李紅星 周學(xué)斌 張信岳 谷麗麗 魯佳琪 李欽

(杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310013)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見且嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病率與年齡高度相關(guān)。以記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的AD在影響病患生活質(zhì)量的同時(shí)，也給各國的公共醫(yī)療帶來了沉重的負(fù)擔(dān)〔1〕。AD病因與機(jī)制報(bào)道不一，科學(xué)界目前尚未有定論。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)迄今僅批準(zhǔn)了5個(gè)用于改善AD癥狀的藥物，包括4個(gè)乙酰膽堿酯酶抑制劑和1個(gè)N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑〔2〕。因此，系統(tǒng)闡明AD的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)安全有效的抗AD藥物成為當(dāng)下亟待解決的科研難題。

基于AD的多假說發(fā)病機(jī)制，體外復(fù)合模型能更全面地再現(xiàn)AD的病理特征，從而能更全面深入地篩選具有抗AD效果的神經(jīng)保護(hù)劑。如Wei等〔3〕和魏恒云〔4〕曾將Aβ25～35和D-gal聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立AD體外復(fù)合模型。Buendia等〔5〕曾將Aβ25～35和OA聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷建立AD體外復(fù)合模型。然而現(xiàn)有研究表明，AD體外復(fù)合模型并未廣泛應(yīng)用。衰老是晚發(fā)性AD的病理基礎(chǔ)之一〔6〕，基于衰老的AD體外模型可以更好地模擬其病理分子層面的變化。本研究在D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了體外復(fù)合模型的構(gòu)建與初步比較。將D-gal分別與麥芽酚鋁(Al(mal)3)、過氧化氫(H2O2)、岡田酸(OA)、谷氨酸(L-glu)和Aβ1～42聯(lián)用，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，從細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡3個(gè)方面，確定AD體外復(fù)合模型構(gòu)建的可能性與相關(guān)構(gòu)建方法，為今后更深入的研究提供理論支持與參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 高分化大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心(中國北京)。

1.2試劑 MTT、人Aβ1～42、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，D-gal購自Sigma，OA購自上海源葉生物科技有限公司，L-glu購自Solarbio，六水氯化鋁(AlCl3·6H2O)、麥芽酚均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，H2O2溶液購自廣東恒健制藥有限公司，總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒與丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 NU-5510E細(xì)胞培養(yǎng)箱(Nuaire)；CJ-2F醫(yī)用凈化工作臺(蘇州市金燕凈化設(shè)備工程有限公司)；DMI3000B 倒置熒光顯微鏡(Leica)；CytationTM1全自動細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)(BIO-TEK)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) PC12培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基〔含10%胎牛血清(FBS)和1%青鏈霉素〕中。細(xì)胞于5% CO2，37℃條件培養(yǎng)，相對濕度為90%。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行傳代和實(shí)驗(yàn)。

1.5MTT實(shí)驗(yàn)篩選不同模型誘導(dǎo)劑造模濃度 分別設(shè)置溶劑對照組、空白對照組和模型誘導(dǎo)組，每組6個(gè)復(fù)孔。按照8×104個(gè)/孔將細(xì)胞消化后接種，溶劑對照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。各組棄上清，溶劑對照組和空白對照組每孔加入100 μl完全培養(yǎng)基，模型誘導(dǎo)組每孔加入100 μl不同梯度誘導(dǎo)液，孵育24 h后棄上清，加入20 μl MTT溶液，孵育4 h棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO) 100 μl振蕩10 min，490 nm波長下測定OD值。細(xì)胞存活率(%)=(OD模型誘導(dǎo)組-OD溶劑對照組)/(OD空白對照組-OD溶劑對照組)×100%。

1.6MTT實(shí)驗(yàn)比較復(fù)合模型細(xì)胞損傷情況 分別設(shè)置溶劑對照組、空白對照組、D-gal誘導(dǎo)組、D-gal+Al(mal)3誘導(dǎo)組、D-gal+H2O2誘導(dǎo)組、D-gal+OA誘導(dǎo)組、D-gal+L-glu誘導(dǎo)組和D-gal+Aβ1～42誘導(dǎo)組。后續(xù)操作同“1.5”。

1.7一般形態(tài)學(xué)比較 分別設(shè)置空白對照組、D-gal誘導(dǎo)組、D-gal+Al(mal)3誘導(dǎo)組、D-gal+H2O2誘導(dǎo)組、D-gal+OA誘導(dǎo)組、D-gal+L-glu誘導(dǎo)組和D-gal+Aβ1～42誘導(dǎo)組。其中，各誘導(dǎo)劑濃度分別為，D-gal：120 mmol/L、Al(mal)3：800 μmol/L、H2O2：400 μmol/L、OA：160 nmol/L、L-glu：20 mmol/L、Aβ1～42：20 μmol/L。將對數(shù)生長期PC12細(xì)胞消化后接種，待細(xì)胞貼壁后，在對應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑下孵育24 h，從培養(yǎng)箱中取出，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.8氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理同“1.7”。各組棄去上清，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，加入250 μl胰酶消化液，培養(yǎng)箱作用1 min，棄去，每孔加入500 μl裂解液〔0.5%聚乙二醇單辛基苯基醚(曲拉通100，Triton-X 100)+PBS〕，吹打收集于離心管，冰水中超聲10 min。按照說明書檢測各組T-SOD活力與MDA含量。

1.9Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理同“1.7”。各組加入等量Hoechst 33342染色液(1×)，輕柔混勻，于培養(yǎng)箱中孵育10 min。棄去上清，PBS清洗3遍，采用全自動細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)進(jìn)行成像觀察。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同模型誘導(dǎo)劑造模濃度篩選 D-gal 0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mmol/L細(xì)胞存活率分別為：(100.0±1.4)%、(100.6±3.8)%、(100.4±5.8)%、(104.3±6.8)%、(101.3±11.9)%、(94.4±12.2)%、(90.1±9.5)%、(67.4±3.1)%、(50.5±1.3)%；Al(mal)3 0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0 μmol/L細(xì)胞存活率分別為(100.0±4.7)%、(96.5±6.4)%、(96.9±13.5)%、(96.0±11.6)%、(97.8±11.4)%、(91.0±8.0)%、(90.1±10.2)%、(74.0±5.5)%、(54.6±4.2)%；H2O20.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0 nmol/L細(xì)胞存活率分別為(100.0±1.5)%、(104.5±4.5)%、(101.6±3.2)%、(106.4±5.8)%、(105.7±6.4)%、(105.3±5.6)%、(106.9±4.6)%、(72.8±2.5)%、(21.8±2.0)%；OA 0、5、10、20、40、80、160、320 nmol/L細(xì)胞存活率分別為(100.0±6.1)%、(107.5±6.3)%、(110.0±2.4)%、(111.6±6.9)%、(110.9±5.2)%、(113.6±6.1)%、(89.9±4.2)%、(59.9±4.1)%；L-glu 0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mmol/L細(xì)胞存活率分別為(100.0±4.0)%、(102.5±2.1)%、(93.7±6.0)%、(94.4±4.5)%、(85.9±5.5)%、(81.9±3.4)%、(74.5±2.8)%、(3.3±3.3)%；Aβ1～420.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L細(xì)胞存活率分別為(100.0±4.9)%、(97.3±2.8)%、(98.9±6.2)%、(100.4±4.1)%、(92.9±6.2)%、(79.5±3.9)%。綜合后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇120 mmol/L的D-gal、800 μmol/L Al(mal)3、400 μmol/L的H2O2、160 nmol/L的OA、20 mmol/L的L-glu和20 μmol/L的Aβ1～42進(jìn)行后續(xù)復(fù)合模型構(gòu)建。

2.2復(fù)合模型細(xì)胞損傷情況比較 與空白對照組相比，D-gal組及D-gal與其他誘導(dǎo)劑聯(lián)用時(shí)，細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.01)，表明PC12細(xì)胞受到損傷。與D-gal組細(xì)胞存活率相比，D-gal+Al(mal)3組與D-gal+OA組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，表明細(xì)胞損傷程度加劇。其余組細(xì)胞存活率與單純使用D-gal時(shí)相當(dāng)。見表1。

2.3一般形態(tài)學(xué)比較 由圖1可知，各組細(xì)胞形態(tài)較空白對照組均不同程度地變圓。與D-gal組相比，D-gal+Al(mal)3組和D-gal+H2O2組細(xì)胞間隙增大，變圓細(xì)胞比例增加。D-gal+OA組細(xì)胞突觸消失，胞體顯著變圓，同時(shí)少量胞體萎縮且形狀不規(guī)則，表明細(xì)胞損傷程度加劇。D-gal+L-glu組和D-gal+Aβ1～42組較D-gal組無顯著區(qū)別。

2.4氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與空白對照組和D-gal組相比，D-gal+OA組MDA含量明顯升高(P<0.01，P<0.05)。D-gal+Al(mal)3組、D-gal+H2O2組和D-gal+OA組T-SOD活力較空白對照組和D-gal組均顯著降低(P<0.01)。見表1。表明D-gal與三者的分別聯(lián)用可加劇細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

2.5細(xì)胞凋亡情況比較 由圖2可知，與空白對照組相比，D-gal組部分細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，表明細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡。與D-gal組相比，各聯(lián)合誘導(dǎo)組出現(xiàn)不同程度的藍(lán)色熒光表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞核致密濃染水平明顯升高。其中，D-gal+H2O2組和D-gal+OA組核染數(shù)目明顯減少，表明細(xì)胞凋亡比例增加。此外，D-gal+OA組細(xì)胞核部分可見碎塊化致密濃染，表明細(xì)胞凋亡水平進(jìn)一步升高。

表1 AD體外復(fù)合模型細(xì)胞存活率及MDA含量和T-SOD活力比較

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較(×10)

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況(DAPI，×10)

3 討 論

AD體外研究中，兩種造模劑聯(lián)合應(yīng)用，能更好地模擬出AD的相關(guān)特征。衰老是一種與年齡高度相關(guān)的生理功能衰退過程，也是晚發(fā)性AD的主要危險(xiǎn)因素之一〔7〕。D-gal作為一種衰老誘導(dǎo)劑，在AD體內(nèi)模型構(gòu)建中廣泛應(yīng)用，但在體外建模的相關(guān)研究中報(bào)道較少。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外Aβ寡聚體和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)會導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元變性和突觸功能障礙，推動AD發(fā)生發(fā)展進(jìn)程〔8，9〕。因此，研究人員通常在體外采用某些誘導(dǎo)劑作用于神經(jīng)細(xì)胞來模擬AD的病理特征。通過分析細(xì)胞損傷情況和觀察形態(tài)特征來反映模型的最終構(gòu)建情況。本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-gal+Al(mal)3組與D-gal+OA組細(xì)胞損傷程度加劇。鏡下形態(tài)觀察可見，D-gal+Al(mal)3組和D-gal+H2O2組細(xì)胞損傷程度進(jìn)一步升高。

研究表明，氧化應(yīng)激與AD密切相關(guān)，如在AD患者和AD動物的腦中都檢測到了誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的活性氧(ROS)水平升高〔10，11〕。因此，氧化應(yīng)激水平也是AD模型構(gòu)建過程中需要進(jìn)行考察的一個(gè)方面。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D-gal+Al(mal)3組、D-gal+H2O2組和D-gal+OA組細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。

神經(jīng)元凋亡和隨之發(fā)生的神經(jīng)受損是AD患者出現(xiàn)認(rèn)知與記憶功能障礙的主要原因之一〔12〕。通過分析神經(jīng)元凋亡水平可以間接反映AD病理損傷程度。本研究中，細(xì)胞凋亡染色結(jié)果表明，各組誘導(dǎo)組細(xì)胞核均出現(xiàn)不同程度地致密濃染，表明各組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度地凋亡，其中D-gal+OA組細(xì)胞可見碎塊化致密濃染，表明細(xì)胞凋亡程度與其他組相比進(jìn)一步加劇。

綜上，D-gal與Al(mal)3、H2O2或OA分別聯(lián)用可以加劇細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡程度，相比于單一的AD體外損傷模型更具優(yōu)勢。這將為相關(guān)研究者在AD機(jī)制研究和抗AD藥物初步篩選研究上提供更多的模型選擇，也為更深入系統(tǒng)的研究AD體外復(fù)合模型提供了理論依據(jù)和支持。