韓遠山，易剛強，李鑫，歐陽琳，蔡嘉洛，鄒蔓姝（.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院科研部，長沙 40007；.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙 4008）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、對稱性關節(jié)炎和骨破壞為臨床表現(xiàn)的人體自身免疫性疾病[1]。目前，RA的治療藥物主要包括糖皮質激素、腫瘤壞死因子抑制劑和非甾體抗炎藥等[2]。這些藥物雖能迅速消除關節(jié)紅腫熱痛癥狀，緩解關節(jié)炎癥，但存在副作用多、成本高、骨破壞病情難以改善等問題；近年來興起的生物制劑雖有一定療效，但也存在靶器官特異性較低、長期療效缺乏足夠的循證證據(jù)等不足[3]?；诨瘜W藥品和生物制劑治療RA的上述毒副作用以及局限性，尋找有效的RA治療中藥近年來也越來越受到人們的重視。

RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，一般按照“頑痹”“尪痹”進行辨證施治[4]。古今中醫(yī)皆認為痹癥病機為本虛者臟氣內(nèi)虛，引起寒凝氣滯、血瘀，最終導致痰濁瘀血、痹阻經(jīng)絡[5]。痹癥的治則治法可以簡要概括為6個字：祛風、除濕、散寒[6]。臨床常用中藥青風藤和制附子治療RA，其主要作用機制包括下調(diào)炎癥因子表達水平、抑制核因子κB配位體受體活化劑分泌以及抑制骨破壞等[7-8]。

本研究以牛Ⅱ型膠原復制RA大鼠模型，通過檢測RA模型大鼠的一般情況、體質量、足腫脹度、關節(jié)炎癥指數(shù)（arthritis index，AI）評分、踝關節(jié)骨質變化情況、血清中炎癥因子及趨化因子水平、踝關節(jié)病理學情況和踝關節(jié)滑膜組織中核因子的表達情況，探討青風藤配伍制附子抗RA骨破壞的作用及機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Quantum GX2型小動物CT機[珀金埃爾默儀器（上海）有限公司]，T10 basic型勻漿機（德國IKA公司），KH-Q330/350型切片機、KL型組織脫水機、KH-BL1型組織包埋機（湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司），VIB50型制冰機（廣州科勒爾制冷設備有限公司）等。

1.2 主要藥物與試劑

青風藤（批號1512150652）、制附子（批號170650411）均購于康美藥業(yè)股份有限公司；吲哚美辛腸溶片（國藥準字H14020771，批號F171003，規(guī)格25 mg/片）購于云鵬醫(yī)藥集團有限公司；牛Ⅱ型膠原（批號180382）、不完全弗氏佐劑（批號SLBW2506）均購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；白細胞介素3（interleukin-3，IL-3）、IL-25、IL-31、核因子κB受體激活蛋白（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）、核因子κB受體激活蛋白配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、護骨因子（osteoprotegerin，OPG）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號 分 別 為 E-EL-H0100c、E-EL-R2394c、E-EL-H5469c、SN368、SEKM-0138、20190121）均購于上海晶天生物科技有限公司；兔抗鼠RANK、RANKL、OPG多克隆抗體（批號分別為ab182158、ab9957、ab73400）均購于英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號BA1032）購于武漢博士德生物工程有限公司；二甲苯等試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗動物

40只SPF級雌性SD大鼠（體質量150～170 g）由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號為11400700346315，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后進行分組實驗。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 造模藥物 將2.0 mg/mL的牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑混合，于4℃條件下，采用勻漿機攪拌均勻至完全乳化（完全乳化標志為乳化劑滴至水中不擴散），即得牛Ⅱ型膠原質量濃度為1.0 mg/mL的混合乳劑。

2.1.2 青風藤配伍制附子水提液 將青風藤和制附子以4∶5的質量比投料（質量比依據(jù)前期研究結果設置），總量為180 g，加水回流提取2次，第1次加10倍量水，提取2 h，濾過；第2次加8倍量水，提取1.5 h，濾過；合并2次濾液，減壓濃縮至相應質量濃度（青風藤質量濃度為5.4 g/mL，制附子質量濃度為6.75 g/mL），備用。

2.1.3 吲哚美辛水溶液 將吲哚美辛腸溶片用研缽碾碎后，加蒸餾水配制成質量濃度為1.35 mg/mL的吲哚美辛水溶液。

2.2 動物的分組、造模與給藥

根據(jù)體質量將大鼠隨機分為4組，空白組、模型組、陽性對照組、青風藤配伍制附子組，每組10只。根據(jù)預實驗的結果確定造模方式、給藥劑量及給藥方式。除空白組外，其余各組大鼠于尾根部正面皮下注射“2.1.1”項下混合乳劑200 μL進行初次免疫（第0天，以下均從實驗開始計時間）；7 d后，于尾根部背面皮下再次注射混合乳劑200 μL，加強免疫（第7天）?？瞻捉M大鼠在相同時間點，于同部位注射等體積生理鹽水。各組大鼠于加強免疫當天（第7天）開始灌胃給藥（給藥體積為10 mL/kg）。陽性對照組給予吲哚美辛水溶液（劑量為0.013 5 g/kg），青風藤配伍制附子組給予青風藤配伍制附子水提液（青風藤劑量為1.08 g/kg，制附子劑量為1.35 g/kg），每天給藥1次，第30天給藥結束；空白組和模型組則在相同時間給予等體積蒸餾水。

2.3 RA模型評價相關指標檢測

2.3.1 一般情況觀察與體質量測量 每天觀察大鼠的一般情況變化，包括精神狀態(tài)、皮毛色澤和活動狀態(tài)等。于關節(jié)開始出現(xiàn)炎癥腫脹后每3天用電子天平稱定體質量，記錄各組大鼠體質量變化情況，至第30天。

2.3.2 足腫脹度測量 在大鼠右后足踝關節(jié)部位用苦味酸進行永久性標記。于關節(jié)開始出現(xiàn)炎癥腫脹后每3天使用游標卡尺在標記部位測量其足跖腫脹厚度，每只重復測量3次，取平均值，至第30天。

2.3.3 AI評分 由3名以上研究者于第12天開始每3天根據(jù)關節(jié)腫脹度、關節(jié)顏色及關節(jié)活動情況評價大鼠全身關節(jié)病變程度。采用4分制對足爪炎癥進行評分，AI評分標準：0分，無紅腫；1分，踝關節(jié)或跗骨關節(jié)出現(xiàn)紅斑或輕微腫脹；2分，踝關節(jié)到跗骨關節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；3分，踝關節(jié)到跖骨關節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4分，踝關節(jié)到趾骨關節(jié)全部足爪腫脹[9]。累計四肢關節(jié)的得分為每只大鼠的AI評分，最高為16分。

2.4 踝關節(jié)骨質檢測

采用小動物CT機進行檢測。第30天，每組隨機挑選3只大鼠，將大鼠處死后取右后足踝關節(jié)，將標本平行固定于小動物CT機的樣本杯中。設置掃描角度為360°，分辨率為10 μm，電壓為80 kV，電流為500 μA，掃描時間為4 min。通過專用CT分析軟件對所得圖像進行三維圖片重建，分析骨侵蝕程度、滑膜增生情況和組織破壞情況。

2.5 血清中炎癥因子及趨化因子水平檢測

采用ELISA法進行檢測。第30天，將大鼠麻醉后，取腹主動脈血，經(jīng)抗凝處理后，以4 000 r/min離心10 min，分離血清，使用相應ELISA試劑盒測定大鼠血清中炎癥因子（IL-31、IL-25、IL-3）和趨化因子（RANKL、RANK、OPG）水平。具體操作嚴格按說明書步驟進行。

2.6 踝關節(jié)病理學觀察

采用HE染色法進行檢測。處死大鼠后，取后足踝關節(jié)，用4%多聚甲醛固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色后，于顯微鏡下觀察后足踝關節(jié)滑膜的形態(tài)結構、滑膜增生、炎性浸潤等情況。

2.7 踝關節(jié)滑膜組織中趨化因子表達情況檢測

采用免疫組織化學法進行檢測。取“2.6”項下已制好的踝關節(jié)切片，依次放入二甲苯和無水乙醇中進行脫蠟；用一抗（RANKL、RANK、OPG）、二抗稀釋液孵育后顯色；切片置入蘇木素染液中3～5 min，用自來水洗，分化液分化，再用自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗，脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下拍片，觀察RANKL、RANK、OPG的表達情況（以光密度值衡量）。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況和體質量變化

除空白組外，各組大鼠均于第9～12天關節(jié)出現(xiàn)炎癥腫脹。第12～30天，與空白組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)虛弱，活動力下降明顯，毛發(fā)失去光澤，體質量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和青風藤配伍制附子組大鼠一般情況均有所改善，體質量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。體質量結果見表1。

表1 各組大鼠體質量的測定結果（±s，n＝10，g）

表1 各組大鼠體質量的測定結果（±s，n＝10，g）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與空白組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05；d：與模型組比較，P＜0.01

組別空白組模型組陽性對照組青風藤配伍制附子組第30天221.48±7.09 86.63±3.46b 208.71±8.61d 183.31±2.81d第9天61.47±6.50 54.73±1.85 58.63±2.75 57.33±1.74第12天87.34±1.97 59.74±3.40a 80.98±3.48c 74.41±1.24c第15天109.39±6.28 51.55±3.88a 96.49±3.06c 90.35±4.31c第18天132.28±6.73 52.91±3.02b 115.50±4.17d 105.03±5.09d第21天156.25±8.38 54.95±3.04b 139.27±7.05d 121.19±3.49d第24天177.51±7.24 60.17±2.80b 159.39±7.66d 139.98±4.40d第27天199.70±6.47 70.58±3.04b 183.27±7.74d 161.21±2.62d

3.2 青風藤配伍制附子對RA模型大鼠足腫脹度的影響

第12～30天，與空白組相比，模型組大鼠足腫脹度顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和青風藤配伍制附子組大鼠足腫脹度顯著降低（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠足腫脹度的檢測結果（±s，n＝10，mm）

表2 各組大鼠足腫脹度的檢測結果（±s，n＝10，mm）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別空白組模型組陽性對照組青風藤配伍制附子組第30天0.49±0.03 4.03±0.11a 1.26±0.04b 1.63±0.09b第9天0.24±0.03 0.28±0.03 0.26±0.02 0.24±0.03第12天0.31±0.03 3.35±0.15a 0.96±0.04b 1.10±0.06b第15天0.35±0.03 3.89±0.12a 1.04±0.04b 1.24±0.06b第18天0.38±0.03 4.55±0.17a 1.10±0.04b 1.36±0.07b第21天0.41±0.03 4.70±0.16a 1.15±0.04b 1.45±0.07b第24天0.44±0.03 4.45±0.17a 1.18±0.03b 1.53±0.09b第27天0.46±0.03 4.25±0.14a 1.23±0.04b 1.58±0.09b

3.3 青風藤配伍制附子對RA模型大鼠AI評分的影響

第12～30天，與空白組比較，模型組大鼠AI評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和青風藤配伍制附子組大鼠AI評分顯著降低（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠AI評分的結果（±s，n＝10，分）

表3 各組大鼠AI評分的結果（±s，n＝10，分）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別空白組模型組陽性對照組青風藤配伍制附子組第30天0 6.88±0.84a 0.88±0.34b 1.13±0.35b第12天0 3.50±0.53a 0.75±0.46b 1.50±0.54b第15天0 6.38±0.74a 1.13±0.64b 1.75±0.71b第18天0 8.12±0.64a 1.25±0.46b 2.25±0.46b第21天0 10.25±0.70a 1.00±0.54b 2.38±0.52b第24天0 9.38±0.74a 0.88±0.35b 2.25±0.46b第27天0 8.00±0.93a 0.88±0.35b 1.38±0.52b

3.4 青風藤配伍制附子對RA模型大鼠踝關節(jié)骨質的影響

空白組大鼠后足踝關節(jié)表面光滑、結構清晰，無任何完整性破壞和不規(guī)則隆起。模型組大鼠后足踝關節(jié)表面粗糙，組織破壞明顯，滑膜增生和骨侵蝕嚴重；陽性對照組和青風藤配伍制附子組大鼠后足踝關節(jié)組織破壞程度和滑膜增生較模型組明顯減輕，骨侵蝕與骨破壞程度明顯下降。結果見圖1。

圖1 各組大鼠后足踝關節(jié)CT三維重建圖

3.5 青風藤配伍制附子對RA模型大鼠血清中炎癥因子及趨化因子的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-31、IL-25、IL-3水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和青風藤配伍制附子組的IL-31、IL-25、IL-3水平均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠血清中炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝10）

與空白組比較，模型組大鼠血清中RANKL、RANK水平均顯著升高，OPG水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和青風藤配伍制附子組大鼠血清中的RANKL、RANK水平均顯著下降，OPG水平均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 各組大鼠血清中趨化因子水平的檢測結果（±s，n＝10）

3.6 青風藤配伍制附子對RA模型大鼠踝關節(jié)病理學的影響

顯微鏡下可見，空白組大鼠踝關節(jié)結構清晰，排列平整，關節(jié)腔中未見炎癥細胞，軟骨關節(jié)呈粉紅色，骨質正常；模型組大鼠踝關節(jié)有大面積炎癥細胞浸潤，關節(jié)間隙狹窄，結締組織、滑膜細胞增生，關節(jié)軟骨結構破壞嚴重；陽性對照組大鼠踝關節(jié)組織可見少量炎癥細胞，但關節(jié)結構正常；青風藤配伍制附子組大鼠踝關節(jié)腔中有少量炎癥細胞零散分布，輕度增生，關節(jié)結構正常。顯微圖見圖4。

圖4 各組大鼠踝關節(jié)病理學顯微圖（×200）

3.7 青風藤配伍制附子對RA模型大鼠踝關節(jié)滑膜組織中趨化因子表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠后足踝關節(jié)滑膜組織中RANKL、RANK的光密度顯著升高，OPG的光密度顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組與青風藤配伍制附子中RANKL、RANK的光密度顯著下降，OPG的光密度顯著升高（P＜0.01）。結果見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中趨化因子表達的光密度檢測結果（±s，n＝10）

圖6 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中趨化因子表達的顯微圖（×200）

4 討論

青風藤與制附子是中醫(yī)藥臨床治療RA的常用藥對。青風藤味苦、辛，性平，苦以燥濕，辛以祛風，使風濕去、經(jīng)絡通、氣血暢而痹痛止；制附子味辛、甘，性大熱，辛以散邪，大熱逐寒，溫燥祛濕，使寒濕去、經(jīng)絡通、通則痛止。青風藤無制附子相配則逐寒無力，制附子無青風藤相伍則功專入腎回陽。青風藤配伍制附子“相須”為用，使祛風散寒、除濕止痛之力大大增強?，F(xiàn)代天然藥物化學和藥理學研究表明，青風藤抗RA的主要藥效組分是青藤堿，制附子抗RA的主要藥效組分是制附子總生物堿[10-11]。有研究表明，青風藤與制附子、青藤堿與制附子總生物堿均具有抗RA和免疫調(diào)節(jié)作用[12]。

RA作為一種自身免疫性疾病，體內(nèi)炎癥因子失衡是其關鍵病理指征。在眾多炎癥因子中，TNF-α、IL-1β、IL-6等指標已被廣泛證實在RA模型大鼠血液中顯著升高[13]。本研究以非典型炎性因子（如IL-3、IL-25、IL-31）為研究對象，探討其在RA模型大鼠體內(nèi)的變化特點與規(guī)律。IL-3由機體T細胞刺激活化產(chǎn)生，降低IL-3的表達可阻止關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[14]。IL-25主要由活化的2型輔助性T細胞（type 2 helper T cells，Th2）產(chǎn)生，可刺激IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子等參與免疫炎癥反應[15]，還可直接促進IL-4、IL-9、IL-13等分泌，加重關節(jié)損傷[16]。IL-31由Th2、單核巨噬細胞等活化產(chǎn)生，可誘導Th17活化，間接促進IL-8、基質金屬蛋白酶表達，使滑膜炎癥狀態(tài)持續(xù)、骨破壞加速[17]。IL-31還可直接促進TNF-α、IL-6的分泌，誘導關節(jié)炎發(fā)病[18]。以上研究證明，IL-3、IL-25、IL-31通過直接或間接途徑參與了RA的進程。有研究表明，炎癥因子失衡介導的RA是依賴于RANKL/RANK/OPG信號通路完成的[19]。RANKL/RANK/OPG是成骨細胞與破骨細胞之間的重要信號通路：生理條件下，破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成通過RANKL/RANK/OPG達成動態(tài)平衡，維持正常的骨代謝；病理狀態(tài)下，炎癥因子的大量表達能激活RANKL/RANK/OPG通路，使破骨細胞前體細胞過度分化為破骨細胞，從而引起骨與關節(jié)軟骨破壞[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA模型大鼠RANK與RANKL的表達較空白組顯著增加，而OPG表達顯著下降，RANKL與OPG間的平衡被打破，促使破骨細胞增加，造成骨損傷，這可能是RA形成的關鍵原因。結合模型組大鼠血清炎癥因子異常增加的特點推測，造模后，與空白組相比，模型組大鼠體內(nèi)炎癥因子異常增加，炎癥軸失衡，導致RANKL/RANK/OPG通路激活，骨代謝平衡被打破，破骨細胞增殖，最終誘導了RA的發(fā)生。青風藤配伍制附子組與模型組比較發(fā)現(xiàn)，青風藤配伍制附子可有效改善RA模型大鼠的精神狀態(tài)、體質量及足腫脹度，明顯減少滑膜關節(jié)內(nèi)炎性細胞的浸潤，保持關節(jié)內(nèi)部結構的完整，維持破骨細胞與成骨細胞骨代謝平衡。

綜上所述，青風藤配伍制附子能通過抑制炎癥反應、減少炎癥因子的釋放，抑制RANKL/RANK/OPG通路，從而抑制破骨細胞過度增殖，恢復骨代謝平衡，進而起到保護骨關節(jié)、治療RA的作用。