向 淅，王思悅，蒲俊宏，唐雯璐，陳 清

(四川農業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130)

五葉草莓()，薔薇科、草莓屬植物，是我國野生草莓種質的一種。具有抗寒、抗病性強、果實香味濃等特點，是進行栽種培育和改良的理想親本，在我國西南和西北地區(qū)廣泛分布。五葉草莓為二倍體，核型公式為2=2=14=12m+2sm，屬1A類型，染色體數(shù)目少，基因組小，這些特點使其成為薔薇科植物基因功能研究中具有良好應用潛力的材料。同時，其果實存在紅色和白色兩種不同類型，變異豐富。課題組前期發(fā)現(xiàn)，該材料葉盤再生能力極強，遠遠超過了廣泛使用的森林草莓()，是進行遺傳轉化等操作的良好材料。但在實驗室培養(yǎng)條件下花芽分化和成花條件并不明確，常規(guī)培養(yǎng)條件，即16 h光照/8 h黑夜，(23±2) ℃下不能完成花芽分化，進行開花結果等生理過程。

花芽分化是一個復雜的形態(tài)建成過程，可分為生理分化期和形態(tài)分化期兩個階段。通過對模式植物擬南芥和水稻等突變體的研究可知，成花誘導包含了光周期途徑、春化途徑、自主途徑、年齡途徑、赤霉素途徑、常溫途徑以及最近發(fā)現(xiàn)的糖信號途徑等多個不同的調控路徑。植物對光照和溫度兩個關鍵環(huán)境因子及時且準確地響應并調控開花過程是其生存的前提，也是影響農作物生產的重要因素。光感受器如光敏色素(phytochrome，PHY)、隱花色素蛋白(cryptochromes，CRY)、UV-B受體蛋白UVR8等對成花的影響近年來得到了深入研究。生物鐘組分如GIGANTEA(GI)蛋白，REVEILLE(RVE)蛋白，LUX ARRHYTHMO(LUX)蛋白等均參與了光信號調控開花的過程。這些因子傳遞的不同信號，通過時鐘輸出蛋白如CONSTANS(CO)進行輸出，傳遞給成花整合蛋白FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)以及花器官一致性因子APETALA1(AP1)和LEAFY(LFY)，最終促進頂端分生組織完成花器官的誘導、分化以及發(fā)育過程。這些途徑中大多基因具有保守性，而不同物種仍具有特異的調節(jié)基因。保守調控網絡中，靠近下游的、、、1幾個關鍵基因發(fā)揮著極其重要的作用。其中基因是光周期途徑的輸出基因，編碼一個含CCT結構域的轉錄因子，能靶向基因的啟動子。FT是成花信號多個途徑的整合因子，有成花素之稱，為PEBP磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族的成員，可以長距離轉運。在長日照條件下，擬南芥葉片識別光信號，誘導基因的表達進而上調基因表達。緊接著，F(xiàn)T蛋白轉移至莖尖分生組織，與轉錄因子FD蛋白相互作用，形成FT/FD蛋白復合物，激活下游基因1等的表達。參與了花分生組織的形成、分生組織正常功能的維持，以及防止花分生組織逆轉的整個過程。在核小體中，LFY也可以通過與1啟動子的特定順式作用元件結合從而上調1來促進成花。和1是花分生組織形成過程的決定基因，標志著頂端分生組織由營養(yǎng)態(tài)向生殖態(tài)的轉變。

生理分化完成后，葉原基的物質代謝及生長點組織形態(tài)開始發(fā)生變化，使花芽和葉芽得以區(qū)分，由此進入了花芽的形態(tài)分化期，并逐漸發(fā)育形成花萼、花瓣、雄蕊和心皮，直到開花前才完成整個花器的發(fā)育。整個過程仍然受到內在遺傳因素的影響。Li等采用RNA-seq研究了二倍體森林草莓()的莖部分生組織，含莖尖分生組織(SAM)、花序分生組織(FM)和花托分生組織(REM)基因的差異表達情況，關鍵的轉錄因子如1、、和2等在共表達網絡的一個模塊中極顯著富集。楊紅發(fā)現(xiàn)，栽培草莓種苗質量、不同栽培模式，尤其是栽培過程中溫度和日照時數(shù)是影響花芽分化的重要因子。

本試驗以五葉草莓為材料，采用低溫(15 ℃)短日照(8 h·d)條件進行成花誘導，分析了，，和1關鍵成花基因的表達情況，并對不同處理時間后莖尖分生組織形態(tài)進行了石蠟切片觀察，確定了成花誘導時間，為利用五葉草莓進行分子生物學研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

野生五葉草莓植株采自四川省廣元市，無菌培養(yǎng)參考王梅的方法。挑選長勢一致、健壯的無菌組培苗50株，栽植于滅菌的泥炭土中，統(tǒng)一管理。待培養(yǎng)至旺盛生長階段(1個月后)，于人工氣候箱中進行短日照(8 h·d光照)和低溫(15 ℃)處理。從處理開始，每隔7 d取一次樣，每次取樣3株。持續(xù)取樣8周，8周后將剩余材料置于正常環(huán)境(白天25 ℃，夜晚20 ℃，16 h·d光照)下繼續(xù)培養(yǎng)至開花。

1.2 成花基因生物信息學分析

從薔薇科基因組數(shù)據庫(GDR)下載二倍體森林草莓()的基因組序列信息(v4.02)。森林草莓轉錄組數(shù)據分析參考Li等，用于成花基因在莖部不同分生組織表達量的生物信息學分析。野生五葉草莓的基因序列源自課題組前期數(shù)據，NCBI登錄號為SRP114679，用于成花基因在兩種果實類型中不同發(fā)育階段的表達量分析。以擬南芥，，和1序列為搜索序列，對森林草莓轉錄本進行BLASTN篩選(e-value=0.000 01)。利用TBtools軟件繪制基因結構，分析其外顯子、內含子和UTR區(qū)等在基因組序列上的數(shù)目、長度和分布情況。

1.3 成花基因的表達分析

RNA的提取采用改良CTAB法進行。參考Easy ScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒，進行cDNA第一鏈合成。采用SYBR Green法對、、1和在草莓花芽分化進程中的表達進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)相對定量分析。實時定量PCR的反應體積為20 μL，其中包含1 μL cDNA，10 μL 2×SYBR green Mix，濃度為10 mmol·L的正反向引物(表1)各1 μL。每個處理3個生物學重復和3次技術重復。擴增程序為95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s及72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。反應使用CFX Connect熒光定量PCR儀，以2基因作為內參基因，不添加模板為陰性對照。相對表達量采用2-ΔΔC法計算。

表1 用于實時熒光定量的引物

1.4 草莓花芽分化進程的切片觀察

采用常規(guī)石蠟切片法觀測花芽的分化進程。2020年6月11日至8月6日，每隔7 d隨機取樣3株，切取莖尖生長點和側芽生長點。4 ℃下用福爾馬林-乙酸-乙醇混合液(FAA)固定，按照常規(guī)方法制備石蠟切片，切片的厚度25 μm，進行番紅-固綠對染，中性樹膠封片，Olympus BX51拍攝圖像。

2 結果與分析

2.1 成花相關基因的篩選

因為五葉草莓缺乏參考基因組，因此以森林草莓基因組為參考進行目標基因的篩選。通過BLAST比對，共篩選出8個目標基因：CO僅篩選出一個同源基因4-213030；FT基因家族中篩選出了1(4-600090)、2(4-430710)和3(4-309870)3個成員；LFY基因家族中篩選出了1(4-303530)、2(4-304170)和3(4-509660)；AP1僅篩選出4-429600一個同源基因。

基因的結構如圖1-A所示，基因最長，存在14個外顯子和13個內含子。1基因的長度僅次于基因，含8個外顯子和7個內含子。FT家族的3個基因中，UTR區(qū)、外顯子、內含子數(shù)目一致，均由4個外顯子和3個內含子組成，但由于內含子長度不一致，導致1、2、3長度有所差異。1基因跨基因組最長，第2個內含子明顯長于其他2個基因，而2與3的差距則在于UTR區(qū)的長短差異。LFY基因家族中，1、2、3的UTR區(qū)、外顯子和內含子數(shù)目也高度一致，分別由3個外顯子和2個內含子組成。將FvFT與FvLFY各成員分別進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)不同成員間的氨基酸序列高度一致。

2.2 成花基因在分生組織中的表達量

利用現(xiàn)有的轉錄組數(shù)據，對4種成花基因在森林草莓莖尖分生組織(SAM)、花分生組織(FM)和花托分生組織(REM)3種分生組織中的表達量進行了分析(圖1-B)。1、2、2基因整體表達量低，3與1表達量較高且在各組之間表達情況相似。基因在FM中表達量相較于SAM和REM中低，而在SAM和REM中的表達量基本一致；3則是在FM中表達量最高，REM中最低；同樣在FM中有較高表達量的還有3和1基因，但是它們在SAM中的表達均低于在REM的表達；而1則是在REM中表達量明顯高于FM和SAM(在FM和SAM中表達量很低)。這些結果表明，同一基因不同拷貝之間可能存在功能分化，其中3和3在森林草莓中是主效基因。

A，成花基因結構分析；B，成花基因在莖部分生組織中的表達量；C，五葉草莓果實發(fā)育3個階段中成花基因表達量熱圖。A， Analysis of the structure of flowering genes； B， The expression level of floral genes in the Fragaria vesca shoot meristematic tissues； C， Heat map of floral gene expression in three stages of Fragaria pentaphylla fruit development.圖1 四種成花關鍵基因生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of the four key genes for flowering initiation

2.3 成花基因在兩種五葉草莓果實不同發(fā)育階段中的表達量

利用課題組前期的轉錄組數(shù)據，我們對4種成花基因在五葉草莓兩種果實類型不同發(fā)育階段的表達量進行了分析(圖1-C)。從結果可以看出，2、3、1、2、3表達量均較低，且在紅白果實的不同發(fā)育階段中表達量無明顯差異。1在紅白果實的不同發(fā)育階段中的表達量相對較高，但低于1與的表達量?；虮磉_量相較于其他基因最高，但在果實的不同發(fā)育階段中無明顯差異，1基因隨著果實的發(fā)育表達量呈降低趨勢，且在白色五葉草莓果實中的表達量稍高于紅色果實。1的基因表達水平在五葉草莓中表達量遠遠高于其他s的表達量，我們認為在五葉草莓中1為主效基因。

2.4 成花基因在五葉草莓葉片中的相對表達量

低溫和短日照處理7 d后，我們檢測了不同時間節(jié)點五葉草莓中4個關鍵成花基因的表達變化情況，結果如圖2所示。在處理28 d 時，各基因處于極低表達水平(接近0，未展示)?；蛴谔幚?8 d 后進入表達高峰，隨后表達量大幅下降，自35 d起呈現(xiàn)波動變化，表達量低。1基因自42 d起整體表達量較高，呈現(xiàn)下降趨勢，但維持較高表達水平；1與3基因表達趨勢相似，在42 d進入表達高峰，隨后基因表達量降低，并維持在一定的水平。這一結果表明，處理28 d后，五葉草莓開始出現(xiàn)成花啟動，在42 d時完成了由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉變過程。

2.5 花芽形態(tài)分化進程觀測

花芽形態(tài)分化時頂端生長點由三角錐狀逐漸肥大隆起，變得平坦寬闊，出現(xiàn)排列疏松的初生髓部，進而分化出花蕾原基，生長點變寬后分化為萼片原基，之后雄蕊、雌蕊原基相繼分化出來。本研究中，五葉草莓經低溫和短日照成花誘導后，花芽形態(tài)分化進程觀測結果如圖3所示。試驗中組織切片結果觀察到了未分化時期、花序分化期、萼片分化期及雌蕊分化期?；ㄑ糠只_始前，五葉草莓莖尖生長點呈平坦狀態(tài)(圖3-A)，隨著處理的進行，生長點開始隆起、肥厚，呈圓頂狀，側芽開始分化，達到花序分化期(圖3-B)?；ㄐ蚍只?，生長點形成了萼片(圖3-C)、花瓣、雄蕊、雌蕊(圖3-D)等花器官。

圖2 短日照低溫共同處理不同時間點四種成花基因在葉片中的相對表達量Fig.2 The relative expression levels of the four flowering genes in Fragaria pentaphylla after different time duration under the short-day and low-temperature treatment

A，未分化時期；B，花序分化期；C，頂花芽花萼分化期；D，雌蕊分化期。標尺：500 μm。A， Undifferentiated period； B， Inflorescence differentiation period； C， Apical flower bud calyx differentiation period； D， Pistil differentiation period. Scale bars： 500 μm.圖3 五葉草莓的花芽分化進程Fig.3 Flower bud differentiation process of Fragaria pentaphylla

3 討論與結論

植物開花會經歷成花誘導、花的發(fā)育和花器官的成熟3個階段，其中花的誘導是決定能否成花、何時成花以及花器官形態(tài)的關鍵時期。模式植物中所揭示的光周期途徑、春化途徑、自主途徑、年齡途徑和最新發(fā)現(xiàn)的糖信號途徑往往并非單獨發(fā)揮作用，而是相互關聯(lián)，通過關鍵的成花整合因子進行匯聚后發(fā)揮作用。其中，光周期和溫度是研究最多的兩個因素。

在擬南芥幾個關鍵的成花因子中，是光周期和低溫信號的輸出整合基因，可以把葉片感受的信號傳遞給下游的關鍵成花因子。本研究中，(4-213030)基因最先響應處理，于4周后出現(xiàn)表達高峰，隨后表達量急劇降低，前期在一定程度上影響了1(4-600090)基因的表達，這一結果進一步反映了不同物種中成花誘導因子功能的保守性。其下游的因子還可以響應其他信號，通過長距離運輸匯聚于莖尖分生組織。前期研究結果表明：短日照或低溫刺激會誘導草莓基因表達從而促進開花，在本試驗中進一步得到了驗證。植物頂端分生組織在完成開花誘導后，開始進入花啟動過程，涉及到的基因包括花分生組織特征基因、1、CAULIFLOWER()等。他們參與了早期的花器官分化以及維持的過程。1位于基因的下游，其表達受LFY的誘導。本研究中，1(4-429600)基因在處理過程中表達量相對穩(wěn)定且持續(xù)，與3(4-509660)基因表達量趨勢一致，且伴隨1、3基因的表達觀測到了花序分生組織繼續(xù)分化形成了萼片及雌蕊，與此同時生物信息學分析顯示花分生組織(FM)中3與1也表現(xiàn)出較高的表達量，有報道顯示，1在之后2～3 d上調，說明3與1在促進花形成的過程中起著極其重要的作用，參與了花分生組織的形成。

雖然有日中性草莓栽培類型，但常見的栽培草莓多為短日照類型，當日照時間短于12 h時開始花的分化。而低溫是栽培草莓完成花芽分化的必要條件。五葉草莓分布在我國的西偏北地區(qū)，其成花低溫需冷量目前尚不清楚。本試驗結果表明，通過相對低溫(15 ℃)和短日照處理，五葉草莓可以在42 d內完成花芽誘導過程。這一結果為五葉草莓通過溫光調控開花奠定了基礎。