)結(jié)果有影響，但輕微溶血不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。目前，大多商品化PCR檢測(cè)試劑盒選擇擴(kuò)增的靶序列都是相對(duì)穩(wěn)定的EBV DNA片段，不易受溶血因素的影響，且PCR反應(yīng)體系也有較大的緩沖作用，所以溶血引起的PCR抑制作用不是很明顯。然而，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)臨床樣本溶血程度較嚴(yán)重（血紅蛋白≥30.25 g/L）時(shí)，會(huì)影響EBV DNA的檢測(cè)結(jié)果。原因可能是溶血可導(dǎo)致血紅素及其他代謝產(chǎn)物的殘留，血紅素通過(guò)卟啉環(huán)與Taq酶不可逆結(jié)合，抑制了DNA聚合酶，從而降低了PCR擴(kuò)增效率，導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性結(jié)果[8]。

乳糜微粒增多可引起脂血樣本渾濁，三酰甘油和膽固醇水平可以客觀反映脂血的嚴(yán)重程度。脂血樣本中的混濁和脂蛋白顆粒會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，其原因是血脂會(huì)降低光的透射率，進(jìn)而影響分光光度分析結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，三酰甘油濃度為6.36、4.24 和2.12 mmol/L的模擬脂血樣本和對(duì)照樣本的EBV DNA PCR檢測(cè)結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示樣本中三酰甘油≤6.36 mmol/L時(shí)，不會(huì)明顯抑制PCR反應(yīng)體系中Tap酶的活性和核酸的擴(kuò)增。原因可能是血液中三酰甘油的密度較低，經(jīng)高速離心機(jī)離心后會(huì)漂浮在上層，棄去上清步驟時(shí)可以去除大部分，又經(jīng)過(guò)多次稀釋，其干擾作用幾乎不存在，但三酰甘油在更高濃度時(shí)是否會(huì)對(duì)EBV DNA定量檢測(cè)的結(jié)果產(chǎn)生影響仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，對(duì)于肥胖、高血脂患者的血液樣本，在乳糜不嚴(yán)重的情況下也能得到相對(duì)準(zhǔn)確的EBV DNA檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于較為嚴(yán)重的乳糜樣本，可以采取高速離心、0.9%氯化鈉溶液或血清稀釋、使用脂質(zhì)清除劑等方法降低乳糜程度[9]。若仍未改善，應(yīng)重新采血。

綜上所述，在進(jìn)行EBV DNA定量檢測(cè)時(shí)，應(yīng)盡量保證采血過(guò)程的順利，避免餐后或靜脈給藥后立即采血，保證血液樣本運(yùn)輸條件，血液樣本運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)盡快檢測(cè)，避免放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致溶血；若不能立刻檢測(cè)，應(yīng)于4℃冰箱冷藏保存樣本。如果樣本出現(xiàn)溶血、嚴(yán)重脂血等現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)按不合格樣本處理，通知臨床重新采血，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。