王艷培(樂(lè)普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司，北京 102200)

0 引言

冠心病是當(dāng)前一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的疾病類(lèi)型。當(dāng)前在我國(guó)本病的患病率、死亡率均在不斷升高，針對(duì)本病的治療方法及效果受到人們的關(guān)注和重視[1]。自1977年起，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形手術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)在冠脈支架狹窄疾病治療中得到應(yīng)用。當(dāng)前已相繼對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了3次技術(shù)革命，主要為裸金屬支架、藥物洗脫支架以及生物可吸收支架。裸金屬支架和藥物洗脫支架的主要區(qū)別是藥物洗脫支架是在裸支架的表面涂上特殊的藥物涂層支架[2]。植入到血管里后支架上藥物涂層能控制藥物緩慢釋放，進(jìn)而阻止瘢痕組織過(guò)度增生。與傳統(tǒng)金屬裸支架相比，藥物洗脫支架可以減少支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。目前，藥物洗脫支架主要以紫杉醇和雷帕霉素作為主要藥物成分。涂層技術(shù)類(lèi)型有聚合物載體支架、單面刻槽技術(shù)、全降解涂層及無(wú)聚合物載體支架。在血管內(nèi)藥物洗脫支架藥物涂層研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，為解決藥物洗脫支架藥物涂層控釋和涂層牢固度等性能時(shí)，需要使用多種有機(jī)溶劑對(duì)聚合物涂層和藥物進(jìn)行優(yōu)化。公司某款藥物洗脫支架在進(jìn)行噴涂過(guò)程中需應(yīng)用溶劑丙酮和乙酸乙酯分別對(duì)聚合物涂層和藥物涂層進(jìn)行噴涂工藝。為減少藥物涂層中殘留溶劑對(duì)人體損害，該藥物洗脫支架必須建立殘留溶劑分析方法，以對(duì)支架的丙酮和乙酸乙酯進(jìn)行檢測(cè)，確保藥物洗脫支架中殘留溶劑符合標(biāo)準(zhǔn)要求[3]。本文主要以通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立藥物洗脫支架中殘留溶劑分析方法及對(duì)藥物洗脫支架中丙酮和乙酸乙酯殘留量進(jìn)行檢測(cè)分析。

儀器和設(shè)備：安捷倫7890A氣相色譜儀，配置氫火焰離子化檢測(cè)器(安捷倫科技有限公司)，Auto-HS頂空進(jìn)樣器(成都科林科技有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多公司)，渦旋混合振蕩器(IKA公司)，丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Accustandard，純度99.5%，1 mL，Gilson5.0 mL移液槍?zhuān)簖?.0 mL移液槍?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 實(shí)驗(yàn)條件

HP-INNOWAX 色譜柱 (30 m×320 μm×0.5 μm)；柱溫 (采用程序升溫)：25 ℃ (2 min)—30 ℃/min—100 ℃(2 min)；進(jìn)樣口溫度：150 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃；氮?dú)猓?8.2 mL/min；氫氣：40 mL/min；空氣流量為 400 mL/min；分流比：20∶1；柱流速：1.2 mL/min；頂空平衡溫度：80 ℃；平衡時(shí)間：30 min。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

取外部干燥的50 mL容量瓶，加入約20 mL去離子水，加瓶塞，精確稱(chēng)重。分別精確稱(chēng)取50 mg丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，每次稱(chēng)量完畢都輕輕搖勻溶液，蓋好瓶塞進(jìn)行稱(chēng)重。前后兩次稱(chēng)重之差為溶液中含丙酮和乙酸乙酯的質(zhì)量。加水至容量瓶的刻度容量線處，蓋好瓶塞，搖勻即配制成丙酮和乙酸乙酯濃度分別為962 μg/mL和1 069 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 樣品的制備

稱(chēng)取噴涂后的藥物洗脫支架0.10 g，中間剪碎，轉(zhuǎn)移并置于頂空瓶中，用移液槍精密加入2 mL去離子水，用頂空瓶蓋壓緊密封，備用。

1.4 丙酮和乙酸乙酯殘留量的計(jì)算

藥物洗脫支架中丙酮和乙酸乙酯殘留量的計(jì)算方法按照外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算。

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果

由于丙酮和乙酸乙酯均具有較低的沸點(diǎn)，色譜柱對(duì)兩種溶劑保留差異不大。通過(guò)調(diào)節(jié)降低進(jìn)樣口溫度和較低柱溫的程序升溫提高丙酮和乙酸乙酯的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)按照1.1所述的實(shí)驗(yàn)條件丙酮和乙酸乙酯能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。丙酮和乙酸乙酯之間的分離度大于1.5。

取去離子水2 mL于頂空瓶中，加蓋密封，進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)；取未噴涂藥物涂層的藥物洗脫支架按照1.3制備，加2 mL去離子水，加蓋密封，進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)；取丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)混合溶液一份，2 mL于頂空瓶中，加蓋密封，進(jìn)行專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)，按照1.1所述的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)試，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)在丙酮和乙酸乙酯色譜峰處均無(wú)干擾，丙酮和乙酸乙酯兩種組分分離良好。丙酮保留時(shí)間為3.54 min，乙酸乙酯的保留時(shí)間為4.46 min。色譜圖如圖1所示。

圖1 丙酮和乙酸乙酯專(zhuān)屬性色譜圖

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按照2.1中的方法丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)混合溶液濃度制備6份標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取2 mL于頂空瓶中，頂空瓶蓋壓緊密封。按照1.1所述的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，丙酮和乙酸乙酯拖尾因子均小于1，丙酮理論塔板數(shù)大于28 000，乙酸乙酯理論塔板數(shù)大于36 000，丙酮和乙酸乙酯分離度大于10。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性范圍

取丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別制備一系列不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中丙酮和乙酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度均依次為 50、100、200、500、1 000 μg/mL。

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液2 mL于頂空瓶中，加蓋密封。按1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別記錄丙酮和乙酸乙酯的峰面積，按照濃度-峰面積繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，丙酮和乙酸乙酯線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。

表2 丙酮和乙酸乙酯線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 精密度試驗(yàn)

根據(jù)2.2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別記錄丙酮和乙酸乙酯色譜峰面積，分別計(jì)算丙酮和乙酸乙酯的精密度。丙酮和乙酸乙酯RSD分別為1.50%和1.66%(n=6)。丙酮和乙酸乙酯精密度檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 丙酮和乙酸乙酯精密度檢測(cè)結(jié)果

2.5 檢測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ)實(shí)驗(yàn)

取2.3項(xiàng)中丙酮與乙酸乙酯濃度為50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不斷稀釋?zhuān)钡奖鸵宜嵋阴サ臋z測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ)試驗(yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)分別為：在丙酮和乙酸乙酯的LOD溶液的色譜圖中，主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比約為3 (且應(yīng)不得小于3)；在丙酮和乙酸乙酯的LOQ溶液的色譜圖中，主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比約為10 (且應(yīng)不得小于10)。丙酮與乙酸乙酯檢測(cè)限和定量限結(jié)果如表4所示。

表4 丙酮和乙酸乙酯檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取已知丙酮和乙酸乙酯殘留量的藥物洗脫支架0.10 g，共9份置于頂空瓶中，分別加入相當(dāng)于藥物洗脫支架上丙酮乙酸乙酯殘留量的80%、100%和120%各3份的丙酮和乙酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水補(bǔ)充至2 mL。按1.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按照1.4的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。丙酮80%、100%和120%三個(gè)濃度平均回收率分別是：95.64%、96.95% 和 99.35%，RSD=1.97%；乙酸乙酯80%、100%和120%三個(gè)濃度平均回收率分別是：93.97%、97.80% 和98.37%，RSD=2.45%。

2.7 樣品測(cè)定

取完成噴涂后的藥物洗脫支架樣品，即刻密封于樣品瓶中。按1.3項(xiàng)樣品制備方法進(jìn)行制備3份樣品供試品，按照1.1項(xiàng)的色譜實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，按照1.4項(xiàng)的計(jì)算方法計(jì)算丙酮和乙酸乙酯殘留量，結(jié)果顯示丙酮平均殘留量為1 273.5 μg/g，乙酸乙酯平均殘留量為 2 358.1 μg/g。

3 總結(jié)

3.1 方法建立

本文建立了同時(shí)檢測(cè)藥物洗脫支架中丙酮和乙酸乙酯兩種低沸點(diǎn)、揮發(fā)性溶劑的方法。丙酮和乙酸乙酯均含有不飽和基團(tuán)，在低波長(zhǎng)有紫外吸收，但由于分子量小，很難在液相色譜上保留，液相色譜難以檢測(cè)?！吨袊?guó)藥典》通則溶劑殘留測(cè)定法對(duì)丙酮和乙酸乙酯有指導(dǎo)方法，應(yīng)該優(yōu)先選擇氣相色譜法。丙酮沸點(diǎn)56.5 ℃，乙酸乙酯沸點(diǎn)77.2 ℃，如果采取氣相直接進(jìn)樣的方法，沸點(diǎn)接近較難分離，且進(jìn)樣溶液的溶劑，難以選擇、易對(duì)兩種組分干擾，影響檢測(cè)結(jié)果。采取柱溫程序升溫、降低進(jìn)樣口溫度，可以有效增強(qiáng)兩種組分在色譜上的保留，增加分離效果。采取頂空進(jìn)樣法，去離子水作為浸提溶劑，浸提充分，且氫火焰離子化檢測(cè)器對(duì)水沒(méi)有響應(yīng)，有效避免了溶劑對(duì)組分的干擾，增加了殘留溶劑檢測(cè)的專(zhuān)屬性。

3.2 方法線性范圍

本文中建立丙酮和乙酸乙酯殘留量的檢測(cè)方法在很寬的范圍內(nèi)都具有良好的線性。丙酮線性范圍為48.1～962.3 μg/mL，乙酸乙酯線性范圍為53.5～1 069.2 μg/mL，可以保證檢測(cè)因?yàn)楣に嚥▌?dòng)引起溶劑殘留量的變化。實(shí)際藥物洗脫支架在經(jīng)過(guò)噴涂、預(yù)裝、包裝、滅菌和解析等生產(chǎn)過(guò)程中，丙酮和乙酸乙酯檢測(cè)濃度很少達(dá)到500 μg/mL。后續(xù)應(yīng)對(duì)方法線性范圍進(jìn)行優(yōu)化，縮小殘留溶劑方法線性范圍，增加殘留溶劑檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。

3.3 樣品檢測(cè)

本文中樣品檢測(cè)為藥物洗脫支架完成噴涂藥物涂層工藝后，即刻將樣品密封于樣品瓶中。檢測(cè)結(jié)果顯示丙酮?dú)埩袅繛?1 273.5 μg/g，乙酸乙酯為 2 358.1 μg/g。該產(chǎn)品成品技術(shù)要求規(guī)定的丙酮要求為500 μg/g，乙酸乙酯為5 000 μg/g。即藥物涂層即刻噴涂完成后丙酮?dú)埩袅坎环弦?，而乙酸乙酯符合要求。?shí)際該產(chǎn)品在藥物涂層噴涂工藝驗(yàn)證過(guò)程中，噴涂后的支架放置一定時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)，丙酮和乙酸乙酯殘留量合格后完成噴涂驗(yàn)證工藝工作。后續(xù)的研究中應(yīng)建立該產(chǎn)品丙酮和乙酸乙酯殘留量釋放曲線，根據(jù)驗(yàn)證釋放曲線，確定丙酮和乙酸乙酯殘留量合格的釋放天數(shù)，減少?lài)娡亢蟮臋z驗(yàn)工作，確定優(yōu)化該產(chǎn)品的噴涂工藝驗(yàn)證方案。

4 結(jié)語(yǔ)

目前藥物洗脫支架在冠心病PTCA手術(shù)治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，臨床上有建立支架中殘留溶劑分析方法，對(duì)丙酮和乙酸乙酯含量進(jìn)行檢測(cè)的要求[4]。本文中建立并考察了生物支架中殘留溶劑分析方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物洗脫支架丙酮和乙酸乙酯殘留量測(cè)定方法的準(zhǔn)確性高、可靠性好且具有較好的重復(fù)性，其系統(tǒng)適應(yīng)性、專(zhuān)屬性、LOQ、LOD、線性、精密度和準(zhǔn)確度等實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定要求。故研究認(rèn)為，本方法可作為藥物洗脫支架的丙酮和乙酸乙酯殘留量的一項(xiàng)準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法。同時(shí)，研究中也發(fā)現(xiàn)一些不足之處，包括噴涂溶劑發(fā)生改變時(shí)需再驗(yàn)證，殘留溶劑的釋放曲線需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以及方法線性范圍需要優(yōu)化。在后續(xù)研究中，仍需藥物洗脫支架中殘留溶劑的分析方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。