郭姝，宋清翔，董睿，封千喜，薛培鳳，董馨（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110）

蒙藥加味塔布森-2（modified Tabusen-2，MT-2）是我國(guó)蒙古族治療骨科疾病的傳統(tǒng)驗(yàn)方，由藍(lán)刺頭、杜仲、紅花、三七、珍珠5味藥材構(gòu)成，用于治療骨質(zhì)疏松、軟組織挫傷等，具有良好的臨床療效[1-2]。MT-2原劑型是以藥材打粉混合而成的散劑，患者用藥依從性差，加之方中各味藥材未經(jīng)提取，不利于有效成分的吸收。復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，且具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同起效的特點(diǎn)[3-4]。既往關(guān)于復(fù)方提取工藝優(yōu)化的研究大多未能將有效成分含量與藥效關(guān)聯(lián)起來(lái)，對(duì)提取工藝優(yōu)劣的評(píng)價(jià)過(guò)于片面，造成成分與療效脫節(jié)[5]。因此，開展MT-2成分、療效、提取工藝的關(guān)聯(lián)研究，對(duì)闡明MT-2的治療作用至關(guān)重要。為此，本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘MT-2方中的有效成分，并以此作為MT-2提取工藝優(yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法考察各因素對(duì)提取工藝的影響；同時(shí)，擬通過(guò)破骨細(xì)胞模型來(lái)驗(yàn)證最優(yōu)工藝所得提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制活性，以期克服既往研究成分與療效脫節(jié)的不足，為建立MT-2規(guī)范化生產(chǎn)工藝提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、Heraeus HERAcell 150i型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、Spectra Max i3x型酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、DMi8型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

蒙藥藍(lán)刺頭藥材于2020年8月采自內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院薛培鳳教授鑒定為菊科植物驢欺口Echinops latifolius Tausch.的干燥花序。杜仲、紅花藥材和三七粉均購(gòu)自亳州抱樸藥業(yè)有限責(zé)任公司，珍珠購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院薛培鳳教授鑒定均為真品。

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)SH18071907，純度≥98.0%）、松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)SH19102403，純度≥98.0%）、異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)SH20092505，純度≥98.0%）、1，5-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品（批號(hào)SH20200429，純度≥98.0%）、羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)SH19082807，純度≥98.0%）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)SH19040208，純度≥98.0%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)SH19012107，純度≥98.0%）均購(gòu)自北京賽百草科技有限公司。

核因子κB受體激活蛋白配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）購(gòu)自美國(guó)R&D System公司；TRAP染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司。其余試劑包括甲醇（色譜純）、無(wú)水乙醇（分析純）、甲酸（分析純）等，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)性成分的確定

2.1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選 以TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.symmap.org）和 ETCM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM）為依據(jù)，檢索MT-2各藥材所含化合物，經(jīng)活性靶點(diǎn)篩選、去重后，共得到方中活性化合物257個(gè)、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)931個(gè)。借助DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org）篩選骨質(zhì)疏松相關(guān)基因，共獲得該疾病相關(guān)基因3 704個(gè)。采用Venny 2.1.0在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）繪制成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集的韋恩圖，共獲得交集靶點(diǎn)470個(gè)。采用CytoScape軟件繪制方中活性化合物與470個(gè)交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，計(jì)算各成分與交集靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度（即度值）。使用Cyto-Scape軟件的“Network Analyzer”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，明確與交集靶點(diǎn)有相互作用的活性成分。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、1，5-二咖啡?？鼘幩帷惥G原酸A、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A均能與20個(gè)以上的交集靶點(diǎn)相互作用，其度值分別為73、58、64、63、55、55、50。因此，初步確定以上成分為MT-2提取工藝評(píng)價(jià)的候選指標(biāo)性成分。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用反相高效液相色譜法對(duì)各單味藥材中的成分進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)上述方法無(wú)法對(duì)珍珠的有效成分（氨基酸類成分）進(jìn)行有效定量，若采用柱前衍生化的方法，則會(huì)影響其余藥材中有效成分的準(zhǔn)確測(cè)定。結(jié)合“2.1.1”項(xiàng)下結(jié)果，氨基酸類成分對(duì)骨質(zhì)疏松的干預(yù)并不明顯，故本研究最終確定將綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡?？鼘幩?、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1作為MT-2提取工藝優(yōu)化的指標(biāo)性成分。

2.2 7種指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件 以Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，2%A→5%A；5～10 min，5%A→10%A；10～15 min，10%A→18%A；15～25 min，18%A→23%A；25～35 min，23%A→28%A；35～65 min，28%A→33%A；65～70 min，33%A→39%A；70～75 min，39%A→100%A）；柱溫為30 ℃；流速為0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm（人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1）、277 nm（綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡?？鼘幩幔?、403 nm（羥基紅花黃色素A）；進(jìn)樣量為10μL。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡酰奎寧酸、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品各10.00、10.54、10.90、10.31、10.20、10.20、10.10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得各單一對(duì)照品溶液。分別吸取上述7種單一對(duì)照品溶液830、370、640、540、1 375、135、1 110 μL，置于同一10 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，配制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.083、0.039、0.070、0.056、0.140、0.014、0.112 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取杜仲、藍(lán)刺頭和紅花藥材，于50℃下干燥2 h，粉碎，過(guò)40目篩，得實(shí)驗(yàn)用藥材粉末。取杜仲粉末、藍(lán)刺頭粉末、紅花粉末、三七粉、珍珠粉各1.6、1.2、0.8、0.4、0.1 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，按不同料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行不同次數(shù)、不同時(shí)間的回流提取，濾過(guò)（由于三七、珍珠為極細(xì)粉，為避免其在提取中的損失，2味藥均在末次回流時(shí)加入），合并濾液并搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液和空白溶液的制備 按“2.2.3”項(xiàng)下方法依次制得缺杜仲、缺藍(lán)刺頭、缺紅花、缺三七的陰性供試品溶液。另取甲醇，作為空白溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液[乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶14（g/mL，下同）、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)2次]、“2.2.4”項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液和空白溶液各適量，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1，空白溶液色譜圖略）。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液和空白溶液對(duì)測(cè)定均無(wú)干擾，7個(gè)待測(cè)成分的色譜峰均能達(dá)到基線分離，說(shuō)明方法專屬性較好。

圖1 MT-2中7種成分含量測(cè)定的高效液相色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分的質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得7種成分的線性方程，具體結(jié)果見表1。

表1 7種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.7 精密度考察 按“2.2.5”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算得綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡酰奎寧酸、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.49%、1.53%、1.46%、1.23%、0.90%、0.97%、2.57%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性考察 按“2.2.5”項(xiàng)下條件平行制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡?？鼘幩?、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，得各成分含量的RSD分別為2.65%、1.47%、2.90%、1.18%、2.13%、2.79%、1.75%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性考察 按“2.2.5”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，分別在（25±2）℃下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡?？鼘幩帷⒘u基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.60%、0.50%、0.38%、1.14%、0.16%、1.50%、2.89%（n＝8），表明供試品溶液在上述條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率考察 精密稱定MT-2樣品6份，精密加入等同于樣品含有量的各對(duì)照品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下條件制成供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡?？鼘幩?、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均加樣回收率分別為98.10%、97.70%、100.96%、101.09%、97.42%、100.88%、100.68%，RSD分別為2.67%、2.74%、3.29%、1.92%、1.90%、2.07%、3.58%（n＝6）。

2.3 權(quán)重系數(shù)的確定及綜合評(píng)分的計(jì)算

本研究權(quán)重系數(shù)的確定參考網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析所得各成分的度值，即權(quán)重系數(shù)為各成分度值與7種成分度值之和的比值。結(jié)果顯示，綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、異綠原酸A、1，5-二咖啡?？鼘幩?、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg1的權(quán)重系數(shù)（記為W1～W7）分別為0.131 6、0.131 6、0.150 7、0.153 1、0.119 6、0.174 6、0.138 8；隨后，按如下公式計(jì)算綜合評(píng)分：綜合評(píng)分＝（W1×a/amax+W2×b/bmax+W3×c/cmax+……+W7×g/gmax）×100。式中，a、b、c、d、e、f、g分別為當(dāng)前提取工藝下上述成分的含量；amax、bmax、cmax、dmax、emax、fmax、gmax分別為所有提取條件下上述成分的含量最大值。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

按照“2.2.3”項(xiàng)下提取方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在固定其余因素的條件下，分別考察乙醇不同體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%、100%）、料液比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16）、提取時(shí)間（30、45、60、90、120 min）和提取次數(shù)（1、2、3次）4個(gè)因素對(duì)MT-2中7種成分總含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，7種成分總含量分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶14、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)2次的條件下達(dá)到峰值。

圖2 MT-2提取工藝優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.5.1 工藝優(yōu)選 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)2次時(shí)，各成分總含量略有下降，此時(shí)再增加提取次數(shù)對(duì)各成分總含量的影響有限；同時(shí)，綜合考慮提取成本等實(shí)際生產(chǎn)問題，在工藝優(yōu)選時(shí)將提取次數(shù)固定為2次。選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和提取時(shí)間（C）為考察因素，以7種成分含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體因素與水平見表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 MT-2提取工藝優(yōu)化的因素與水平

表3 MT-2提取工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5.2 因素交互作用分析 通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得多元二次方程如下：綜合評(píng)分＝95.70+0.11A-0.01B+0.89C+0.87AB-1.56AC+0.65BC-2.87A2-1.92B2-3.98C2，方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，回歸模型F值為3.948（P＜0.05），表明模型具有顯著性，可用于響應(yīng)值的預(yù)測(cè)；各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度依次為C（提取時(shí)間）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞B（料液比），其中A2、C2的影響具有顯著性（P＜0.05）。

表4 方差分析結(jié)果

為進(jìn)一步分析各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響，本研究采用Design Expert 8.0.6軟件繪制了3D響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖3。研究指出，等高線的形狀可反映交互作用的強(qiáng)弱，越趨向橢圓形表示各因素的交互作用越強(qiáng)，越趨向圓形則交互作用越弱[6]。由圖3可知，因素A與B、A與C、B與C的交互作用均較為明顯。對(duì)比A與B的交互作用發(fā)現(xiàn)，等高線沿A軸變化相對(duì)密集，明顯密于B軸方向，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響比液料比大；同理可得，提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響比液料比大，也比乙醇體積分?jǐn)?shù)大。

圖3 因素A、B、C對(duì)綜合評(píng)分影響的3D響應(yīng)面圖與等高線圖

2.5.3 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證 采用Design Expert 8.0.6軟件求解上述多元二次方程，得MT-2最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)59.78%，料液比1∶14.03，提取時(shí)間93.48 min?？紤]到實(shí)際的可操作性，最終將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶14，提取時(shí)間94 min，提取2次。根據(jù)上述最優(yōu)條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可知，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均綜合評(píng)分為95.50，與預(yù)測(cè)值（95.75）的相對(duì)誤差為-0.26%，表明該方法重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 MT-2提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化影響的考察

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞接種于含有1%青霉素-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。

2.6.2 MT-2提取物藥液的制備 按“2.5.3”項(xiàng)下最優(yōu)工藝提取MT-2，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇后，冷凍干燥，即得MT-2提取物凍干粉（提取率為27.0%）。取凍干粉適量，用DMEM培養(yǎng)基溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.6.3 MT-2提取物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 采用CCK-8法進(jìn)行考察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)消化后制成單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔接種至96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入含不同質(zhì)量濃度MT-2提取物（18.6、37.2、74.4、111.6、148.8、186.0 ng/mL，按MT-2凍干粉質(zhì)量計(jì)，按“2.6.2”項(xiàng)下方法處理；劑量設(shè)置參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑適量，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度值。采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，當(dāng)MT-2提取物的質(zhì)量濃度低于186.0 ng/mL時(shí)，其對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響（P＞0.05），故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，MT-2提取物的質(zhì)量濃度不宜高于148.8 ng/mL。2.6.4 MT-2提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)消化后制成單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔接種至96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，將其分為對(duì)照組、模型組和MT-2低、中、高質(zhì)量濃度組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。除對(duì)照組外，其余各組均加入100 ng/mL RANKL誘導(dǎo)以制備破骨細(xì)胞分化模型，同時(shí)各藥物組加入含不同質(zhì)量濃度MT-2提取物（18.6、37.2、74.4 ng/mL，按MT-2凍干粉質(zhì)量計(jì)；劑量設(shè)置參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和“2.6.3”項(xiàng)下結(jié)果）的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組和模型組細(xì)胞加入等體積的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)5 d后，每孔用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，用多聚甲醛固定30 min后，再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。參照TRAP染色試劑盒說(shuō)明書配制染液并染色，于熒光顯微鏡下觀察。以TRAP染色陽(yáng)性的多核細(xì)胞（細(xì)胞核≥3）為破骨細(xì)胞，觀察各組破骨細(xì)胞的分化情況。結(jié)果（圖4A～圖4E）顯示，對(duì)照組未見明顯染色區(qū)域，細(xì)胞數(shù)量少；模型組出現(xiàn)散在的大型細(xì)胞，且TRAP染色呈陽(yáng)性，可見多核細(xì)胞，即存在明顯的破骨細(xì)胞分化現(xiàn)象；而各藥物組多為體積較小的單核圓形細(xì)胞，且TRAP染色不明顯，說(shuō)明MT-2提取物具有抑制破骨細(xì)胞分化的作用。

圖4 MT-2提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化和數(shù)量的影響

對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，考察不同組別破骨細(xì)胞的增殖情況；同時(shí)，采用SPSS 19.0軟件對(duì)各組破骨細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果（圖4F）顯示，與對(duì)照組比較，模型組破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組破骨細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P＜0.05），且這種抑制作用有隨藥物質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)。

3 討論

以往對(duì)于蒙藥提取工藝的優(yōu)化多以單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為主，對(duì)工藝優(yōu)劣評(píng)價(jià)也多以單一成分或少數(shù)成分的含量為指標(biāo)，未能有效關(guān)聯(lián)成分含量與藥物療效[5，7-8]，無(wú)法全面體現(xiàn)蒙藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)整合起效”的作用特點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在多向藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)快速進(jìn)步的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一門從網(wǎng)絡(luò)層面觀察藥物對(duì)疾病影響的新學(xué)科[9]，將其用于預(yù)測(cè)蒙藥復(fù)方的有效成分既能解決成分-療效脫節(jié)難題，也能節(jié)省各單一成分藥效評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)成本。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)MT-2的有效成分，并以各成分的度值來(lái)賦予指標(biāo)權(quán)重，不僅可綜合考察MT-2成分與疾病靶點(diǎn)的相關(guān)性，而且可均衡評(píng)估各信息的實(shí)際重要程度，確保綜合評(píng)價(jià)結(jié)果的合理性、科學(xué)性[10]。隨后，本研究通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了最優(yōu)工藝所得MT-2提取物的有效性，初步構(gòu)建了“成分-工藝-藥效”的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，本研究經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選所得7種有效成分中的5種在骨質(zhì)疏松治療領(lǐng)域具有一定活性：綠原酸可通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1通路來(lái)抵抗地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[11]；松脂醇二葡萄糖苷可促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖[12]；皂苷類成分可通過(guò)促進(jìn)血管新生來(lái)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[13]；羥基紅花黃色素A可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，并可促進(jìn)骨礦化的發(fā)生[14]。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可認(rèn)為，本研究以綠原酸等7種成分作為提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，既可體現(xiàn)成分-藥效的相關(guān)性，又有助于全面地評(píng)價(jià)提取工藝優(yōu)劣。

此外，本研究采用的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法不局限于“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”優(yōu)化，可直觀闡釋多種因素的交互作用[15-16]。結(jié)果顯示，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響依次為C（提取時(shí)間）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞B（料液比）。究其原因，筆者認(rèn)為可能與藥材中有效成分的溶出度、溶脹度、溶解性有關(guān)；同時(shí)，由于有效成分的溶出度隨時(shí)間延長(zhǎng)而變化明顯，因此提取時(shí)間對(duì)提取的影響更為顯著；而溶脹度隨水醇比例變化的速率高于溶解度隨料液比變化的速率，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響大于料液比。

破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成失衡是骨質(zhì)疏松的主要發(fā)病原因[17-18]。其中，RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞功能失調(diào)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的關(guān)鍵作用已被證實(shí)[19-20]。因此，抑制過(guò)度激活的破骨細(xì)胞分化是抗骨質(zhì)疏松的重要途徑，也是相關(guān)藥物治療效果體外評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了大量的TRAP染色陽(yáng)性多核細(xì)胞，即破骨細(xì)胞；而給予按最優(yōu)工藝制備的MT-2提取物后，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示該提取物可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，且隨著給藥劑量的增加，破骨細(xì)胞數(shù)量隨之減少，有一定的劑量依賴趨勢(shì)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和7種指標(biāo)成分的含量對(duì)MT-2的提取進(jìn)行了工藝優(yōu)化，并通過(guò)破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了按最優(yōu)工藝所得MT-2提取物的有效性，為解決傳統(tǒng)工藝成分與療效脫節(jié)難題、克服單因素實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差提供了參考，為MT-2新劑型的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。