冉興榮，伏曉玉，鐵雅楠，王欣榮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

對(duì)雌性哺乳動(dòng)物注射促性腺激素會(huì)使其卵巢中較多的卵泡發(fā)育并誘發(fā)排卵，此方法為超數(shù)排卵，簡(jiǎn)稱超排［1］。超數(shù)排卵是獲取大量卵子或胚胎的有效途徑之一，且雌性動(dòng)物的超數(shù)排卵效果受到動(dòng)物個(gè)體自身的遺傳、體況、年齡、發(fā)情周期階段、卵巢功能等多種因素的影響［2］。超排技術(shù)作為快速獲得卵子或胚胎的有效手段，隨著科學(xué)研究和動(dòng)物生產(chǎn)的需要逐漸被應(yīng)用到更多的領(lǐng)域中，并且通過與胚胎移植技術(shù)的結(jié)合，對(duì)畜牧業(yè)的高效生產(chǎn)帶來了革命性的變化。孕馬血清促性腺激素（PMSG），也稱為馬絨毛膜促性腺激素，具有促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）的雙重活性，并且有著比FSH更低的生產(chǎn)成本，因此常用來代替FSH作為超排常用的激素之一。但PMSG的化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，有更長(zhǎng)的半衰期，在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，特別在使用大劑量外源性PMSG進(jìn)行超排處理時(shí)，會(huì)引起母畜諸多卵巢疾病，從而影響超排后的卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量［3-5］。動(dòng)物超排所用到的FSH和PMSG的處理方法已在牛、馬、羊、兔、小鼠等開展了大量研究，且不同物種之間的效果差異很大。家兔作為生物學(xué)試驗(yàn)常用的動(dòng)物，前人已經(jīng)使用了不同的處理方法，對(duì)多個(gè)家兔品種的卵巢排卵點(diǎn)數(shù)、充血卵泡數(shù)、排卵數(shù)等的超排效果開展了研究，篩選出適合在生產(chǎn)中應(yīng)用的超排激素劑量。但對(duì)于一些特定品種如獺兔的研究，特別是超排后胚胎質(zhì)量的研究報(bào)道尚不多見。本試驗(yàn)對(duì)成年健康獺兔注射不同劑量PMSG進(jìn)行超排處理，通過測(cè)定其平均排卵點(diǎn)數(shù)、充血卵泡數(shù)、胚胎收集數(shù)、胚胎畸形率等指標(biāo)，比較在不同PMSG劑量下獺兔的超排效果，探討外源生殖激素對(duì)獺兔卵巢發(fā)育及胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響，為在生產(chǎn)實(shí)踐中制定科學(xué)的超排方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇體質(zhì)量3~4 kg，7~8月齡獺兔母兔18只，以及體質(zhì)量4~5 kg，9~10月齡獺兔公兔6只。所有試驗(yàn)動(dòng)物均已達(dá)到性成熟，單籠飼養(yǎng)。孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）均購自寧波第二激素廠。PBS沖卵液（PBS，100 IU/mL青霉素鈉，100 IU/mL硫酸鏈霉素，1%FBS）購自美國(guó)ICP公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)獺兔的分組 將獺兔隨機(jī)分為3組，分別為Ⅰ組（50 IU PMSG+100 IU hCG）、Ⅱ組（100 IU PMSG+100 IU hCG）和Ⅲ組（150 IU PMSG+100 IU hCG），每組6只母兔。

1.2.2 超數(shù)排卵處理方法 用1 mL注射器吸取相應(yīng)劑量的PMSG，在獺兔大腿內(nèi)側(cè)肌注，72 h后同法注射100 IU hCG，隨后與公兔1∶1合籠，自然交配，誘導(dǎo)其排卵及受精。

1.2.3 卵泡發(fā)育及胚胎的采集觀察 交配24 h后的母兔用耳緣靜脈注射空氣法處死，實(shí)驗(yàn)室解剖后取出輸卵管和卵巢。首先觀察卵巢發(fā)育狀況，記錄卵巢上的排卵點(diǎn)數(shù)、卵泡囊腫數(shù)以及充血卵泡數(shù)。剝離卵巢與輸卵管連接處，將提前制備好的沖卵針從宮管結(jié)合處靠近子宮角方向約1 cm處刺入，將針頭預(yù)埋在輸卵管中，并用止血鉗固定好針頭。手持輸卵管，在輸卵管傘部下放置60 mm規(guī)格的一次性無菌培養(yǎng)皿，緩慢推入PBS沖卵液沖卵。將盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于體視顯微鏡下觀察，按照胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)方法［6］，記錄優(yōu)質(zhì)胚胎與劣級(jí)胚胎數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行整理，然后采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)結(jié)果用±s標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量的PMSG對(duì)獺兔超數(shù)排卵的影響

由表1可知，Ⅰ組平均排卵點(diǎn)數(shù)和平均胚胎收集數(shù)均高于Ⅲ組（P<0.05）；Ⅲ組平均卵泡囊腫數(shù)顯著高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ組平均充血卵泡數(shù)顯著高于Ⅱ組，且Ⅱ組顯著高于Ⅰ組（P<0.05）。

表1 不同劑量PMSG對(duì)獺兔超數(shù)排卵的影響Table 1 Effects of different doses of PMSG on superovulation in rex rabbits

2.2 不同劑量的PMSG對(duì)獺兔早期胚胎質(zhì)量的影響

由表2和圖1可知，Ⅰ組平均可用胚胎數(shù)顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P<0.05），Ⅲ組胚胎畸形率顯著高于Ⅱ組，且Ⅱ組顯著高于Ⅰ組（P<0.05）。由圖2可知，A~C組分別為Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組獺兔超數(shù)排卵處理下獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎，D~F組為劣質(zhì)胚胎。由A~C圖可見，Ⅰ組沖得的胚胎結(jié)構(gòu)完整清晰，層黏蛋白顏色通透，且隨著PMSG劑量的增加，胚胎結(jié)構(gòu)有畸形改變的趨勢(shì)。D~F組胚胎結(jié)構(gòu)模糊不規(guī)則，細(xì)胞核隨著PMSG劑量的上升均出現(xiàn)不同程度的碎裂變形。

圖1 不同劑量PMSG對(duì)獺兔超數(shù)排卵回收率與畸形率的影響Figure 1 Effect of different doses of PMSG on retrieving rate and malformation rate of embryos under superovulation in rex rabbits

圖2 沖胚操作獲得的1-細(xì)胞期胚胎Figure 2 1-cell stage embryos obtained during flushing operation.

表2 不同劑量PMSG對(duì)獺兔早期胚胎發(fā)育的影響Table 2 Effects of different doses of PMSG on early embryonic development of rex rabbits

3 討論

不同劑量外源激素對(duì)獺兔的超數(shù)排卵效果具有一定的影響。Kennelly［7］指出，高劑量外源激素導(dǎo)致的卵子減少是因?yàn)槿杂胁糠致炎託埩粼诼雅莓?dāng)中。王田娟等［8］研究發(fā)現(xiàn)，用FSH、HMG（人絕經(jīng)尿促性素）和PMSG分別與hCG組合對(duì)家兔進(jìn)行超數(shù)排卵對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，PMSG試驗(yàn)組出現(xiàn)大量充血卵泡和囊腫，而同劑量的FSH組和HMG組較少。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，Ⅱ組和Ⅲ組的平均充血卵泡數(shù)和平均卵泡囊腫數(shù)顯著高于Ⅰ組，可能是由于PMSG半衰期長(zhǎng)，在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間殘留難以代謝出去，大劑量使用后會(huì)產(chǎn)生不良效應(yīng)，這與李存欣［9］等在用PMSG對(duì)獺兔超數(shù)排卵后的結(jié)果一致，超排處理后的獺兔充血卵泡數(shù)顯著增加。

動(dòng)物的性活動(dòng)主要受垂體的控制，通過人工注射外源性激素彌補(bǔ)了母畜內(nèi)源性激素分泌量的不足，從而達(dá)到超數(shù)排卵的目的。本研究中Ⅰ組母兔的排卵點(diǎn)數(shù)顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組，說明低劑量的外源激素能夠在一定程度上減少卵巢中同一時(shí)期的卵泡閉鎖現(xiàn)象，促使卵巢內(nèi)的更多卵泡發(fā)育并排卵，這與林峰［10］等用PMSG對(duì)母兔進(jìn)行超數(shù)排卵處理后的結(jié)果一致。但隨著激素劑量的不斷增加，卵巢出現(xiàn)了不同程度的“過刺激炎癥反應(yīng)”，具體表現(xiàn)在Ⅱ組、Ⅲ組充血卵泡數(shù)和卵泡囊腫數(shù)明顯高于Ⅰ組。毛冠平等［11］分別用50 IU和100 IU 2種劑量對(duì)成年哈白兔進(jìn)行超數(shù)排卵后發(fā)現(xiàn)，充血卵泡和囊腫卵泡液都逐漸增多。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是接受了外源性激素處理的母兔卵巢，由于過高的激素水平使得卵巢上大量卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，卵巢上的血管增生，基質(zhì)增加，卵巢體積逐漸增大［8］。且PMSG的LH作用使卵巢上卵泡血管擴(kuò)張，內(nèi)壓升高，毛細(xì)血管破裂，導(dǎo)致內(nèi)膜、顆粒膜破裂，血液流入管腔，形成大量充血卵泡。因此本研究結(jié)果也佐證了相關(guān)報(bào)道［12-13］。除此之外，為保證超數(shù)排卵效果，也需要注意激素之外的其他影響因素。例如，根據(jù)母兔的發(fā)情鑒定標(biāo)準(zhǔn)，需確保在注射hCG前母兔處于發(fā)情期。因母兔繁殖特點(diǎn)的特殊性，為確保母兔能夠成功排卵并受精，且胚胎的質(zhì)量不受精液品質(zhì)的影響，與母兔同籠交配的公兔需選取成年健壯、爬跨反應(yīng)較好者。同時(shí)也要考慮輸卵管沖胚操作的影響，胚胎離開母體生理環(huán)境后較為脆弱，因此對(duì)外界環(huán)境的要求較高，PBS沖卵液只能提供胚胎臨時(shí)的營(yíng)養(yǎng)供給，為避免人為因素和環(huán)境的變化對(duì)胚胎造成畸形，應(yīng)在體視顯微鏡下迅速對(duì)含有胚胎的沖卵液進(jìn)行挑選評(píng)級(jí)。

在相同激素水平下，注射劑量較低時(shí)不足以引起卵泡發(fā)育而排卵，當(dāng)增加激素劑量，排卵率會(huì)隨著劑量的上升而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但過高的激素水平又會(huì)導(dǎo)致卵巢變態(tài)發(fā)育，卵泡無法排卵，導(dǎo)致超數(shù)排卵效果較差［14］。張金友等［15］用4種不同劑量PMSG對(duì)日本大耳超排后發(fā)現(xiàn)，隨著激素劑量的上升，充血卵泡中的顆粒細(xì)胞層數(shù)和直徑明顯增加。因此，要想獲得較好超數(shù)排卵效果，必須綜合考慮影響超數(shù)排卵的因素，選擇適宜的激素劑量［16-18］。本試驗(yàn)結(jié)果證明，Ⅰ組超數(shù)排卵效果較好，可能是該劑量在獺兔超數(shù)排卵的適宜劑量范圍之內(nèi)，促使更多的卵泡啟動(dòng)發(fā)育，在卵泡能夠成熟排卵的同時(shí)，減弱了PMSG對(duì)卵巢的副作用。另外通過本研究可知，經(jīng)過超數(shù)排卵后的胚胎細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)畸形的情況，但PMSG劑量的不同，畸形的程度也不同。曹君君［19］同劑量的PMSG對(duì)日本大耳兔進(jìn)行超排后發(fā)現(xiàn)，超排獲得的胚胎質(zhì)量參差不齊，在交配后72 h所獲得的胚胎透明帶明顯彎曲變形，胚胎形狀不規(guī)則，且占所收集胚胎的30%以上。陳現(xiàn)偉等［20］應(yīng)用FSH+LH組合對(duì)家兔超數(shù)排卵處理，在配種后32～40 h采卵并選擇發(fā)育良好的胚胎進(jìn)行移植，發(fā)現(xiàn)胚胎移植成功率為58.02%，且所產(chǎn)仔兔體征健康。吳海鳳等［21］用PMSG對(duì)6周齡的羔羊超數(shù)排卵后發(fā)現(xiàn)，PMSG對(duì)早期胚胎的體外發(fā)育能力影響較大，但仍有11.4%的受精卵可發(fā)育至2細(xì)胞胚胎期。此外，相關(guān)研究報(bào)道［22］指出，對(duì)母畜進(jìn)行超數(shù)排卵處理后獲得的胚胎或卵子質(zhì)量，會(huì)出現(xiàn)不同程度的畸形發(fā)育，且畸形率隨劑量的增大而增加，在PMSG、FSH和HMG 3種激素的處理下，PMSG處理后的胚胎畸形率最高，胚胎移植后妊娠率最低，且伴隨著高劑量外源激素的超數(shù)排卵處理，對(duì)受體母畜的移植效果都不理想。排除受體母畜的飼養(yǎng)管理或遺傳因素，分析可能的原因，是由于PMSG在母畜體內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)，后效應(yīng)嚴(yán)重，高劑量的外源激素使卵巢的“過刺激炎癥反應(yīng)”加劇，卵子發(fā)育環(huán)境的變化導(dǎo)致排出卵子的結(jié)構(gòu)被破壞。

外源激素的正確使用是實(shí)現(xiàn)超數(shù)排卵技術(shù)的根本，但激素含量也決定著母體整個(gè)生殖活動(dòng)的調(diào)控。本試驗(yàn)對(duì)獺兔注射50 IU PMSG和100 IU hCG的組合雖然能獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)胚胎，但也無法避免畸形胚胎的產(chǎn)生。有研究表明［23］，是由于外源激素的刺激使得卵子發(fā)育環(huán)境異常所致。PMSG所具有的LH效應(yīng)也會(huì)影響卵子的質(zhì)量，最終導(dǎo)致精卵結(jié)合后胚胎發(fā)育的異常。對(duì)于畸形胚胎結(jié)構(gòu)異常的變化程度是否和外源激素的劑量有關(guān)，還需進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

在獺兔超數(shù)排卵處理中，高劑量的PMSG會(huì)使卵巢出現(xiàn)過刺激炎癥反應(yīng)，降低超數(shù)排卵效果并導(dǎo)致胚胎畸形率增高，從而影響胚胎質(zhì)量。在生產(chǎn)實(shí)踐中，建議使用50 IU PMSG+100 IU hCG的超排處理組合，可取得較好效果。