王 旭，胡 鑫，胡志剛，劉義飛，劉 迪，陳士林，張景景＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

野菊花為常用中藥材，應(yīng)用歷史悠久，2020 年版《中國藥典》收載的野菊花藥材為菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、瀉火平肝的功效，臨床常用于疔瘡癰腫，目赤腫痛，頭痛眩暈等癥[1]。野菊花用途廣泛，臨床和民間應(yīng)用均較多，其水提物和揮發(fā)油是多種醫(yī)藥產(chǎn)品、日化產(chǎn)品、保健產(chǎn)品等的原料，具良好開發(fā)及應(yīng)用前景。野菊資源豐富，在全國多個(gè)省份均廣泛分布，其生長環(huán)境差異顯著[2]，導(dǎo)致野菊花藥材品質(zhì)參差不齊。中藥品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響其臨床療效及用藥安全，而中藥具有成分復(fù)雜、功效多樣、臨床應(yīng)用配伍靈活等特點(diǎn)，構(gòu)建其質(zhì)量評價(jià)體系成為制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的一大難題[3-4]。各版《中國藥典》僅將蒙花苷這一單成分作為野菊花藥材的評價(jià)指標(biāo)，基于測定單一化學(xué)成分的量來進(jìn)行野菊花藥材的質(zhì)量評價(jià)，較難全面、真實(shí)反映其品質(zhì)，難以解決野菊花藥材質(zhì)量“良莠不齊”的問題，也將進(jìn)一步阻礙優(yōu)良野菊新品種選育工作。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-marker）是中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念，具有“存在性”“傳遞與溯源性”“特有性”“可測性”和中醫(yī)藥理論“物質(zhì)功效關(guān)聯(lián)性”等“五原則”[5]，指的是與中藥的功能屬性密切相關(guān)的指示性物質(zhì)，自2016 年提出后至今一直倍受關(guān)注[6]。Q-marker 以中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為主線，明確中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分的關(guān)聯(lián)關(guān)系。此外，鑒于利用外標(biāo)法對中藥多成分同時(shí)檢測時(shí)，要求高純度標(biāo)準(zhǔn)品，且成本昂貴，王智民等[7-8]基于各化學(xué)成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，進(jìn)行“一測多 評 ”（quantitative analysis of multi-components by single-maker，QAMS）研究，實(shí)現(xiàn)使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)定量多個(gè)指標(biāo)成分，該方法在中藥材多指標(biāo)成分含量測定中得到廣泛應(yīng)用[9-12]。

本研究構(gòu)建適用于野菊花品質(zhì)評價(jià)的HPLC 指紋圖譜體系，對全國12 個(gè)省份共31 個(gè)居群的野菊花種質(zhì)資源開展品質(zhì)評價(jià)，基于野菊花化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展，結(jié)合Q-marker“五原則”綜合分析、預(yù)測野菊花的Q-marker 候選化合物，并利用預(yù)測的野菊花Q-marker 成分進(jìn)行QAMS 研究，以期為野菊花藥材質(zhì)量評價(jià)及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試劑和藥品

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，Shimadzu LC-20AD 型高效液相色譜儀，優(yōu)普UPT-11-20T型超純水機(jī)，凈信 JXFSTPRP-24 型球磨儀，聲彥 SCQ-5201C 型超聲波清洗器，梅特勒-托利多MS105/A 型十萬分之一電子分析天平，金思達(dá)YS-02 型1.8L 玻璃煎藥壺，億通HY-5型旋轉(zhuǎn)振蕩器。

1.2 試劑

綠原酸（批號：18071907）、咖啡酸（批號：20110501）、蘆?。ㄅ枺?1010804）、木犀草苷（批號：20060301）、異綠原酸B（批號：21012902）、異綠原酸A（批號：21012504）、大波斯菊苷（批號：19010203）、異綠原酸C（批號：21011101）、香葉木素苷（批號：19121602）、黃芩苷（批號：18041002）、蒙花苷（批號：18092812）、田薊苷（批號：19022004）、香葉木素（批號：19053103）、金合歡素（批號：19061702）對照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；芹菜素（批號：T04S8F43072）、木犀草素（批號：C29N10Q104574）對照品購自上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)HPLC-UV峰面積歸一化法測得其純度均＞98%。甲醇、乙腈為色譜純，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

野菊花樣品采自湖北中醫(yī)藥大學(xué)野菊種質(zhì)資源圃，樣本來源于甘肅、陜西、四川、重慶、貴州、湖南、湖北、河南、安徽、江蘇、江西、浙江等12 個(gè)省份共31 個(gè)居群（表1），所有植株種植于湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，于花初開時(shí)采收，蒸汽殺青后，60℃烘干。此外，采集了菊屬植物菊（小亳菊、懷白菊、懷黃菊、杭菊、滁菊）、異色菊、小紅菊、委陵菊、菊花腦和亞菊屬磯菊的花器官樣品，并購買了野菊花主產(chǎn)區(qū)的20批符合2020版《中國藥典》質(zhì)量要求的野菊花藥材樣品S1-S20（表1）。所有樣品經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)胡志剛教授鑒定，其基原準(zhǔn)確。

表1 野菊花藥材及其他菊花類樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

精確稱取樣品粉末0.5000 g 置50 mL 錐形瓶中，精密稱定，加80%甲醇25 mL，稱重，超聲60 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，靜置，放冷，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取16 種對照品適量，移液器精密加80%甲醇溶解，配制成綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、香葉木素苷、黃芩苷、蒙花苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素、金合歡素濃度分別為1.65、0.11、0.20、0.63、1.08、2.14、0.83、1.27、0.21、0.54、1.87、0.27、1.03、0.59、0.16、0.24 mg/mL的對照品溶液；另吸取等量對照品溶液，混勻，配置成混合對照品溶液。

2.3 野菊花標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

稱取野菊花飲片100 g，使用1.8 L 玻璃煎藥壺，煎煮2 次，一煎加水1200 mL，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min，120 目篩網(wǎng)趁熱過濾；二煎加水1000 mL，武火煮沸，文火保持微沸15 min，120 目篩網(wǎng)趁熱過濾，合并2 次煎液，置冷水浴中迅速冷卻，55℃真空減壓濃縮至約500 mL 濃縮液，即得野菊花標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.4 HPLC色譜條件

色譜條件：Welch Ultimate XB-C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測波長326 nm，流動相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0-8 min，16% B；8-13 min，16% - 20% B；13-30 min，20% B；30-35 min，20%-25%B；35-60 min，25%-30%B；60-70 min，30-60% B；70-80 min，60% B），流速 0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按蒙花苷峰計(jì)不低于3000，各組分分離度良好，陰性無干擾，得各色譜峰分離圖（圖1）。

圖1 野菊花藥材HPLC色譜圖

2.5 HPLC方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2 項(xiàng)下各對照品溶液適量，加80%甲醇稀釋2 倍并連續(xù)稀釋6 次，得系列對照品溶液，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸（表2）。

表2 16個(gè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密稱取CQJF-4 樣本適量，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定含量，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，并計(jì)算綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、香葉木素苷、黃芩苷、蒙花苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素及金合歡素的RSD 分別為0.88%、0.71%、0.75%、0.93%、0.62%、1.12%、0.79%、0.81%、1.23%、1.14%、0.89%、0.97%、1.04%、1.19%、0.86% 和0.93%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取CQJF-4 同一樣本6 份，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定含量，并計(jì)算綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、香葉木素苷、黃芩苷、蒙花苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素及金合歡素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.01%、0.10%、0.04%、0.29%、0.20%、0.67%、0.11%、0.84%、0.11%、0.08%、0.11%、0.08%、0.76%、0.41%、0.01%和0.03%；RSD 分別 為 0.77%、0.95%、0.83%、1.04%、0.85%、0.91%、0.73%、0.89%、1.07%、0.86%、1.14%、0.93%、0.74%、0.73%、0.99%和1.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取CQJF-4 樣本適量，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定含量，分別于配制后0、3、6、9、12、24 h 測定各色譜峰峰面積，并計(jì)算綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、香葉木素苷、黃芩苷、蒙花苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素及金合歡素的RSD 分別為 0.91%、1.03%、0.71%、1.37%、0.94%、0.81%、1.04%、0.96%、0.86%、0.97%、0.83%、1.45%、1.12%、0.98%、1.08% 和1.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn)

取已知各指標(biāo)成分含量的CQJF-4樣本樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，按1:1 比例精密加入各對照品，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定含量，并計(jì)算綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、香葉木素苷、黃芩苷、蒙花苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素及金合歡素的平均回收率依次為99.51%、98.37%、 103.68%、 101.39%、 99.65%、 101.28%、97.71%、 100.28%、 101.59%、 102.63%、 98.74%、97.66%、96.48%、101.92%、103.85%和99.63%；RSD 分別 為 1.31%、0.84%、2.22%、1.08%、0.97%、1.94%、0.96%、1.24%、1.88%、1.27%、1.04%、1.37%、1.08%、1.21%、1.89%和0.88%，表明該方法回收率良好。

2.6 野菊花Q-marker的預(yù)測

2.6.1 基于物質(zhì)存在性的野菊花Q-marker預(yù)測

物質(zhì)存在性是Q-marker 的基本條件之一，即Q-marker 是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)[6]。中藥的臨床應(yīng)用形式多以入湯劑煎服，按照劉昌孝等提出的Q-marker的確定與研究方法[6]，中藥Q-marker 的預(yù)測應(yīng)從中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的物質(zhì)成分入手。

野菊花作為花類藥材，其藥材和飲片雖商品屬性不同，但臨床使用的藥物本質(zhì)是一致的，均為菊科植物野菊C. indicumL.的干燥頭狀花序[1]。野菊花湯劑多用水煎煮而得，臨床藥效成分應(yīng)多為水溶性成分[13]，郭杰[14]和田偉[15]等人構(gòu)建了野菊花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC 指紋圖譜，分別得到9 個(gè)和12 個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中7 個(gè)峰為酚酸類成分，分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，2個(gè)峰為黃酮類成分木樨草苷和蒙花苷。由此可知野菊花湯劑中的主要化學(xué)成分以黃酮類、酚酸類成分為主。

本研究根據(jù)中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略[16]，制備了20 批次符合2020 版《中國藥典》質(zhì)量要求的市售野菊花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，生成野菊花標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜，經(jīng)文獻(xiàn)查閱和與對照品HPLC 色譜圖比對，共指認(rèn)出其中9個(gè)主要化學(xué)物質(zhì)，分別為：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸和蒙花苷。但對于中成藥產(chǎn)業(yè)，由于其工藝過程增加了不少現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)元素和技術(shù)，很多產(chǎn)品不是以湯劑為基礎(chǔ)制備[6]，本研究以野菊花80%甲醇提取物構(gòu)建其HPLC 指紋圖譜體系，指認(rèn)出其中16 個(gè)化合物：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、香葉木素苷、黃芩苷、蒙花苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素和金合歡素。

基于物質(zhì)存在性原則，綜合文獻(xiàn)檢索和自建野菊花HPLC 指紋圖譜的指認(rèn)結(jié)果，野菊花Q-marker 可優(yōu)先選擇野菊花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的11 種成分：新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，咖啡酸，蘆丁，木犀草苷，大波斯菊苷，蒙花苷；野菊花藥材HPLC 指紋圖譜中的另外7 種黃酮類化合物香葉木素苷、黃芩苷、木犀草素、田薊苷、芹菜素、香葉木素及金合歡素，文獻(xiàn)查閱得到的洋薊素[18]、槲皮素[17]等化學(xué)物質(zhì)可作為補(bǔ)充。

2.6.2 基于傳遞與溯源性原則的野菊花Q-marker 預(yù)測

中藥發(fā)揮療效，通常需經(jīng)煎煮、口服、入血、分布、代謝等生物途徑后才能產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。從質(zhì)量傳遞與溯源的角度出發(fā)，能被人體吸收并進(jìn)入血液發(fā)揮藥效是質(zhì)量傳遞體系的最終環(huán)節(jié)，也是中藥質(zhì)量標(biāo)志物Q-marker 確定的重要依據(jù)[19]?；谫|(zhì)量傳遞與溯源原則預(yù)測野菊花Q-marker 可借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫[20]，結(jié)合2.6.1 項(xiàng)下預(yù)測的野菊花Q-marker候選化合物，檢索野菊花中的主要酚酸類及黃酮類化合物，以口服生物利用度OB 指標(biāo)進(jìn)行排序，結(jié)果見表3。從檢索結(jié)果看，2.6.1項(xiàng)下篩選的Q-marker候選物質(zhì)均具有一定的生物利用度，其中生物利用度OB 值大于30%的有槲皮素、蒙花苷、木犀草素、金合歡素、香葉木素和1,3-二咖啡?？鼘幩岬取ｋm然在TCMSP 系統(tǒng)中未檢索到香葉木素苷的藥代動力學(xué)指標(biāo)，但現(xiàn)代藥理學(xué)研究其在體內(nèi)具有抗炎[21]作用，說明也具有一定的生物利用度。

表3 基于TCMSP系統(tǒng)篩選的野菊花主要酚酸類及黃酮類化合物信息表

2.6.3 基于成分與藥效關(guān)聯(lián)的野菊花Q-marker 預(yù)測分析

按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，野菊花主要功效為調(diào)中止瀉，解毒涼肝，息風(fēng)散火，破血，通絡(luò)，消腫等，主要用于治癰腫疔毒，瘰疬，惡瘡，眼目熱痛等癥。野菊花臨床單方或復(fù)方多用于風(fēng)熱感冒、肺炎、口瘡、癰癤及抗菌消炎和降脂降壓[22-24]等癥。黃酮和酚酸類化合物是野菊花主要的藥效組分[13]，具有抑菌[25]、抗炎[26]、降血脂[27]、降血壓[28]、抗氧化[29]、抗腫瘤[30-31]、護(hù)肝[32-33]、調(diào)節(jié)免疫[26]、治療胃腸炎[34]、抗心室重構(gòu)[35]等藥理活性，符合其“清熱解毒，瀉火平肝”的功效[36]，同時(shí)與其歸肝經(jīng)理論有一定的吻合之處[37]。野菊花主要黃酮類及酚酸類成分的藥理作用見表4。

表4 野菊花主要黃酮類及酚酸類成分的藥理作用

2.6.4 基于成分可測性原則的野菊花Q-marker 預(yù)測分析

按照2.4 項(xiàng)下HPLC 色譜條件檢測不同野菊及菊屬不同物種樣品中的綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、木犀草素、金合歡素、芹菜素、田薊苷、大波斯菊苷、木犀草苷、蘆丁、香葉木素苷、黃芩苷、香葉木素等16 種化學(xué)成分的含量。結(jié)果表明，16種化學(xué)成分皆具有可檢測性。

2.6.5 基于特有性原則的野菊花Q-marker 預(yù)測分析

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，一種中藥含有多種化學(xué)成分，而不同藥材可能含有相同的化學(xué)成分。從植物親緣學(xué)入手探討Q-marker的特有性，可以提高質(zhì)量控制的針對性和指向性。野菊花及同屬植物主要含有黃酮類、酚酸類、萜類、揮發(fā)油、氨基酸類及多糖類等成分，其中黃酮類和酚酸類化合物為主要的藥效成分[25,94]。本研究按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品及2.4 項(xiàng)下色譜條件，測定菊屬植物菊（小亳菊、懷白菊、懷黃菊、杭菊、滁菊）、異色菊、小紅菊、委陵菊、菊花腦和亞菊屬磯菊等樣品中11 種黃酮類和5 種酚酸類化合物的含量（圖2），從檢測結(jié)果看，綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C 是菊屬中普遍存在且含量較高的化合物，黃酮類和酚酸類化合物在同屬不同種及同種不同產(chǎn)地間含量差異明顯。結(jié)合圖1A 可看出，SXFX、CQJF 居群野菊樣品的田薊苷、芹菜素含量和HBMC、HNBY、AHLH 居群野菊樣品中的蒙花苷含量均明顯高于其他物種，具有一定的物種特有性。

圖2 不同菊花樣品中16種化合物含量

此外，本研究測定了不同居群野菊樣品中11種黃酮類和5 種酚酸類成分含量如圖3 所示，從圖3A 中可以看出，野菊的5 種酚酸類成分中異綠原酸A 和綠原酸含量普遍較高，而咖啡酸含量普遍較低。異綠原酸B 和異綠原酸C 在不同居群樣本間含量差異明顯，具有一定居群特有性，可選擇與異綠原酸A 和綠原酸共同作為野菊花Q-marker 的候選化合物。從圖3B 中可以看出野菊花11種黃酮類成分中木犀草素、大波斯菊苷、黃芩苷、香葉木素苷、蘆丁、金合歡素和香葉木素的含量分布較均勻，但含量普遍較低，只有個(gè)別樣品的含量較高，作為質(zhì)量標(biāo)志物容易增加檢測誤差。野菊花中含量較高的黃酮類成分為蒙花苷、田薊苷、芹菜素和木犀草苷，但其含量分布不均勻且有兩極分化的趨勢，高含量化合物只集中分布在少部分的樣品中，具有明顯的居群特有性特點(diǎn)，亦可選擇作為野菊花Q-marker的候選化合物。

圖3 不同居群野菊花中16種化合物含量分布熱圖

2.6.6 野菊花Q-marker的綜合預(yù)測分析

綜上所述，基于中藥Q-marker的“五原則”進(jìn)行預(yù)測分析，野菊花中11 種黃酮類和5 種酚酸類成分綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、綠原酸C、蒙花苷、木犀草素、金合歡素、芹菜素、田薊苷、大波斯菊苷、木犀草苷、蘆丁、香葉木素苷、黃芩苷、香葉木素均符合“存在性”“質(zhì)量傳遞和可追溯性”“可測性”“藥效相關(guān)性”原則。綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C是菊屬中普遍存在且含量較高的化合物，蒙花苷、田薊苷和芹菜素是野菊區(qū)別同屬其他物種的高含量物質(zhì)。異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、田薊苷、芹菜素和木犀草苷在不同居群樣本間含量差異明顯，具有一定居群特有性。綜合以上預(yù)測分析，建議選擇綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、田薊苷、芹菜素和木犀草苷等含量較高、可檢測性較好、具有明顯的居群特有性和物種特有性的8種化合物作為野菊花Q-marker的候選化合物。

2.7 野菊花預(yù)測Q-marker相對校正因子的確定

2.7.1 相對校正因子計(jì)算

精密取2.2 項(xiàng)下系列對照品溶液，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定。以蒙花苷（H）為內(nèi)參物，按公式fs/i=(As×Wi)/(Ws×Ai（)式中As 為內(nèi)參物峰面積，Ws 為內(nèi)參物的量，Ai 為組分i 的峰面積；Wi 為組分i 的量），分別計(jì)算綠原酸（A）、木犀草苷（B）、異綠原酸B（C）、異綠原酸A（D）、異綠原酸C（E）、田薊苷（F）和芹菜素（G）的相對校正因子（表5）。

2.7.2 相對校正因子重現(xiàn)性

考察了 Shimadzu LC-20AD、Aglient1260 型高效液相色譜儀和2 種色譜柱，蒙花苷（H）對綠原酸（A）、木犀草苷（B）、異綠原酸B（C）、異綠原酸A（D）、異綠原酸C（E）、田薊苷（F）和芹菜素（G）的相對校正因子基本一致。RSD 在1.23%-2.23%，表明不同儀器和色譜柱對各成分的相對校正因子無顯著影響，結(jié)果穩(wěn)定可控（表6）。

2.7.3 待測組分峰的定位

利用相對保留值（rs/k）定性，以蒙花苷（H）為內(nèi)參物，按公式rs/k=tk/ts（式中tk為待測物的保留時(shí)間，ts為內(nèi)參物的保留時(shí)間），測定綠原酸（A）、木犀草苷（B）、異綠原酸B（C）、異綠原酸A（D）、異綠原酸C（E）、田薊苷（F）和芹菜素（G）相對保留時(shí)間，結(jié)果見表6，RSD 在0.88%-4.07%，表明利用rs/k進(jìn)行峰定位可行（表7）。

表6 不同儀器和不同色譜柱測的相對校正因子

表7 不同儀器和色譜柱下目標(biāo)成分相對保留值

2.8 一測多評法（QAMS）與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

取CQJF-4 樣本樣品3 份，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測定含量，計(jì)算綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、田薊苷和芹菜素的相對校正因子，計(jì)算各組分的含量。將一測多評法（QAMS）與外標(biāo)法測得值進(jìn)行比較（表8）。所得值RSD 在0.77%-3.06%。表明一測多評可用于野菊花8種黃酮及酚酸成分的含量測定。

表8 一測多評法與外標(biāo)法測定7種成分含量比較

3 討論

3.1 野菊花Q-marker綜合分析

歷年版《中國藥典》均僅限定蒙花苷含量，從本研究發(fā)現(xiàn)，高含量的蒙花苷只集中分布在少數(shù)居群中，全國絕大部分居群的野菊花中的蒙花苷含量均較低，甚至檢測不到，該結(jié)果與韓正洲[95]的調(diào)查結(jié)果一致。目前，野菊花藥材以野生為主，合格藥材的產(chǎn)區(qū)非常集中，若野生資源遭受破壞，將嚴(yán)重影響野菊花藥材的正常市場供應(yīng)。市場調(diào)查中發(fā)現(xiàn)蒙花苷含量達(dá)標(biāo)的野菊花產(chǎn)量不能滿足市場需求，而將蒙花苷含量不達(dá)標(biāo)的野菊花摻入高蒙花苷含量野菊花中銷售的現(xiàn)象多見。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，野菊花總黃酮及其他黃酮類成分的藥理作用與蒙花苷基本一致，本研究發(fā)現(xiàn)部分居群野菊中的蒙花苷含量雖然較低但其他黃酮類成分含量較高。所以選育優(yōu)良品種發(fā)展人工種植，或優(yōu)化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)大產(chǎn)區(qū)尤為迫切。本研究在總結(jié)野菊花中藥材的化學(xué)成分、藥理作用及傳統(tǒng)用藥思維的基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物的核心概念，依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物篩選的原則和方法，從野菊花的功效相關(guān)性、可測成分、入血成分及成分特異性等多方面對野菊花的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行了分析與預(yù)測，建議考慮將野菊花藥材中的4 個(gè)類黃酮成分（蒙花苷、田薊苷、芹菜素和木犀草苷）和4 個(gè)酚酸類成分（綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C）作為野菊花藥材Q-marker的候選化合物。

3.2 野菊花提取條件及檢測波長選擇

2020 版《中國藥典》記載的野菊花供試品提取方法為100%甲醇，加熱回流3小時(shí)，該方法較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便大批量提取與分析。此外，在標(biāo)準(zhǔn)品制備過程中，以100%甲醇作為溶劑難以完全溶解標(biāo)準(zhǔn)品，直接影響含量測定準(zhǔn)確性。超聲提取分離過程，具有提高提取分離率、縮短提取時(shí)間、節(jié)約成本、可批量提取等優(yōu)點(diǎn)。本研究以蒙花苷的百分含量為檢測指標(biāo)，分別考察了不同提取方法（回流和超聲提?。⒉煌w積分?jǐn)?shù)提取溶劑（甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇）、不同提取溶劑體積（料液比1:25、1:50、1:100 mL）和不同提取時(shí)間（30、40、50、60、70 min）。綜合考慮提取時(shí)間、溶劑用量、蒙花苷含量，最終確定最佳提取方法為：0.5 g 野菊花粉末，使用80%甲醇25 mL，超聲提取60 min。根據(jù)《中國藥典》及文獻(xiàn)查閱，比較了254 nm、326 nm、334 nm、348 nm 和 355 nm 等波長 HPLC 色譜圖，發(fā)現(xiàn)在326 nm 的檢出物質(zhì)種類較多、峰型較好，且基線平穩(wěn)，最終選擇326 nm作為最佳檢測波長。

3.3 野菊花QAMS的構(gòu)建

多指標(biāo)成分的同時(shí)檢測增加了實(shí)驗(yàn)的操作難度及檢測成本，QAMS可在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，借助各成分間相對校正因子實(shí)現(xiàn)“一對多”檢測，采用QAMS可提高中藥成分檢測效率，降低檢測費(fèi)用，且更加全面有效的評價(jià)中藥的整體質(zhì)量。本研究以藥典規(guī)定的檢測成分蒙花苷為內(nèi)參物，采用QAMS 實(shí)現(xiàn)了對野菊花8 個(gè)有效成分同步檢測，經(jīng)驗(yàn)證該方法快速、簡單、準(zhǔn)確，且檢測成本低，能實(shí)現(xiàn)僅使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品對野菊花中多藥效成分含量同時(shí)測定，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對野菊花藥材的綜合質(zhì)量評價(jià)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了適用于野菊花藥材品質(zhì)評價(jià)的HPLC 體系，首次以16 個(gè)指標(biāo)成分對全國31 個(gè)居群野菊花種質(zhì)資源進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，并以Q-marker 的“五原則”為指導(dǎo)，結(jié)合野菊花化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展，最終確定以綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、田薊苷、芹菜素和木犀草苷8 個(gè)指標(biāo)成分作為其Q-marker的候選化合物。此外，首次利用預(yù)測的野菊花Q-marker 成分進(jìn)行QAMS 研究，實(shí)現(xiàn)以單個(gè)成分蒙花苷作為參照物的野菊花Q-marker 多指標(biāo)成分的同時(shí)定量分析，為野菊花藥材質(zhì)量評價(jià)及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。