董立本，王爽，姜廷波，周博如

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

植物在生長過程中會遇到各種不良的環(huán)境因子，對其生長發(fā)育產(chǎn)生影響［1］。土壤中可溶性鹽分過多，地球干旱和半干旱地區(qū)近一半的土地受鹽堿化影響，因此鹽脅迫已經(jīng)成為影響植物生長及產(chǎn)量的重要因素之一［2］。在高鹽環(huán)境的脅迫下，植物會受到滲透脅迫和離子毒害［3］，還會進一步受到氧化脅迫和營養(yǎng)脅迫［4］。這一系列反應(yīng)會影響細胞的生長代謝，進而影響種子萌發(fā)、幼苗生長與作物產(chǎn)量［5］。植物為抵抗高鹽環(huán)境在形態(tài)、代謝及分子水平上進化出復(fù)雜的應(yīng)對機制，如關(guān)閉氣孔、減少葉片數(shù)和葉面積、Na+和Cl-外排及區(qū)隔化和活性氧清除等［6-7］。當受到高鹽脅迫時，植物激活轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄并調(diào)控下游基因表達以應(yīng)對脅迫的影響［8］。在植物中有許多應(yīng)答鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子家族［9］，比如NAC、NFY、HSF、bZIP、MYB、bHLH、ERF 和WRKY 等。

bHLH 是主要存在于真核生物中的一類堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［10］，在植物體內(nèi)部是除了MYB 家族外最大的轉(zhuǎn)錄因子家族。bHLH家族的成員具有兩個不同功能的保守結(jié)構(gòu)域，分別是氨基末端的DNA 結(jié)合域以及羧基末端HLH結(jié)構(gòu)域［11］。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子可在植物中起到多種作用，如植物的生長發(fā)育［12-13］、合成次生代謝產(chǎn)物［14］、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［15-17］以及植物器官形態(tài)建成等。另外bHLH 家族基因也參與植物響應(yīng)非生物脅迫過程。例如，在煙草中過表達NtbHLH123可以通過激活氧化酶NtRbohE的表達來提高其耐鹽性［18］。蘋果MdCIB1基因在干旱脅迫下發(fā)揮正調(diào)控 作 用［19］。甜菜bHLH113、bHLH137在 鹽 脅 迫12h 后表達量均明顯上調(diào)，且蛋白互作分析結(jié)果表明甜菜中與鹽脅迫應(yīng)答有關(guān)的基因可能參與了ABA 逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而調(diào)控甜菜在鹽脅迫下的生長發(fā)育［20］。

小黑楊（Populus simonii×P. nigra）是速生豐產(chǎn)人工林廣泛種植樹種之一，從黑龍江省至黃河流域均可栽植［21］。因其生長速度快、對環(huán)境適應(yīng)性強、材質(zhì)好且抗逆能力優(yōu)異［22］，是東北地區(qū)的推廣品種。本研究對小黑楊PsnbHLH35基因進行克隆，通過生物信息學(xué)分析的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、鑒定PsnbHLH35保守結(jié)構(gòu)域。同時對該基因在鹽脅迫條件下的時空表達模式、蛋白的亞細胞定位與自激活活性進行研究。為小黑楊抗逆分子育種提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料小黑楊來自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室。在（25±2）℃，相對濕度60%～70%下培養(yǎng)1 個月，選擇健壯的組培苗，用流水將根部培養(yǎng)基洗凈，在水中繼續(xù)培養(yǎng)1 個月，用0.15 mol·L-1NaCl 溶液分別處理0、3、6、12、24、48h 且每個時間點進行3 次生物學(xué)重復(fù)，用于分析鹽脅迫下bHLH35基因的組織表達差異。

1.2 試驗方法

1.2.1 構(gòu)建pMD19-T-PsnbHLH35 載體

使用試劑盒提取小黑楊總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在Phytozome 數(shù)據(jù)庫中查找楊樹bHLH35基因序列并以此設(shè)計小黑楊PsnbHLH35引物bHLH35-F、bHLH35-R（表1），以反轉(zhuǎn)錄得到 的cDNA 為 模 板，bHLH35-F 和bHLH35-R 為引物，進行PCR 擴增［23］。將目的條帶回收后，把pMD19-T 載體、反應(yīng)緩沖液和膠回收產(chǎn)物按照相應(yīng)體系混合，構(gòu)建pMD19-T-PsnbHLH35 載體并送至生物公司檢測。測序結(jié)果正確的菌液提取pMD19-T-PsnbHLH35 質(zhì)粒。

1.2.2PsnbHLH35啟動子生物信息學(xué)分析

通過CTAB 方法提取小黑楊的DNA，調(diào)取毛果楊中bHLH35基因上游約1600 bp 的啟動子序列，參考選取的毛果楊bHLH35啟動子序列設(shè)計引物QDZ-bHLH35-F、QDZ-bHLH35-R（表1），以小黑楊的DNA 為模板進行PCR 擴增。將啟動子構(gòu)建于pMD19-T 載體并送測。使用Plant CARE 數(shù)據(jù)庫預(yù)測PsnbHLH35基因啟動子序列中的順式作用元件。

表1 PsnbHLH35 基因引物Table 1 Primers for PsnbHLH35 gene

1.2.3PsnbHLH35基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy（http：//web. expasy. org /protparam/）中Protparam 程 序 分 析PsnbHLH35氨 基酸 的 理 化 性 質(zhì)［23］；使用SignalP 5.0（https：//ser-vices. healthtech. dtu. dk/service. php？ SignalP-5.0）預(yù)測PsnbHLH35氨基酸信號肽；通過SOMPA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_sopma. html）分 析Psnb-HLH35蛋白的二級結(jié)構(gòu)；最后利用在線軟件SWISS model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測PsnbHLH35蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

1.2.4PsnbHLH35同源序列比對

利 用PlantTFDB（http：//planttfdb. gao-lab.org/）查找bHLH 家族氨基酸序列，查找文獻選取bHLH 家族中與bHLH35相似度高的蛋白序 列［11］與PsnbHLH35序列進行多序列比對，使用MEGA X 繪制Neighbor-Joining Tree 進化樹［24］。用DNAMAN 查找比對蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5PsnbHLH35轉(zhuǎn)錄因子自激活活性分析

根據(jù)測序正確的PsnbHLH35基因序列設(shè)計帶有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點的引物，bHLH35-BD-F、bHLH35-BD-R（表1），以構(gòu)建好的pMD19-T-PsnbHLH35 質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，構(gòu)建pGBKT7-bHLH35 載體并送去生物公司測序。提取測序正確的pGBKT7-bHLH35 質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入Y2H 酵母感受態(tài)細胞，涂于SD/-Trp培養(yǎng)基中后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d 后挑取單菌落在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 培養(yǎng)基上劃線，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，并觀察其生長情況。

1.2.6PsnbHLH35蛋白亞細胞定位

根據(jù)已經(jīng)測序成功的PsnbHLH35基因的ORF 全長去除終止子序列設(shè)計加入Spe Ⅰ酶切位點的引物bHLH35-GFP-F、bHLH35-GFP-R（表1）。以提取的pMD19-T-PsnbHLH35 質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增，將PCR 產(chǎn)物回收用于構(gòu)建pBI121-bHLH35-GFP 載體并將其送往生物公司測序。測序結(jié)果正確的菌液提取重組質(zhì)粒pBI121-bHLH35-GFP。 將 pBI121-bHLH35-GFP 質(zhì)粒與pBI121-GFP 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中。獲得的菌液經(jīng)處理后分別注射到3 周齡的健康本氏煙草葉片中，在溫度25 ℃、空氣濕度為70%的條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)24～48 h。將注射后的煙草葉片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，得到PsnbHLH35在細胞中的表達部位。

圖1 小黑楊PsnbHLH35 基因PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of PsnbHLH35 gene

1.2.7PsnbHLH35組織表達特異性分析

取小黑楊組培苗，在相對濕度60%、光照16 h/暗處理8 h、溫度25 ℃的條件下水培1 個月。用0.15 mol·L-1NaCl 處理0、3、6、12、24、48 h 后將根、葉用液氮速凍-80℃保存。

用CTAB 法提取處理后的樣本RNA 并進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)PsnbHLH35基因的序列信息，在非保守結(jié)構(gòu)域處設(shè)計熒光定量引物qPCR-bHLH35-F、qPCR-bHLH35-R，以Actin-F、Actin-R 為內(nèi)參引物（表1），進行熒光定量PCR，并將結(jié)果用2-ΔΔCt算法處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD19-T-PsnbHLH35 載體構(gòu)建

以小黑楊cDNA 為模板，克隆PsnbHLH35序列，擴增出長度為735 bp 的條帶，膠回收后將回收產(chǎn)物連接pMD19-T 載體，測序結(jié)果正確，-80 ℃保存。

2.2 PsnbHLH35 啟動子及基因生物信息學(xué)分析

2.2.1PsnbHLH35啟動子順式作用元件預(yù)測

以小黑楊的cDNA 為模板，克隆PsnbHLH35基因。以小黑楊的DNA 為模板經(jīng)PCR 反應(yīng)擴增克隆出bHLH35基因上游1600 bp 的啟動子序列。經(jīng)Plant CARE 預(yù)測后，得知bHLH35基因的啟動子序列中除去核心啟動子元件外，還包含其它脅迫應(yīng)答元件（表2），說明PsnbHLH35可能與植物應(yīng)答脅迫相關(guān)。

表2 PsnbHLH35 啟動子克隆序列分析Table 2 Cloning sequence analysis of PsnbHLH35 promoter

2.2.2PsnbHLH35蛋白的理化性質(zhì)使用ExPASy ProtParam 預(yù)測分析，Psnb-

HLH35編碼蛋白大小244 aa，其分子式為C1217H1963N335O397S11，相對分子質(zhì)量27.992 64，理論等電點5.25；PsnbHLH35不穩(wěn)定指數(shù)為47.51，為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白的脂溶指數(shù)是80.37，平均親水性系數(shù)為-0.639，小于0，認為PsnbHLH35 蛋白為親水蛋白。

2.2.3 PsnbHLH35 蛋白的信號肽預(yù)測

用SignalP 5.0 Server 在線軟件進行信號肽預(yù)測，發(fā)現(xiàn)PsnbHLH35不存在信號肽（表3）。

表3 PsnbHLH35 蛋白的信號肽預(yù)測結(jié)果Table 3 Signal peptide prediction results of PsnbHLH35 protein

2.2.4 PsnbHLH35 蛋白結(jié)構(gòu)分析

SOPMA 結(jié)果表明PsnbHLH35的二級結(jié)構(gòu)由54.51%的α-螺旋、2.05%的β-折疊、34.43%的無規(guī)則卷曲和9.02%的延伸鏈所構(gòu)成（圖2）。使用SWISS model 預(yù)測PsnbHLH35 蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖3），該蛋白的三級結(jié)構(gòu)為堿性區(qū)域和“α 螺旋1-環(huán)-α 螺 旋2”。PsnbHLH35 的 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 符 合bHLH 結(jié) 構(gòu) 特 點，表 明PsnbHLH35屬 于bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族。

圖2 PsnbHLH35 蛋白二級結(jié)構(gòu)分布Fig.2 Secondary structure distribution of PsnbHLH35 protein

圖3 PsnbHLH35 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Prediction map of PsnbHLH35 protein tertiary structure

2.3 PsnbHLH35 同源序列比對

利用DNAMAN 查找并比對PsnbHLH35與楊樹bHLH 家族成員的保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。利用MEGA Ⅹ構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖5）。結(jié)果表明，PsnbHLH35保守結(jié)構(gòu)域及氨基酸序列與其它bHLH家族蛋白高度相似，屬于bHLH 家族并可能具有相似的功能。

圖4 PsnbHLH35 保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conservative domain analysis of PsnbHLH35

圖5 PsnbHLH35 系統(tǒng)進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of PsnbHLH35

2.4 PsnbHLH35 轉(zhuǎn)錄因子自激活活性分析

將PsnbHLH35構(gòu)建中在pGBKT7 載體中，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細胞中（圖6），轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的Y2H 酵母細胞能夠在SD/-Trp 培養(yǎng)基上生長，但無法在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 培養(yǎng)基生長，說明PsnbHLH35轉(zhuǎn)錄因子不具有自激活活性。

圖6 PsnbHLH35 自激活活性檢測Fig.6 Detection of transcriptional activation activity of PsnbHLH35

2.5 PsnbHLH35 亞細胞定位

將 攜 帶 pBI121-bHLH35-GFP 質(zhì) 粒 與pBI121-GFP 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液經(jīng)處理后注入健康的煙草葉片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到熒光反應(yīng)的位置（圖7）。試驗表明PsnbHLH35為核定位蛋白，與網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果一致。

圖7 PsnbHLH35 亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of PsnbHLH35

2.6 PsnbHLH35 組織表達特異性分析

在水培條件下，PsnbHLH35在根和葉中的表達量無明顯差異，而在0.15 mol·L-1NaCl 的脅迫下該基因在不同時間點均上調(diào)表達，并具有組織特 異 性。 在0.15 mol·L-1NaCl 脅 迫 下，Psnb-HLH35在根的表達量在脅迫后逐漸增加，在48 h達到最大值，較對照升高了約4.53 倍；在葉中12 h表達量最高，為對照組的4.89 倍，后逐漸下降，48 h 時為對照組的2.17 倍，呈先升后降的趨勢（圖8）。

圖8 鹽脅迫下PsnbHLH35 的時空表達模式分析Fig.8 Changes of PsnbHLH35 gene expression in different tissues under salt stress at different times

3 討論

本研究通過Phytozome 在線網(wǎng)站參考毛果楊bHLH35基因序列，設(shè)計小黑楊PsnbHLH35基因的特異性引物，克隆并獲得全長為735 bp 的Psnb-HLH35基因。對其上游啟動子進行預(yù)測分析后，發(fā)現(xiàn)該基因除去含有核心啟動元件外，還涉及光脅迫應(yīng)答元件、ABA 應(yīng)答脅迫元件、參與MeJA 反應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件等多種脅迫應(yīng)答元件。說明該基因在植物應(yīng)答各種脅迫過程中可能參與多種應(yīng)答反應(yīng)并發(fā)揮作用。PsnbHLH35 蛋白由244個氨基酸組成，具有親水性，沒有信號肽。通過與其它13 個楊樹bHLH 家族基因的氨基酸序列比對，結(jié)果顯示PsnbHLH35和它們具有極高的相似度，且在51～110 個氨基酸處存在60 個氨基酸組成的bHLH 保守結(jié)構(gòu)域；利用SWISS model 在線軟件對PsnbHLH35蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白含有bHLH 轉(zhuǎn)錄因子特有的堿性區(qū)域和“α 螺旋1-環(huán)-α 螺旋2”結(jié)構(gòu)。bHLH 家族在植物中廣泛存在并在參與植物代謝活動，細胞生長分化以及對生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答［25］。毛竹bHLH 家族啟動子序列包含許多應(yīng)答脅迫的元件，說明bHLH 家族可能與應(yīng)答脅迫相關(guān)。在毛竹中鑒定出來的137 個bHLH 基因中，有13 個基因響應(yīng)干旱脅迫，13 個基因響應(yīng)鹽脅迫，表示其功能涉及干旱或鹽脅迫應(yīng)答［26］。在試驗中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下PsnbHLH35的表達量呈顯著性差異，其中在根中48 h表達量最高，上調(diào)表達了4.53 倍；在葉中表達量逐漸增加，12h 時達到峰值4.89 倍，后續(xù)又逐漸下降。因此，我們推測PsnbHLH35參與到了非生物脅迫響應(yīng)過程中。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)與DNA 結(jié)合區(qū)是轉(zhuǎn)錄因子的主要功能結(jié)構(gòu)，部分轉(zhuǎn)錄因子同時含有兩個DNA 結(jié)合區(qū)［27］，而個別轉(zhuǎn)錄因子甚至沒有DNA 結(jié)合區(qū)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)［28］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定轉(zhuǎn)錄因子功能的差異，DNA 結(jié)合區(qū)能夠識別DNA 順式作用元件并與之結(jié)合［29］。利用酵母雙雜交試驗檢測出該基因不具有自激活活性。亞細胞定位結(jié)果表明，該基因定位于細胞核中，符合大部分轉(zhuǎn)錄因子所具有的特性。前人的研究顯示bHLH35不僅參與到了植物的根和葉生長發(fā)育中，而且該基因也參與到了非生物脅迫的響應(yīng)中。例如，在擬南芥中通過解剖學(xué)和生理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AtbHLH35過表達植株通過增大氣孔密度、減小氣孔孔徑、降低蒸發(fā)率和水損失、增加葉綠素含量以及提高光合作用率來獲得更好的抗旱能力［30］。在水稻中，過表達OsbHLH035的 植 株 通 過 下 調(diào)OsABA2和OsAAO3基因表達來減少ABA 合成，并上調(diào)OsABA8ox1的表達來提高ABA 分解代謝，最終達到減輕鹽脅迫下ABA 對發(fā)芽抑制的作用［31］。因此推測PsnbHLH35具有調(diào)控植物抗鹽脅迫和干旱脅迫的功能。

4 結(jié)論

本研究以小黑楊為研究對象，以提取出的小黑楊cDNA 為模板，克隆獲得735 bp 的Psnb-HLH35基因。對PsnbHLH35進行理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化樹的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其符合bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子特點。克隆獲得Psnb-HLH35啟動子并對啟動子元件進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因與植物抗逆功能相關(guān)。 構(gòu)建pGBKT7-bHLH35 載體進行自激活活性分析發(fā)現(xiàn)其不具有自激活活性。亞細胞定位結(jié)果表明PsnbHLH35定位于細胞核中。組織特異性分析結(jié)果顯示鹽脅迫下PsnbHLH35在根與葉中表達量較未脅迫有顯著提升，推測該基因與植物滲透調(diào)節(jié)相關(guān)，為后續(xù)培育轉(zhuǎn)基因植株與生物學(xué)機制研究提供理論基礎(chǔ)。