滕祥勇, 王金明， 李鵬志, 林秀云, 孫 強(qiáng)

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 吉林 公主嶺 136100)

水稻直播是一種輕簡型栽培方式，具有省工、省時(shí)和高效等特點(diǎn)，在單位面積穗數(shù)、千粒重兩個(gè)方面，直播稻也比移栽稻更具豐產(chǎn)優(yōu)勢[1]。近年來，隨著農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力成本的升高，水稻直播被越來越廣泛采用。我國開展水稻直播生產(chǎn)較晚，相應(yīng)的研究起步也晚。目前用于水稻直播的品種都是水稻移栽生產(chǎn)中使用的品種，而在育秧移栽品種選育過程中以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效栽培為目標(biāo)，對苗期性能特征沒有要求。在直播稻生產(chǎn)過程中，全苗壯苗問題成為繼草害、倒伏等目前直播稻發(fā)展的又一制約因素[2]。直播稻苗期生長主要受到低溫脅迫、缺氧脅迫的影響[3]，通過選用耐逆境發(fā)芽能力(具有較強(qiáng)耐低溫能力)和在短期淹水環(huán)境中能保持較強(qiáng)的發(fā)芽出苗能力(具有較強(qiáng)耐缺氧能力)的水稻品種，能提高直播水稻的田間成苗率[3]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對水稻耐低溫低氧作了大量的研究。結(jié)果表明，耐低溫低氧能力存在顯著的品種間差異[4]，同時(shí)耐低溫和耐低氧兩性狀間無明顯關(guān)聯(lián)[5]。張曉麗等[6]、曹微等[7]把耐低溫與耐低氧作為2個(gè)獨(dú)立性狀進(jìn)行研究。本研究通過模擬特定的低溫低氧環(huán)境，對238份稻種資源進(jìn)行低溫、低氧、低溫低氧復(fù)合脅迫、室內(nèi)覆土及田間自然條件鑒定處理，篩選出一批耐低溫低氧材料，并探索和建立一種有效的水稻耐低溫低氧評價(jià)方法，為培育適合東北中部稻區(qū)直播稻品種提供材料基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為吉林省中、早熟品種、部分黑龍江第一積溫帶材料以及團(tuán)隊(duì)高世代材料共238份。試驗(yàn)在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所進(jìn)行。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、濾紙、10×10格冷凍盒、1 mL移液槍、1 mL槍頭、500 μL槍頭、密封盒、塑料盆。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1種子處理及種子發(fā)芽力檢測

將種子放入50 ℃恒溫培養(yǎng)箱處理48 h，打破休眠，使種子成熟度保持一致。

每個(gè)品種或株系隨機(jī)取50粒，用75%酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈，排列于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，30 ℃生化培養(yǎng)箱中濕潤發(fā)芽。以胚根或胚芽超過半粒種子長為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，檢測30 ℃下第5天的種子發(fā)芽率，以3次重復(fù)的種子發(fā)芽率平均數(shù)作為品種或株系的發(fā)芽率表型值，來判斷各品種/株系種子的活力[8]。

1.3.2耐低溫低氧鑒定

分初篩、精細(xì)室內(nèi)鑒定、室內(nèi)覆土試驗(yàn)、田間鑒定共4個(gè)部分。

1) 初篩：吉林省水稻直播的播種時(shí)期基本在5月中上旬，此時(shí)吉林省各地區(qū)的日均氣溫穩(wěn)定在15 ℃左右，故本試驗(yàn)將15 ℃，2 cm水深作為初篩時(shí)低溫低氧脅迫處理?xiàng)l件。具體處理如下：

每個(gè)品種或株系隨機(jī)取100粒，用75%酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈，排列于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，蓋蓋后將其放入種子箱內(nèi)，緩慢向種子箱中注水，水面高度超培養(yǎng)皿蓋1 cm(水深2 cm)。15 ℃處理10 d，調(diào)查其萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率；然后將低溫低氧脅迫處理10 d后的種子曬干，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽勢。3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子。

2) 精細(xì)室內(nèi)鑒定：低溫發(fā)芽試驗(yàn)為300粒種子，3次重復(fù)，每次重復(fù)100粒。放置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，統(tǒng)一用移液槍加10 mL無菌超純水，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件為12 ℃，24 h黑暗處理，統(tǒng)計(jì)15 d后的發(fā)芽率。

從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取50株，測量其幼芽和根的鮮重。隨后105 ℃殺青，85 ℃烘干，測量其干重。最后計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

低氧發(fā)芽試驗(yàn)：100粒種子，2次重復(fù)，每次重復(fù)50粒。分別放入2個(gè)10×10格的冷凍盒中，每格5粒，每個(gè)材料放1行。用移液槍統(tǒng)一在每個(gè)格子中加5 mL無菌超純水，確保每粒種子均被水覆蓋。

以正常發(fā)芽條件為對照(和上面處理區(qū)別在于加水不同，正常發(fā)芽加水500 μL，低氧加水5 mL)。

所有處理后的冷凍盒放入鋪有兩層濕潤濾紙的密封盒中，28 ℃恒溫發(fā)芽，16 h光照/8 h黑暗。7 d后，測量胚芽鞘的長度，并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率及缺氧反應(yīng)指數(shù)。10 d后測量苗高、葉片重等指標(biāo)。

缺氧反應(yīng)指數(shù)=缺氧條件下胚芽鞘長度/正常條件下胚芽鞘長度。

低溫低氧復(fù)合發(fā)芽試驗(yàn)：28 ℃恒溫催芽至破胸露白。選取破胸一致的種子均勻放置于塑料冷凍盒中，每格5粒，每個(gè)材料放1行(50粒)，2次重復(fù)，共100粒。每格加無菌超純水5 mL，轉(zhuǎn)入12 ℃光照培養(yǎng)箱，濕度75%，12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)10 d，處理結(jié)束后，瀝去多余的水，28 ℃正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 d，使幼芽恢復(fù)生長。

以正常處理的催芽種子為對照。統(tǒng)計(jì)正常苗數(shù)、計(jì)算成苗率、測量所有對照和處理正常苗的根長、根數(shù)、苗高、株鮮重、地上部鮮重和根鮮重。

3) 室內(nèi)覆土試驗(yàn)：選取飽滿無霉變種子，30 ℃光照培養(yǎng)箱蒸餾水浸種2 d，催芽2 d后播入塑料盆中，每盆播100粒，覆土(常規(guī)水稻土，過細(xì)篩)1 cm[9]，直尺量土層上面5 cm處作標(biāo)記，補(bǔ)水至標(biāo)記處，每天補(bǔ)水2次，維持5 cm土層淹水狀態(tài)。3次重復(fù)，每天觀察苗的長勢并及時(shí)補(bǔ)充水分以保持土壤濕潤；同時(shí)播干籽入塑料盆中，澆透底水，每日觀察出苗并及時(shí)補(bǔ)充水分以保持土壤濕潤，15 d后統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)。脅迫溫度15 ℃。

4) 田間鑒定：隨大田直播同期進(jìn)行，10 d開始統(tǒng)計(jì)其出苗數(shù)，每隔3 d統(tǒng)計(jì)一次。最終統(tǒng)計(jì)其出苗數(shù)、成苗數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，方差分析和多重比較使用SPSS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽力檢測

對238份供試材料進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，其中有42份材料發(fā)芽力較差，選用196份發(fā)芽力達(dá)標(biāo)材料開展耐低溫低氧鑒定試驗(yàn)。

2.2 低溫淹水初篩

一般認(rèn)為，15～20 ℃是鑒定水稻低溫發(fā)芽性的適宜溫度指標(biāo)。在此溫度范圍內(nèi)，品種間對低溫的反應(yīng)差異能表現(xiàn)最顯著。故為了觀察品種間差異而進(jìn)行的大量篩選試驗(yàn)，都以15 ℃為溫度指標(biāo)基準(zhǔn)[10]。本研究中，15 ℃低溫淹水脅迫對種子的萌發(fā)率、發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有一定程度的影響，其中對萌發(fā)率的影響最大。15 ℃低溫淹水處理10 d后，所有供試材料的萌發(fā)率均低于80%，其中萌發(fā)率超60%的僅有37份，占全部供試材料數(shù)的18.88%，萌發(fā)率低于60%的有159份，占供試材料數(shù)的81.12%。解除脅迫處理后種子重新進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)表明，約95%的供試材料的發(fā)芽率未受明顯影響，有51.53%的供試材料(101份)發(fā)芽率超95%，僅有9份材料的發(fā)芽率低于80%；43.36%供試材料的發(fā)芽勢高于60%。最終，以萌發(fā)率≥40%，發(fā)芽率≥80%，發(fā)芽勢≥60%為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出59份材料進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。

2.3 室內(nèi)鑒定

2.3.1低溫發(fā)芽鑒定結(jié)果

以初篩后表現(xiàn)較好的59份材料進(jìn)行12 ℃低溫脅迫處理，其中有51份材料低溫脅迫處理15 d后其發(fā)芽率高于60%，占供試材料的86.44%。51份材料的平均發(fā)芽率為77.65%，材料間發(fā)芽率變異系數(shù)為2.95，經(jīng)初篩后入選材料整體低溫發(fā)芽率較高，變異系數(shù)較小，這也表明利用15 ℃低溫淹水進(jìn)行大批量材料的初步篩選是有效的。

低溫脅迫處理后，不同材料間芽長、根長差異顯著，所有供試材料均表現(xiàn)為，根長長于芽長，根長的平均值為3.44 cm，是芽長平均值的1.66倍；50株幼苗平均鮮重為0.27 g，平均干重為0.17 g。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究中低溫處理后的根長、芽長等要明顯弱于前人研究中適溫條件下同時(shí)期的水稻幼苗。表明低溫脅迫可能對水稻幼苗地上部和地下部的生長都產(chǎn)生了顯著的抑制作用。

低溫下發(fā)芽率是目前在發(fā)芽期耐冷性鑒定中最常用的一種指標(biāo)[11]，而發(fā)芽指數(shù)則反映發(fā)芽的快慢。從表1可知，低溫脅迫處理下，材料間發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標(biāo)的變化幅度較大，供試材料中發(fā)芽指數(shù)最高可達(dá)14.91，表現(xiàn)出較快的發(fā)芽速度。12 ℃低溫脅迫下，7個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)表現(xiàn)為：發(fā)芽指數(shù)>活力指數(shù)>發(fā)芽率>鮮重>干重>根長>芽長，說明經(jīng)初篩后精準(zhǔn)鑒定時(shí)，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)對于區(qū)別材料間的耐冷性更具有代表性。

表1 低溫脅迫下各性狀的平均值、最大值、最小值及變異系數(shù)Table 1 The average value，maximum value，minimum value and coefficient of variation of characteristics under low temperature stress

在59份供試材料中，低溫發(fā)芽率超90%，發(fā)芽指數(shù)高于平均值的材料有12份，分別為W-1、W-14、W-32、W-39、W-82、W-91、Z-7、Z-36、Z-59、L-8、L-13、L-45，占供試材料的20.34%；23份材料發(fā)芽率超80%，占供試材料數(shù)的38.98%。芽長和根長均超過平均值的有21份，占供試材料的35.59%；發(fā)芽指數(shù)高于平均值的有21份，占供試材料的35.59%；活力指數(shù)高于平均值的有18份，占比30.51%。綜合發(fā)芽率(>80%)、芽長、根長、發(fā)芽指數(shù)(高于平均值)和活力指數(shù)等指標(biāo)，共篩選到較耐冷材料19份，其中，W-14、W-32、W-82、W-91、Z-36、Z-59、L-8、L-45等8份材料表現(xiàn)較強(qiáng)耐低溫(表2)。

表2 19份耐冷性較好材料Table 2 19 materials with resistance to cold

2.3.2低氧發(fā)芽鑒定結(jié)果

已有研究表明，低氧條件下水稻種子萌發(fā)差異明顯，耐低氧品種胚芽鞘能快速伸長突破水層表面，為幼苗和種子根的生長發(fā)育提供充足的氧氣[12-16]。前人研究多以低氧脅迫下胚芽鞘的長度作為評價(jià)種質(zhì)資源耐低氧指標(biāo)[17-18]；而本研究中發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫處理后材料的幼苗生長高度、胚芽鞘長度和發(fā)芽率3項(xiàng)指標(biāo)差異明顯。幼苗生長高度均值由7.3 cm降至4.0 cm，降低了45.21%。在5.0 cm水深下培養(yǎng)，水稻生長到第6天，僅有1份材料幼苗高于5.0 cm，苗頂端突破水層表面，不足總數(shù)的2%，第7天，有3份幼苗高于5.0 cm，約為總數(shù)的5%，到處理結(jié)束，共有13份材料幼苗超出水層，約占供試材料總數(shù)的22.03%。同時(shí)，在研究中發(fā)現(xiàn)，所有供試材料在前期(播后3～5 d)均表現(xiàn)較快生長；之后，材料間出現(xiàn)分化，部分材料幼苗繼續(xù)快速生長，到后期頂端突破水面，從而吸收到充足的氧氣，恢復(fù)正常生長；另一部分材料則一直表現(xiàn)為生長緩慢或停止生長，最終無法突破水面長期缺氧而死亡。

發(fā)芽率均值降低幅度最大，低氧脅迫后供試材料發(fā)芽率平均值僅為27.3%，遠(yuǎn)低于正常處理(89.4%)，差異顯著。59份供試材料中有10份材料發(fā)芽率高于60%，平均發(fā)芽率為68.21%，而在正常處理?xiàng)l件下，該部分材料的平均發(fā)芽率為97.02%；低氧脅迫下，29份供試材料(約50%)發(fā)芽率低于20%，平均發(fā)芽率為7.12%，正常處理?xiàng)l件下，29份材料的平均發(fā)芽率為93%，兩者差異極顯著。低氧脅迫后，不同材料間發(fā)芽率差異明顯，發(fā)芽率可以作為低氧耐性評價(jià)的一個(gè)參考指標(biāo)。

低氧脅迫下，胚芽鞘較對照下降38.46%；43份供試材料的胚芽鞘長度較對照下降明顯，16份材料的胚芽鞘與對照間無顯著差異。缺氧反應(yīng)指數(shù)看，大于1.0的材料占所有材料的8.47%(5份)，其中最大值達(dá)1.32。這5份材料的發(fā)芽率均超60%。29份低氧脅迫下平均發(fā)芽率低的材料缺氧反應(yīng)指數(shù)均值為0.16。發(fā)芽率與缺氧反應(yīng)指數(shù)間呈顯著正相關(guān)，即低氧脅迫下發(fā)芽率越高的材料，其缺氧反應(yīng)指數(shù)相對較高；發(fā)芽率越低，其缺氧反應(yīng)指數(shù)相對較低。株高與缺氧反應(yīng)指數(shù)也呈正相關(guān)，株高越高，其胚芽鞘越長，缺氧反應(yīng)指數(shù)越大。而葉片數(shù)、葉片重等指標(biāo)與缺氧反應(yīng)指數(shù)無顯著相關(guān)性(表3、表4)。

表3 不同脅迫處理對胚芽鞘等指標(biāo)的影響Table 3 Effects of stress on coleoptiles indicators and so on

p<0.05)。下同。

表4 低氧脅迫處理下農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of main agronomic characters under hypoxia

低氧脅迫下，處理1為發(fā)芽率超60%材料；處理2為發(fā)芽率介于(20%～59%)之間材料；處理3為發(fā)芽率低于20%材料。

以低氧脅迫下胚芽鞘長度(與對照無顯著差異)為主要鑒定指標(biāo)，參考發(fā)芽率(>50%)、苗高(>4.5 cm，超過或接近于水面頂端)、缺氧反應(yīng)指數(shù)(>0.6)等，篩選出低氧耐性表現(xiàn)較好的材料15份：W-14、W-82、W-91、Z-7、Z-54、Z-55、L-13、L-26、W-69、W-111、Z-19、Z-41、L-2、L-8和L-31(表5)。

圖1 供試材料在不同處理?xiàng)l件下成苗率Fig.1 Seedling rate under different seed treatments

表5 15份耐冷性較好材料Table 5 15 materials with better resistance to low temperature

2.3.3低溫低氧復(fù)合脅迫鑒定

低溫低氧復(fù)合脅迫下，59份供試材料在12 ℃低溫淹水處理10 d后，僅有3份材料的苗高與對照差異不大，其余材料均表現(xiàn)為：低發(fā)芽率、芽長生長緩慢，基本無新根發(fā)出。在瀝水后恢復(fù)培養(yǎng)10 d，有39份材料表現(xiàn)出較高出苗率，通過對39份材料對比分析(表6)發(fā)現(xiàn)，不同處理對根長的影響較大，正常處理?xiàng)l件下供試材料根長均值為9.75 cm，脅迫處理后其均值為7.79 cm，較對照下降了20.21%；不同處理對根數(shù)基本無影響；脅迫處理后苗高、鮮重分別較對照下降4.51%和9.06%。同一處理?xiàng)l件下，盡管不同材料間各性狀存在一定差異，在隨后的成苗實(shí)驗(yàn)中，39份材料均可正常成苗。

表6 混合脅迫下各性狀的平均值、最大值、最小值及變異系數(shù)Table 6 The average value,maximum value,minimum value and coefficient of variation of characteristics under mixed stress treatment

2.4 覆土鑒定

覆土鑒定結(jié)果見表7和圖1。從中可見，無論是干籽還是催芽播種，所有供試材料的成苗率均高于50%，表現(xiàn)較高成苗率。浸種催芽播種平均成苗率為66.6%，干籽播種成苗率為65.98%，兩種處理間成苗率差異不明顯。兩種處理方式下成苗率均高于60%的有19份。

2.5 大田鑒定

對219份材料進(jìn)行自然條件鑒定(后期增加課題組新創(chuàng)制材料23份)。大田條件下出苗率高于80%的有19份，其中成苗率超80%的有7份；出苗率、成苗率低于60%的分別有163份和184份，占供試材料的55.91%和72.44%，就出苗速度看，10 d出苗的材料僅有3份，20 d內(nèi)出苗的材料有21份，90.41%的供試材料出苗天數(shù)超20 d(表8、表9)。供試材料整體出苗、成苗率低、出苗速度慢，可能與播種深度、土壤水分、室內(nèi)溫度變化大等因素有關(guān)。

表7 覆土處理后部分材料成苗率Table 7 Seedling rate of partial materials after soil cover treatment

表8 21份田間表現(xiàn)較好材料Table 8 Field performance of 21 materials

表9 自然條件下不同材料的出苗情況Table 9 Seedlings of different materials under natural conditions

3 結(jié)果與討論

對收集到的238份材料經(jīng)簡易程序篩選，初篩到59份耐低溫低氧材料。對該批材料進(jìn)行低溫鑒定，綜合發(fā)芽率、芽長、根長、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)，共篩選到較耐冷材料19份，其中，W-14、W-32、W-82、W-91、Z-36、Z-59、L-8、L-45等8份材料表現(xiàn)較強(qiáng)耐低溫。以低氧脅迫下胚芽鞘長度為主要鑒定指標(biāo)，參考發(fā)芽率、苗高、缺氧反應(yīng)指數(shù)等，篩選出表現(xiàn)較好低氧耐性材料15份：W-14、W-82、W-91、Z-7、Z-54、Z-55、L-13、L-26、W-69、W-111、Z-59、Z-41、L-2、L-8和L-31。59份供試材料經(jīng)低溫低氧復(fù)合脅迫后，有39份材料能快速恢復(fù)生長、出苗率較高，并能正常成苗；室內(nèi)覆土試驗(yàn)顯示，在催芽和干籽條件下成苗率高于60%的有19份材料；田間鑒定有21份材料表現(xiàn)出高的出苗成苗率(>60%)且出苗速度相對較快(出苗時(shí)間少于20 d)。綜合混合脅迫、覆土試驗(yàn)和田間鑒定結(jié)果，共獲得16份較耐低溫低氧材料，分別為：L-2、L-30、L-39、L-5、L-8、W-106、W-14、W-39、W-43、W-65、W-82、W-86、Z-32、Z-33、Z-59和Z-7。室內(nèi)覆土試驗(yàn)結(jié)果與大田自然鑒定試驗(yàn)結(jié)果相符。同時(shí)，篩選出的材料與室內(nèi)低溫低氧混合脅迫篩選結(jié)果也基本一致；大田出苗成苗率較好，出苗速度相對較快的材料，其在室內(nèi)混合脅迫中表現(xiàn)較好。

本研究中，通過簡易程序，以萌發(fā)率、發(fā)芽率和發(fā)芽勢為指標(biāo)，經(jīng)初步篩選出的材料在后期的精準(zhǔn)鑒定試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的低溫低氧耐性、出苗成苗率，這種方式可適用于大批次的種質(zhì)資源低溫低氧耐性篩選。前人多以低溫發(fā)芽率作為耐冷資源評價(jià)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，在耐冷材料的精準(zhǔn)鑒定中，加入發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)，通過觀察材料間發(fā)芽速度的快慢，可以更為有效地區(qū)分耐冷性差異較小材料。在現(xiàn)有的不多耐低氧資源評價(jià)研究中，多以低氧脅迫下胚芽鞘的長度作為鑒定指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下材料間發(fā)芽率存在顯著差異，不同材料間幼苗高度差異極大，建議在以后的耐低氧資源評價(jià)中，增加低氧脅迫下發(fā)芽率和幼苗高度作為參考指標(biāo)。

低溫和低氧是直播水稻萌發(fā)期面臨的兩大主要問題，本研究以出苗成苗率作為關(guān)鍵鑒定指標(biāo)，對經(jīng)室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定后的材料進(jìn)行覆土試驗(yàn)、大田試驗(yàn)，結(jié)果表明，在田間也表現(xiàn)出較高的出苗成苗率。篩選出的19份耐低溫材料中有7份材料在混合脅迫下表現(xiàn)良好，篩選到的15份耐低氧材料中有5份材料在混合脅迫下表現(xiàn)良好。