劉鳴昊，黃亞森，張振凌，張麗慧，劉素彤，趙文霞#（.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽病科，鄭州 450006；.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046）

化痰祛濕活血方（Huatan qushi huoxue decoction，HQHD）是由全國(guó)第五批名老中醫(yī)趙文霞教授根據(jù)非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）病機(jī)“痰濕內(nèi)停、淤血阻滯、肝失條達(dá)”而定的經(jīng)驗(yàn)方，由澤瀉（30 g）、丹參（15 g）、郁金（15 g）、海藻（15 g）、決明子（10 g）、山楂（15 g）、水飛薊（15 g）、柴胡（6 g）共8味中藥組成。方中澤瀉利水滲濕、行氣消瘀，為君藥；丹參活血化瘀、涼血安神，郁金活血止痛、行氣解郁，海藻化痰利濕、軟堅(jiān)消痰，共為臣藥；決明子清肝明目，山楂消積散瘀，水飛薊清熱解毒，共為佐藥；柴胡疏肝理氣，為使藥；全方共奏化痰祛濕活血之功。目前，該方已被開(kāi)發(fā)為院內(nèi)制劑消脂護(hù)肝膠囊（豫藥制字Z20130331[鄭]），用于臨床治療NASH，效果良好[1]。

本課題組通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，決明子長(zhǎng)于清肝熱，炮制前后均可減輕肝損傷，降低丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平，且生品活性強(qiáng)于炮制品[2]；山楂生品和炮制品的降脂效果存在差異，以凈山楂最優(yōu)[3]；澤瀉經(jīng)麩炒后寒性稍微，長(zhǎng)于滲濕和脾、降濁以升清，利尿作用較生品顯著增強(qiáng)，主要活性成分23-乙酰澤瀉醇B的含量較生品有所升高[4]；丹參經(jīng)酒炙后，寒涼之性緩和，活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛之功增強(qiáng)[5]；郁金能夠引藥入血，且醋郁金在止痛方面的作用最強(qiáng)[6]；醋柴胡可引藥入肝，疏肝解瘀止痛效果強(qiáng)于生品[7]。另外，有研究分析了傳統(tǒng)湯劑單煎與混煎的化學(xué)成分和藥效學(xué)指標(biāo)的異同，發(fā)現(xiàn)復(fù)方混煎和藥味單煎混合湯劑在化學(xué)成分、藥效和臨床應(yīng)用上均各有不同[8-10]?？梢?jiàn)，炮制方法和煎煮方式均會(huì)影響單味藥材及全方的功效。HQHD原方中，各味藥材均采用生品，而未選用活性更優(yōu)的澤瀉、丹參、郁金、柴胡炮制品，目前也尚無(wú)研究探討HQHD單煎與混煎對(duì)藥材有效成分溶出的影響。

中藥成分復(fù)雜，檢測(cè)任一種或多種活性成分均不能表征其整體質(zhì)量，故質(zhì)量一致性成為中藥質(zhì)量控制的難點(diǎn)。目前，中藥指紋圖結(jié)合高效液相色譜（HPLC）法已成為中藥質(zhì)量控制的主要手段[11-12]。本課題組前期采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了HQHD標(biāo)準(zhǔn)湯劑的煎煮工藝，得其最優(yōu)煎煮工藝為12倍量水、浸潤(rùn)60 min、煎煮30 min×3次。在此基礎(chǔ)上，本研究擬建立以生品或炮制品及不同煎煮方式所得HQHD樣品的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)；同時(shí)，擬結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）等化學(xué)模式識(shí)別方法，分析各批次樣品的成分差異，以期為完善HQHD質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)現(xiàn)后續(xù)相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為HQHD中各藥味的炮制及煎煮方式的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）、BSA224S-CWⅠ級(jí)電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、YP10002Ⅲ級(jí)電子天平（上海衡際科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

蘆丁、橙皮苷、丹酚酸B、槲皮素、水飛薊賓、木犀草素、橙黃決明素、23-乙酰澤瀉醇C、柴胡皂苷b2對(duì)照品均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為153-18-4、520-26-3、121521-90-2、522-12-3、802918-57-6、327-97-9、67979-25-3、26575-93-9、58316-41-9，純度均不低于98.0%。

澤瀉飲片（批號(hào)分別為200403641、200202011、200500691）、丹參飲片（批號(hào)分別為 201200631、201100181）、柴胡飲片（批號(hào)分別為 200403321、200900911）、山楂飲片（批號(hào)分別為 210102511、191203831、190804891）、決明子飲片（批號(hào)分別為191000099、190200099）、郁金飲 片（批號(hào)分別為201201391、191001211）、海藻飲片（批號(hào)190601871）均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司；郁金飲片（批號(hào)200502）購(gòu)自普寧市澤群中藥飲片有限公司；海藻飲片（批號(hào)200801）購(gòu)自廣東天誠(chéng)中藥飲片有限公司；水飛薊飲片（批號(hào)190501CP0122）購(gòu)自安國(guó)市光明飲片加工廠。上述飲片由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張振凌教授鑒定均為真品，且符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定。

黃酒（批號(hào)20160909，酒精度≥10.0%）購(gòu)自湖州老恒和釀造有限公司；米醋（批號(hào)20201022）購(gòu)自山西紫林醋業(yè)股份有限公司；麥麩購(gòu)自南陽(yáng)市新田園農(nóng)產(chǎn)品有限公司；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片炮制

2.1.1 麩炒澤瀉 大火預(yù)熱待煙起時(shí)，將麥麩快速均勻撒入熱鍋中，改中火加熱，快速投入提前凈制且大小分檔的澤瀉片快速翻炒，炒至澤瀉表面呈黃色、麥麩呈焦黃色時(shí)出鍋，篩去麥麩，晾涼。每100 kg澤瀉用麥麩10 kg。

2.1.2 酒丹參 取丹參片，照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“0213炮制通則”項(xiàng)下酒炙法炒干[13]。每100 kg丹參用黃酒20 kg。

2.1.3 醋郁金 取郁金片凈制，大小分檔，加入規(guī)定劑量的米醋攪拌均勻，悶潤(rùn)，待醋被吸盡后，置鐵鍋內(nèi)，用文火加熱并快速翻炒，控制溫度在200℃左右，炒干，取出晾涼，篩去碎屑。每100 kg郁金用米醋10 kg。

2.1.4 醋柴胡 取柴胡片，照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“0213炮制通則”項(xiàng)下醋炙法炒干[13]。每100 kg柴胡用米醋20 kg。

2.2 色譜條件

以Eclipse XDS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，5.0%A→8.0%A；5～7 min，8.0%A；7～25 min，8.0%A→39.0%A；25～32 min，39.0%A→41.5%A；32～36 min，41.5%A；36～55 min，41.5%A→48.0%A；55～65 min，48.0%A→67.4%A；65～75 min，67.4%A→95.0%A；75～77 min，95.0%A→5.0%A；77～80 min，5.0%A）；柱溫為35℃；流速為0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取蘆丁、橙皮苷、丹酚酸B、槲皮素、水飛薊賓、木犀草素、橙黃決明素、23-乙酰澤瀉醇C、柴胡皂苷b2對(duì)照品各適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得上述成分質(zhì)量濃度分別為0.322、0.145、0.243、0.128、0.998、0.516、0.165、0.161、0.112 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液100、200、100、200、20、50、200、200、200 μL 置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 HQHD供試品溶液 將不同批號(hào)的8味飲片隨機(jī)組合成10個(gè)不同批次的HQHD樣品（編號(hào)S1～S10），其中各批次原方混煎（編號(hào)YH-1～YH-10）、原方單煎（編號(hào)YD-1～YD-10）、炮制混煎（編號(hào)PH-1～PH-10）、炮制單煎（編號(hào)PD-1～PD-10）樣品的飲片組成及來(lái)源同相應(yīng)批次的HQHD樣品，具體批號(hào)見(jiàn)表1。

表1 10批HQHD樣品中各飲片的批號(hào)信息

按處方量精密稱定各飲片，混合，放入鍋中，按本課題組前期所得最優(yōu)工藝煎煮，水煎液于50℃下濃縮至400 mL，取10 mL于25 mL量瓶中，用75%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得原方混煎供試品溶液。按處方量分別精密稱定與上述樣品等量的飲片，分置于燒杯中，按上述最優(yōu)工藝煎煮，混合各水煎液，于50℃下濃縮至400 mL，取10 mL于25 mL量瓶中，用75%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得原方單煎供試品溶液。取澤瀉、丹參、郁金、柴胡炮制品，其余藥材取生品，按上述原方混煎供試品方法制備炮制混煎供試品溶液，按上述原方單煎供試品方法制備炮制單煎供試品溶液。

2.3.3 HQHD單味飲片供試品溶液及陰性溶液 按處方量精密稱取澤瀉、丹參、郁金、柴胡、山楂、海藻、決明子、水飛薊飲片，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制得HQHD各單味飲片供試品溶液和分別缺澤瀉、郁金、水飛薊、山楂、決明子、海藻、丹參、柴胡的陰性溶液。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一HQHD供試品溶液（YH-1），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖。以丹酚酸B峰（保留時(shí)間適中，峰面積較大且分離度良好）為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.04%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為1.04%～2.69%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一HQHD供試品溶液（YH-1），置于HPLC儀進(jìn)樣盤中，分別在放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC圖。以丹酚酸B峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.04%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為0.52%～1.83%（n＝6），表明供試品溶液在該條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備HQHD供試品溶液（YH-1），共6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC圖。以丹酚酸B峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.09%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為1.12%～3.29%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 HPLC指紋圖譜的建立 取“2.3.2”項(xiàng)下HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎各10個(gè)批次的供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC圖。將所得圖譜信息導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以各類樣品的首批圖譜（色譜峰分離度好且出峰穩(wěn)定）為參照?qǐng)D譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)生成法進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，生成HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎的疊加指紋圖譜及相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜（R），見(jiàn)圖1。由圖1可知，HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品的疊加指紋圖譜均各有37個(gè)共有峰。通過(guò)匹配分離度較好的共有峰獲得共有峰模式（圖2A），通過(guò)比對(duì)混合對(duì)照品溶液的HPLC圖（圖2B），共指認(rèn)出9個(gè)共有峰：12號(hào)峰為蘆丁、13號(hào)峰為橙皮苷、16號(hào)峰為丹酚酸B、20號(hào)峰為槲皮素、22號(hào)峰為水飛薊賓、23號(hào)峰為木犀草素、29號(hào)峰為橙黃決明素、34號(hào)峰為23-乙酰澤瀉醇C、35號(hào)峰為柴胡皂苷b2。

圖1 10批HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品的疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜

圖2 共有峰模式和混合對(duì)照品溶液的HPLC圖

2.4.5 共有峰歸屬 取HQHD原方混煎樣品（YH-1）和澤瀉、丹參、郁金、柴胡、山楂、海藻、決明子、水飛薊單味飲片，分別按“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和各陰性溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC圖。通過(guò)與色譜峰的保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D進(jìn)行對(duì)比分析，初步對(duì)37個(gè)共有峰進(jìn)行了歸屬，見(jiàn)圖3。由圖3可知，8味組方飲片對(duì)HQHD指紋圖譜均有貢獻(xiàn)，其中1號(hào)峰來(lái)自海藻、水飛薊、澤瀉、丹參，2號(hào)峰來(lái)自山楂、澤瀉、水飛薊、丹參，3、8號(hào)峰來(lái)自山楂，4號(hào)峰來(lái)自山楂、丹參、水飛薊，5號(hào)峰來(lái)自山楂、水飛薊，6號(hào)峰來(lái)自海藻、山楂、郁金，7號(hào)峰來(lái)自柴胡、丹參、水飛薊，9號(hào)峰來(lái)自澤瀉、水飛薊、山楂，10、11、12、18、36號(hào)峰來(lái)自決明子、丹參，13號(hào)峰來(lái)自柴胡、丹參、山楂，14號(hào)峰來(lái)自水飛薊、丹參，15號(hào)峰來(lái)自水飛薊、決明子、丹參，16、19號(hào)峰來(lái)自丹參，17、20、21、24～29、32號(hào)峰來(lái)自決明子，22號(hào)峰來(lái)自水飛薊，23號(hào)峰來(lái)自決明子、水飛薊，30號(hào)峰來(lái)自水飛薊、郁金，31、34號(hào)峰來(lái)自澤瀉，33號(hào)峰來(lái)自決明子、澤瀉，35號(hào)峰來(lái)自柴胡，37號(hào)峰來(lái)自丹參、決明子。

圖3 HQHD共有峰歸屬

2.4.6 相似度分析 將HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品的圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，采用多點(diǎn)校正和Mark峰匹配計(jì)算相似度。結(jié)果，與對(duì)照指紋圖譜比對(duì)，10批原方混煎樣品的相似度為0.962～0.999，10批原方單煎樣品的相似度為0.975～0.998，10批炮制混煎樣品的相似度為0.943～0.998，10批炮制單煎樣品的相似度為0.953～0.995，均在0.950以上，表明樣品相似度良好，所建HQHD指紋圖譜穩(wěn)定、可靠，可以反映樣品的特征。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.5.1 PCA 以10批HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品指紋圖譜37個(gè)共有峰的峰面積為變量，用SIMCA-P 14.1（Demo）軟件的“Pareto”功能進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)擬合后選取前2個(gè)主成分進(jìn)行分析，其中第1個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率為44.9%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為19.1%；模型檢驗(yàn)參數(shù)R2Xcum（模型對(duì)X矩陣的解釋率）為0.639，模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2cum（原始模型預(yù)測(cè)能力）為0.514，表明該模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)信度良好[14]。據(jù)PCA得分圖（圖4）可知，原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品各自聚為一類。

圖4 PCA得分圖

2.5.2 炮制前后、不同煎煮方式的HQHP鏡像對(duì)比 隨機(jī)選取4批炮制前后、不同煎煮方式的HQHP樣品的HPLC圖進(jìn)行鏡像比較，未發(fā)現(xiàn)新成分（圖略）。

2.5.3 PLS-DA 在PCA的基礎(chǔ)上，以10批HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品指紋圖譜37個(gè)共有峰的峰面積為變量，用SIMCA-P 14.1（Demo）軟件進(jìn)行有監(jiān)督模式的PLS-DA，得模型檢驗(yàn)參數(shù)R2Xcum為0.639、R2Ycum（模型對(duì)Y矩陣的解釋率）為0.626，模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2cum為0.601，說(shuō)明樣品分離良好[14]。據(jù)PLS-DA得分圖（圖5）可知，原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品各自聚為一類，與PCA分析結(jié)果一致。

圖5 PLS-DA得分圖

2.5.4 差異標(biāo)志物分析 為分析引起樣品差異的原因和差異標(biāo)志物，本研究將不同批次HQHD原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品指紋圖譜37個(gè)共有峰的峰面積輸入SIMCA-P 14.1（Demo）軟件，建立有監(jiān)督模式的PLS-DA模型。為驗(yàn)證所建PLS-DA模型是否存在過(guò)度擬合現(xiàn)象，設(shè)置分類矩陣變量隨機(jī)排列200次以進(jìn)行置換檢驗(yàn)，結(jié)果R2擬合線和Q2擬合線與Y坐標(biāo)軸的截距均分別小于0.3和0.05，說(shuō)明所建模型可靠，不存在過(guò)度擬合現(xiàn)象，可用以判別分析組間差異[15]。

為確定影響樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物，本研究采用變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，VIP圖見(jiàn)圖6。當(dāng)VIP＞1時(shí)，代表對(duì)應(yīng)成分對(duì)樣品質(zhì)量具有顯著影響，是潛在的差異標(biāo)志物[14]。由圖6A可知，1、15、17、18、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和丹酚酸B（16號(hào)峰）、木犀草素（23號(hào)峰）可能是影響原方混煎與炮制混煎樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物；由圖6B可知，1、7、17～19號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和丹酚酸B（16號(hào)峰）、橙皮苷（13號(hào)峰）可能是影響原方單煎與炮制單煎樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物；由圖6C可知，1、17～19、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和丹酚酸B（16號(hào)峰）、木犀草素（23號(hào)峰）可能是影響原方單煎與原方混煎樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物；由圖6D可知，7、17～19、21號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和橙皮苷（13號(hào)峰）、丹酚酸B（16號(hào)峰）、蘆?。?2號(hào)峰）、木犀草素（23號(hào)峰）、橙黃決明素（29號(hào)峰）可能是影響炮制混煎與炮制單煎樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物。

圖6 共有峰的VIP圖

3 討論

本研究建立了不同批次HQHD樣品的指紋圖譜，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，各類樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于或接近于0.950，表明各批次樣品的整體質(zhì)量穩(wěn)定可靠。本研究共標(biāo)記了37個(gè)共有峰；通過(guò)與混合對(duì)照品比對(duì)，共指認(rèn)了9個(gè)共有峰；進(jìn)一步通過(guò)色譜峰的鏡像分析可知，炮制前后、不同煎煮方式的HQHD均未發(fā)現(xiàn)新成分，但峰面積有所變化，提示炮制和煎煮方式可能對(duì)化學(xué)成分的含量有所影響。

PCA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原方混煎、原方單煎、炮制混煎、炮制單煎樣品各自聚為一類，說(shuō)明各類樣品間存在差異，炮制和煎煮方式的影響較大。進(jìn)一步對(duì)兩組組成相同、煎煮方式不同的原方單煎和原方混煎、炮制單煎和炮制混煎樣品進(jìn)行PLS-DA發(fā)現(xiàn)，1、17～19、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和丹酚酸B、木犀草素可能是原方混煎和原方單煎樣品的差異標(biāo)志物（圖6C），7、17～19、21號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和橙皮苷、丹酚酸B、蘆丁、木犀草素、橙黃決明素可能為炮制混煎與炮制單煎樣品的差異標(biāo)志物（圖6D），提示1、7、21、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和橙皮苷、蘆丁、橙黃決明素7個(gè)成分可能是HQHD樣品質(zhì)量的差異性成分。結(jié)合指紋圖譜結(jié)果可知，炮制后上述成分的峰面積均顯著增加，且單煎大于混煎，可能與炮制過(guò)程中的成分轉(zhuǎn)化、分解、物理結(jié)構(gòu)改變及輔料作用等有關(guān)。

進(jìn)一步對(duì)兩組煎煮方式相同、組成不同的原方混煎和炮制混煎、原方單煎和炮制單煎樣品進(jìn)行PLS-DA發(fā)現(xiàn)，1、15、17、18、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和丹酚酸B、木犀草素可能為原方混煎與炮制混煎樣品的差異標(biāo)志物（圖6A），1、7、17～19號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和丹酚酸B、橙皮苷可能為原方單煎與炮制單煎樣品的差異標(biāo)志物（圖6B），提示7、15、19、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分和木犀草素、橙皮苷6個(gè)成分可能是影響HQGD樣品質(zhì)量的差異性成分。結(jié)合指紋圖譜結(jié)果可知，炮制后單煎樣品中上述成分的峰面積均顯著增加，可能與不同的煎煮方式會(huì)通過(guò)改變?nèi)軇┑膒H、黏度和溶質(zhì)的旋光度、滲透壓、荷電情況等屬性來(lái)影響成分的溶解度，或與其他溶質(zhì)發(fā)生相互作用而導(dǎo)致成分水溶性遞減等因素有關(guān)。但1、7、15、19、21、36號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分還需借助高分辨質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)進(jìn)行鑒定。

在NASH發(fā)病過(guò)程中，首先是各種原因造成的肝臟內(nèi)脂肪酸增多，多余的游離脂肪酸與甘油發(fā)生酯化反應(yīng)生成三酰甘油，導(dǎo)致肝臟脂肪堆積；隨后在脂肪的浸潤(rùn)下，肝細(xì)胞更易受到脂肪因子和氧化應(yīng)激等因素的打擊，從而發(fā)生損傷，最終發(fā)展為NASH[16]。此外，肝臟脂肪堆積也與總膽固醇水平密切相關(guān)：總膽固醇與低密度脂蛋白結(jié)合后可被肝細(xì)胞排出；當(dāng)該過(guò)程發(fā)生障礙時(shí)，大量的總膽固醇在肝臟中堆積，從而引起肝臟脂肪變性[17]。有研究指出，蘆丁能夠激活脂肪變性人肝細(xì)胞HepG2中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而促進(jìn)其靶因子肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄，加速脂肪酸的降解代謝，抑制三酰甘油的合成，提示該成分對(duì)非酒精性脂肪性肝病具有一定的治療作用[18]；橙皮苷可通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)肝纖維化大鼠發(fā)揮保護(hù)作用[19]；橙黃決明素可通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝來(lái)發(fā)揮較強(qiáng)的調(diào)脂作用，從而降低大鼠總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平，提高高密度脂蛋白水平[20]。基于上述文獻(xiàn)，筆者推測(cè)上述成分在炮制、煎煮過(guò)程中的變化可能會(huì)導(dǎo)致HQHD藥效的改變，但仍需后續(xù)研究予以驗(yàn)證。

綜上所述，本文所建HQHD指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠；木犀草素、橙皮苷等是不同煎煮方式樣品的質(zhì)量差異成分，蘆丁、橙皮苷、橙黃決明素等是炮制與否樣品的質(zhì)量差異成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果能較為全面地探討炮制和煎煮方式對(duì)HQHD的影響，但中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，本研究?jī)H對(duì)共有峰進(jìn)行了初步分析，后期可加強(qiáng)對(duì)其他未知差異性成分的識(shí)別，并跟蹤其體內(nèi)代謝過(guò)程，通過(guò)比較入血成分含量、組織分布、代謝等情況探討炮制和煎煮方式對(duì)中藥復(fù)方體內(nèi)行為的影響，以期為中藥炮制理論、臨床藥效提供更多依據(jù)。