姚 雷 楊國(guó)良 殷佳蓓 張 毅 羅婷婷 唐家偉 唐君輝 劉 政

研究［1-2］證實(shí)，超聲聯(lián)合微泡空化可以改善微循環(huán)，增加局部血流灌注，在急性組織缺血性疾病的診治中發(fā)揮重要作用。另有研究［3］表明，低強(qiáng)度超聲激勵(lì)微泡發(fā)生空化，可以在細(xì)胞膜形成“聲孔效應(yīng)”，通過增強(qiáng)微血管通透性提高腫瘤組織藥物遞送。利用診斷超聲激勵(lì)微泡發(fā)生空化，可改善乏血供腫瘤血流灌注，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤化療及免疫治療效果［4-5］，具有靶向定位、可實(shí)時(shí)影像監(jiān)測(cè)、簡(jiǎn)便易行、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景廣泛。超聲空化效應(yīng)的強(qiáng)度與多個(gè)聲學(xué)參數(shù)密切相關(guān)，包括頻率、聲壓、機(jī)械指數(shù)、脈沖長(zhǎng)度、脈沖重復(fù)頻率、占空比等。本課題組前期研究［4-6］表明，通過調(diào)控機(jī)械指數(shù)或脈沖重復(fù)頻率產(chǎn)生特定的超聲治療參數(shù)，可以激勵(lì)微泡空化，增強(qiáng)血流灌注效應(yīng)。但超聲不同聲學(xué)參數(shù)及微泡理化性質(zhì)的組合產(chǎn)生的增強(qiáng)效應(yīng)并不甚穩(wěn)定，某些聲學(xué)參數(shù)下可能還會(huì)出現(xiàn)血流灌注降低的效果［7-8］。不同脈沖時(shí)間及間隔時(shí)間的組合可形成不同占空比，其是否會(huì)影響空化效應(yīng)，造成腫瘤血流灌注差異，仍亟待研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠皮下C6膠質(zhì)細(xì)胞瘤模型，使用低強(qiáng)度診斷超聲激勵(lì)微泡空化，在相同頻率、機(jī)械指數(shù)、脈沖長(zhǎng)度及脈沖重復(fù)頻率條件下，通過調(diào)控脈沖時(shí)間及間隔時(shí)間產(chǎn)生不同占空比，分析其對(duì)乏血供腫瘤血流灌注的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取5 周齡雌性Wistar 大鼠45 只，體質(zhì)量96~110 g，均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)：SYXK（渝）20170002］；實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作和處理方案通過陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（AMUWEC20224334）。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.主要儀器：使用VINNO 70超聲診療一體機(jī)（蘇州飛依諾科技有限公司），X4-12L線陣探頭，頻率4~12 MHz；具有Vflash空化調(diào)控功能，可通過調(diào)控機(jī)械指數(shù)、探頭中心頻率、脈沖長(zhǎng)度、脈沖重復(fù)頻率、脈沖時(shí)間及間隔時(shí)間等參數(shù)產(chǎn)生不同的超聲空化效應(yīng)。該儀器配備自適應(yīng)可變焦域技術(shù)，通過電子相控陣聚焦，在超聲發(fā)射平面形成1~5 cm 的感興趣區(qū)（region of interest，ROI），使治療超聲在ROI 內(nèi)形成弱聚焦，治療中ROI內(nèi)微泡可發(fā)生靶向空化。

2.主要試劑：“脂氟顯”微泡造影劑，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科自行研發(fā)，外層為磷脂外膜，核心氣體為全氟丙烷，使用前經(jīng)機(jī)械振蕩器振蕩90 s，所得微泡平均粒徑約2.0 μm，濃度為（2~9）×109/ml。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.模型建立及分組：將大鼠C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供）于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞占據(jù)視野約90%時(shí)行胰酶消化處理，以1000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/μl。選擇大鼠右側(cè)背部皮膚備皮、消毒，使用1.0 ml無(wú)菌注射器抽取0.2 ml 腫瘤細(xì)胞懸液注入皮下，注射后輕壓注射點(diǎn)30 s防止細(xì)胞懸液漏出。待腫瘤生長(zhǎng)至直徑約1 cm時(shí)可以入組，將荷瘤大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5 組，每組各9只。

2.腫瘤治療方法：使用2%戊巴比妥鈉（2 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠俯臥位固定于治療臺(tái)上，建立尾靜脈通道，充分暴露腫瘤生長(zhǎng)處皮膚，均勻涂抹醫(yī)用耦合劑后覆蓋3 cm 厚超聲耦合墊。應(yīng)用二維超聲觀察腫瘤形態(tài)，測(cè)量腫瘤大??；然后切換至超聲造影模式，固定超聲探頭于腫瘤最大切面，經(jīng)大鼠尾靜脈通道團(tuán)注0.04 ml“脂氟顯”，隨后立即注入0.2 ml 無(wú)菌生理鹽水沖管，存儲(chǔ)60 s 動(dòng)態(tài)造影圖像。待造影劑基本廓清后，切換至Vflash 治療模式，取0.04 ml“脂氟顯”，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.40 ml，治療時(shí)長(zhǎng)10 min內(nèi)緩慢勻速推注。治療時(shí)超聲探頭以腫瘤最大切面為中心，向兩側(cè)扇形傾斜掃查至腫瘤邊緣。調(diào)整儀器確保治療ROI覆蓋腫瘤及周邊0.5 cm范圍組織。本研究5 組荷瘤大鼠相同的超聲治療聲學(xué)參數(shù)設(shè)置：機(jī)械指數(shù)0.3，探頭中心頻率3 MHz，脈沖長(zhǎng)度3 個(gè)周期，脈沖重復(fù)頻率2 kHz；需調(diào)控的參數(shù)為脈沖時(shí)間及間隔時(shí)間，A 組：脈沖時(shí)間5 s，間隔時(shí)間1 s；B 組：脈沖時(shí)間1 s，間隔時(shí)間 1 s；C 組：脈沖時(shí)間 1 s，間隔時(shí)間 5 s；D 組：脈沖時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s；E 組：超聲假照；各組對(duì)應(yīng)的治療脈沖占空比分別為0.167%、0.100%、0.033%、0.100%和0。治療后即刻再次行超聲造影檢查，方法同前。

3.超聲造影定量分析：使用VINNO 70超聲診療一體機(jī)自帶的超聲造影分析軟件，參考二維圖像勾畫腫瘤區(qū)域，分析60 s 動(dòng)態(tài)造影圖像，通過時(shí)間-強(qiáng)度曲線獲得峰值強(qiáng)度（peak intensity，PI）及曲線下面積（area under curve，AUC），比較各組治療前后 PI 及AUC 變化情況。

4.超聲造影視覺評(píng)分：由兩名超聲科醫(yī)師對(duì)超聲造影圖像進(jìn)行視覺評(píng)分，不一致時(shí)以工作經(jīng)驗(yàn)較長(zhǎng)者的評(píng)分為最終評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，與每個(gè)樣本的治療前造影圖像對(duì)比，治療后造影腫瘤區(qū)域內(nèi)微泡灌注面積、整體亮度及循環(huán)內(nèi)微泡持續(xù)時(shí)間無(wú)明顯變化或減少；1 分，微泡灌注面積、整體亮度及循環(huán)內(nèi)微泡持續(xù)時(shí)間輕度增加；2 分，微泡灌注面積、整體亮度及循環(huán)內(nèi)微泡持續(xù)時(shí)間明顯增加。

5.組織病理檢查：治療結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3 只荷瘤大鼠，在充分麻醉的情況下完整剝離皮下腫瘤組織，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗后用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織微結(jié)構(gòu)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，各組治療前后PI、AUC比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，各組腫瘤超聲造影視覺評(píng)分比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni法矯正P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組治療前后超聲造影定量參數(shù)比較

A、B 組治療后AUC 增加，與治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；各組治療后PI及C、D、E組治療后AUC與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖1，2。

圖1 A組治療前后超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線圖

圖2 B組治療前后超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線圖

表1 各組治療前后超聲造影定量參數(shù)比較（）

表1 各組治療前后超聲造影定量參數(shù)比較（）

與治療前比較，*P<0.05。PI：峰值強(qiáng)度；AUC：曲線下面積

組別A組B組C組D組E組治療后10 413.96±2935.66*9642.06±3222.97*10 145.10±2325.99 9828.32±3433.83 10 562.88±3160.83 PI（dB）治療前107.37±13.05 108.93±20.33 118.55±17.52 113.08±11.05 124.80±14.17治療后115.72±16.96 114.53±16.17 122.65±9.03 120.74±13.13 120.91±13.99 AUC（dB·s）治療前8743.00±3790.47 8118.20±2893.35 9095.03±3018.66 8603.39±2139.50 11 244.94±4172.35

二、各組超聲造影視覺評(píng)分比較

各組超聲造影視覺評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。A、B 組超聲造影視覺評(píng)分均增高，與C、D、E 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2和圖3。

圖3 各組超聲造影視覺評(píng)分

表2 各組超聲造影視覺評(píng)分情況 個(gè)

三、腫瘤組織病理表現(xiàn)

鏡下觀察見腫瘤組織主要由膠質(zhì)瘤細(xì)胞和結(jié)締組織構(gòu)成，膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈條索狀排列，核大、深染，異型性明顯，內(nèi)可見血管穿行。其中，A、B組可見較明顯的血管擴(kuò)張，A 組部分血管周圍組織內(nèi)可見少量紅細(xì)胞滲出，C、D、E組血管擴(kuò)張均不明顯。見圖4。

圖4 各組治療后腫瘤組織病理圖（HE染色，×100）

討 論

惡性腫瘤是對(duì)人類健康威脅最大的疾病之一，其活躍的代謝和快速的細(xì)胞增殖導(dǎo)致血管生成滯后，形成不成熟和畸形的血管，這種血管不具有正常供血功能，將逐步導(dǎo)致腫瘤組織血流灌注不足。同時(shí)，實(shí)體瘤伴隨腫瘤生長(zhǎng)造成局部空間受限，不斷增加的占位效應(yīng)導(dǎo)致空間擠壓，壓迫周圍血管及淋巴管，引起血流灌注下降及淋巴回流障礙，造成局部組織靜水壓升高，進(jìn)一步形成腫瘤內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境［9］。本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠皮下膠質(zhì)細(xì)胞瘤模型可以觀察到腫瘤中心明顯的缺血區(qū)域，較好地還原了惡性腫瘤內(nèi)乏血供狀態(tài)。超聲造影劑微泡是純血池造影劑，經(jīng)靜脈注射后隨血液循環(huán)流動(dòng)而不會(huì)彌散至血管外，是研究組織血流灌注的理想示蹤劑。超聲造影是目前腫瘤臨床診療的重要影像學(xué)檢查方法之一［10］。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)［11］也證實(shí)，超聲造影可提供腫瘤形態(tài)學(xué)及血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)信息，利用超聲造影定量分析獲取的PI 及AUC 可以準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤內(nèi)血流灌注量。本實(shí)驗(yàn)利用超聲造影定量分析評(píng)估腫瘤組織內(nèi)血流灌注狀態(tài)，具有較高的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組治療后PI 與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各組不同聲學(xué)參數(shù)下超聲造影峰值強(qiáng)度變化不明顯。A、B 組治療后AUC 均較治療前增加（均P<0.05），說明腫瘤組織在A、B 組超聲治療作用下血流灌注面積及微循環(huán)開放時(shí)間明顯提升。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，B 組脈沖時(shí)間1 s、間隔時(shí)間1 s、治療脈沖占空比0.100%的條件，可以增加腫瘤組織血流灌注；A 組調(diào)整脈沖時(shí)間為5 s，間隔時(shí)間為1 s，占空比提升至0.167%，同樣具有改善腫瘤組織血供的效果。當(dāng)治療參數(shù)調(diào)整為C 組，即脈沖時(shí)間1 s、間隔時(shí)間5 s、占空比下降至0.033%時(shí)，腫瘤血流灌注改變不明顯。D 組脈沖時(shí)間及間隔時(shí)間均為5 s，與B 組占空比相同，均為0.100%，但D 組治療前后腫瘤組織血流灌注并無(wú)差異性改變。E 組為超聲假照組，假照后腫瘤血供變化不明顯。另外，A、B 組超聲造影視覺評(píng)分均高于其他各組（均P<0.05），說明A、B 組腫瘤組織血流灌注得到明顯改善，與超聲造影定量分析結(jié)果一致。

有研究［12-13］報(bào)道，微泡作為空化核可降低聲壓閾值，在特定強(qiáng)度的超聲輻照下發(fā)生周期性收縮、擴(kuò)張甚至內(nèi)爆等動(dòng)力學(xué)改變，產(chǎn)生瞬態(tài)高溫、高壓、微射流和沖擊波等機(jī)械效應(yīng)及剪切力改變，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活一氧化氮合酶，促進(jìn)內(nèi)皮一氧化氮、前列腺素的產(chǎn)生和釋放，增加剪切依賴性ATP 產(chǎn)生，激活下游多種嘌呤能信號(hào)通路，發(fā)揮擴(kuò)張血管、增加血流灌注的作用?；谏鲜鰴C(jī)制，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)A 組占空比0.167%和B 組占空比0.100%的條件可以對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生足夠的機(jī)械效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)，引發(fā)血管擴(kuò)張，增加腫瘤組織血流灌注；腫瘤組織病理檢查也發(fā)現(xiàn)A、B組血管擴(kuò)張較其他各組更明顯。由于A組占空比相對(duì)B組升高，微泡空化的機(jī)械效應(yīng)加大，造成局部血管壁損傷，導(dǎo)致紅細(xì)胞滲出，故B組超聲治療聲學(xué)參數(shù)相對(duì)A 組更為安全。C 組占空比下降至0.033%，其微泡空化的機(jī)械效應(yīng)較弱，尚不足以引發(fā)擴(kuò)血管效應(yīng)。D組雖然占空比與B 組相同，且脈沖時(shí)間長(zhǎng)于B 組，但其間隔時(shí)間較長(zhǎng)，可能導(dǎo)致微泡空化對(duì)血管壁的機(jī)械作用和剪切力改變“累積效應(yīng)”不足，不能產(chǎn)生足夠引起生物學(xué)效應(yīng)的擴(kuò)血管因子，故未能明顯增強(qiáng)腫瘤血流灌注。E 組作為空白對(duì)照，未施加微泡空化處理，超聲假照后無(wú)明顯血管擴(kuò)張。

本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予一定的間隔時(shí)間，有利于微泡在腫瘤血管中再灌注，在間隔時(shí)間使腫瘤血管中儲(chǔ)存一定數(shù)量的微泡，再發(fā)射治療脈沖引發(fā)微泡空化，血流增強(qiáng)效應(yīng)比較穩(wěn)定。超聲連續(xù)輻照雖然占空比相對(duì)較大，但微泡再灌注數(shù)量不足，導(dǎo)致空化效應(yīng)減弱，不利于改善腫瘤血流灌注。故本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置超聲連續(xù)輻照組，而是重點(diǎn)比較了不同脈沖時(shí)間和間隔時(shí)間組合的差異。另外，本課題組前期研究［8］發(fā)現(xiàn)脈沖長(zhǎng)度3 個(gè)周期、脈沖重復(fù)頻率2 kHz 的超聲治療聲學(xué)參數(shù)可增加腫瘤血流灌注面積，推測(cè)在該參數(shù)下微泡可發(fā)生穩(wěn)態(tài)空化，有利于增強(qiáng)腫瘤血供；當(dāng)脈沖長(zhǎng)度增加至34.5 個(gè)周期、脈沖重復(fù)頻率下降至200 Hz時(shí)腫瘤血流灌注面積減少，推測(cè)較高的脈沖長(zhǎng)度和相對(duì)較低的脈沖重復(fù)頻率條件可能激勵(lì)微泡發(fā)生慣性空化，阻斷了腫瘤血供。本實(shí)驗(yàn)沿用了增強(qiáng)腫瘤血供的超聲治療聲學(xué)參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：①所選超聲治療聲學(xué)參數(shù)目前僅限于大鼠皮下C6 膠質(zhì)細(xì)胞瘤，更換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、腫瘤細(xì)胞或移植瘤部位，相關(guān)參數(shù)可能會(huì)有差異；②影響占空比的聲學(xué)參數(shù)除脈沖時(shí)間和間隔時(shí)間外，頻率、脈沖長(zhǎng)度、脈沖重復(fù)頻率的不同組合，也會(huì)產(chǎn)生不同占空比，且可能發(fā)生參數(shù)間交互作用，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步探究其他參數(shù)對(duì)腫瘤組織血流灌注的影響；③僅對(duì)超聲治療后即刻腫瘤組織血供改變進(jìn)行觀察分析，未進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間、不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量，在后期研究中可進(jìn)一步探索血流增強(qiáng)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間及變化趨勢(shì)。

綜上所述，脈沖時(shí)間5 s、間隔時(shí)間1 s、占空比0.167%及脈沖時(shí)間1 s、間隔時(shí)間1 s、占空比0.100%的低強(qiáng)度診斷超聲聯(lián)合微泡可增強(qiáng)乏血供腫瘤血流灌注，后者為相對(duì)安全的超聲治療聲學(xué)參數(shù)。