周勇軍，周強

（閩南科技學院生命科學與化學學院，福建 泉州 362332）

大黃魚（Larimichthy scrocea）鱸形目、石首魚科、黃魚屬，是中國傳統(tǒng)海水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類［1］。低溫冷藏是水產(chǎn)品主要的貯藏保鮮方式之一，但低溫下，大黃魚極易受腐敗微生物、內(nèi)源酶及脂質氧化等作用影響而引起腐敗變質［2］。目前，國內(nèi)外學者對防止大黃魚腐敗變質及脂肪氧化等品質劣化問題做了大量研究工作。趙思敏等［3］研究表明流化冰對大黃魚預冷和保鮮效果比傳統(tǒng)碎冰具有明顯優(yōu)勢。而郭儒岳等［4］指出流化冰可有效縮短冷卻時間并延長大黃魚貨架期。學者也嘗試應用各類生物保鮮劑輔助低溫對各類水產(chǎn)品進行保鮮處理，如乳酸鏈球菌素［5］、茶多酚［6］、龍須菜寡糖［7］、海藻酸鈉［8］。檸檬醛是從山蒼子（Litsea cubeba（Lour.）Pers.）、檸檬草（Cymbo?pogon citratus（DC.））、垂葉香矛（Mosla chinensis Maxim）等芳香植物中提取出的具有揮發(fā)性、濃郁香味的脂溶性天然混合物［9］，孟玉霞等［10］研究指出檸檬醛可有效抑制大黃魚腐敗菌并維持其感官品質。殼聚糖屬生物保鮮劑，具有良好的成膜特性和抑菌性能［11-12］。主成分分析為一種降維分析法，通過保留重要信息并對降維后的特征向量進行線性變換，將原來的多個指標組合成幾個綜合指標，旨在用較少的綜合指標來反映原始指標信息［13］。國內(nèi)外報道集中探討了植物精油對各類腐敗微生物的抑制作用，而對于檸檬醛-殼聚糖復合保鮮液協(xié)同流化冰應用于大黃魚貯藏保鮮還鮮有報道。本研究引入檸檬醛作為抑菌劑及抗氧化劑，以殼聚糖作為抑菌基底液，制備檸檬醛-殼聚糖復合保鮮液，流化冰（-3℃）貯藏大黃魚，探究檸檬醛-殼聚糖（生物復合保鮮）與流化冰（物理保鮮）協(xié)同作用對大黃魚貯藏品質的影響，為大黃魚低溫儲運提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮大黃魚，購自寧德海蒙正宗霞浦野生海鮮批發(fā)市場，挑選個體適中，質量為（200±20）g無損傷的大黃魚，體表光滑且有光澤，鮮活運輸至實驗室。

1.2 主要儀器

DHP-9227型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海捷呈實驗儀器有限公司；BSP-150實驗室培養(yǎng)箱：北京海天友誠科技有限公司；PB-10臺式數(shù)顯酸度計：上海諾萱科學儀器有限公司；LC-760液相色譜儀：武漢美睿儀器有限公司；RF-1000-SP流化冰生成機：江蘇南通瑞友工貿(mào)有限公司；UV3802S紫外可見分光光度計：華威科創(chuàng)（武漢）科技有限公司等。

1.3 試劑

殼聚糖（脫乙酰度85%，分子量20萬U），中山市華中食品添加劑有限公司；檸檬醛，江西吉安中香天然植物精油有限公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒，購自南京建成生物。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等為生化試劑，硼酸、甲基紅、乙醇、氯化鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉、鄰苯二酚、磷酸二氫鈉等為分析純，均購自國藥集團。

1.4 原材料的處理

流化冰制備：首先配制3.0 mg/L NaCl鹽度計校準液，后采用流化冰生成機制備流化冰固液混合相（體積分數(shù)80%顆粒狀冰塊與體積分數(shù)20%水），備用［14］。

稀冰醋酸浸漬液制備：量取10 mL2.0%冰醋酸置于1 000 mL容量瓶，并采用蒸餾水定容，后置于4℃冰箱冷藏備用。

殼聚糖保鮮涂膜液制備：稱量20.0 g殼聚糖，加入10 mL 2.0%冰醋酸，用蒸餾水定容至1 000 mL，置于4℃的冰箱里備用。

檸檬醛-殼聚糖復合保鮮液制備：稱量20.0 g殼聚糖，加入10 mL 2.0%冰醋酸溶解，添加0.25 mL檸檬醛搖勻，用蒸餾水定容至1 000 mL，制備0.025%檸檬醛（v/v）-2%殼聚糖（w/v）復合保鮮液，置于4℃的冰箱里備用。

挑選完整、大小均一的新鮮大黃魚冰水猝死，去內(nèi)臟后采用無菌超純水清洗至無血水，置于無菌紗布上瀝干，整魚大小約25.0 cm×6.0 cm×2.5 cm，備用，隨機分為3組。對照組：采用稀冰醋酸浸漬10 min，于流化冰（-3±0.5）℃貯藏（流化冰∶魚=3∶1（V/V））；處理組A：殼聚糖浸漬涂膜10 min，于流化冰（-3±0.5）℃貯藏（本試驗采用-3℃能較好的保持流化冰兩相穩(wěn)定性）；處理組B：0.025%檸檬醛-殼聚糖涂膜10 min，撈出后稍晾干，添加流化冰保鮮處理（-3±0.5）℃貯藏。

所有處理的流化冰每12 h更換一次，每組設3個平行樣，每隔3 d測量指標數(shù)據(jù)，試驗重復3次。

1.5 指標測定

pH值測定：pH值變化可反映肉類產(chǎn)品腐敗變質程度，參照張寧寧等［15］的方法測定；揮發(fā)性鹽基氮測定（TVB-N）：TVB-N指動物性食品由于酶和細菌分解蛋白質產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質，為原料魚和肉類的主要鮮度指標，參照劉文麗等［16］的方法，采用擴散皿法進行TVB-N測定；菌落總數(shù)測定：菌落總數(shù)測定可用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質量，參照《GB 4789.2-2016食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》測定；K值測定：K值是魚類早期鮮度的重要指標，為次黃嘌呤和次黃嘌呤核苷之和與腺苷三磷酸及其分解物總量比值的百分率，參照Yoloyama等［17］的方法測定；鹽溶性蛋白溶出比測定：鹽溶性蛋白溶出比反映了蛋白質的變性程度，參照遲海等［18］的方法測定；酸價測定：酸價是反映脂肪水解的重要指標，參照謝晶等［19］的方法進行測定；TBARS測定：TBARS值是衡量脂肪氧化的主要指標，參照Yarnpakdee等［20］的方法進行測定；MDA含量測定：MDA是常用的膜脂過氧化指標，參照汪金林等［21］的方法采用檢測試劑盒測定其MDA值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗中所有試樣進行3個平行測定，試驗重復3次，測定結果表示為xˉ±s，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理分析。指標均值差異顯著性分析采用多重比較（鄧肯法）進行。主成分分析采用因子分析法進行指標的降維。

2 結果與分析

2.1 大黃魚貯藏期間品質指標變化

2.1.1 大黃魚貯藏期間pH值變化 如圖1所示，隨著貯藏時間延長，pH值表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，且對照組與處理組A各貯藏時間水平對應pH值差異顯著（P<0.05）。同一貯藏期（第6天開始），對照組pH值顯著高于處理組A、處理組B，且差異顯著（P<0.05），貯藏后期（第9~12天），處理組B大黃魚pH值顯著低于處理組A（P<0.05）。貯藏過程中對照組pH值上升較快，貯藏第12天，對照組、處理組A、處理組B的pH值分別為7.83、7.28、7.05。

圖1 不同處理方式對大黃魚貯藏期間p H值影響Figure 1 Effects of different treatments on pH value in Larimichthyscrocea during storage

2.1.2 大黃魚貯藏期間TVB-N值變化 如圖2所示，各試驗組TVB-N值與貯藏時間呈正相關，且不同貯藏時間各水平間對應TVB-N值差異顯著（P<0.05）。同一貯藏時間（第3~12天），處理組A、處理組B的TVB-N值較對照組低，且差異顯著（P<0.05）。貯藏第12天，處理組B、處理組A、對照組的TVB-N值分別為12.36、17.47、27.24 mg/100g，處理組A、處理組B的TVB-N為對照組的64.13%、45.37%，由此可知，處理組可有效抑制大黃魚TVBN值的上升。

圖2 不同處理方式對大黃魚貯藏期間TVB-N值影響Figure 2 Effects of different treatments on volatile basic nitrogen in Larimichthyscrocea during storage

2.1.3 大黃魚貯藏期間菌落總數(shù)變化 由圖3可知，樣品菌落總數(shù)與貯藏時間呈正相關，貯藏期內(nèi)各水平間對應的菌落總數(shù)具有顯著差異（P<0.05）。貯藏期內(nèi)（第3~12天），處理組A與處理組B的菌落總數(shù)低于對照組，且差異顯著（P<0.05）。對照組菌落總數(shù)在第9天為5.53 lg（CFU/g），接近二級鮮度上限。貯藏末期（第12天），對照組、處理組A、處理組B菌落總數(shù)分別為6.74、4.25、3.64 lg（CFU/g），處理組A、處理組B菌落總數(shù)較對照組下降了36.94%、45.99%。說明，處理組在貯藏末期可減緩大黃魚菌落總數(shù)的上升，延長其貨架期。

圖3 不同處理方式對大黃魚貯藏期間菌落總數(shù)影響Figure 3 Effects of different treatments on total numbers of colony in Larimichthyscrocea during storage

2.1.4 大黃魚貯藏期間K值變化 如圖4所示，隨著貯藏時間延長（第3~12天），貯藏時間各處理對應的K值差異顯著（P<0.05）。相關性分析可知，大黃魚K值與貯藏時間呈高度正相關，其相關系數(shù)分別為0.940、0.957、0.929，且均 有 統(tǒng)計學意 義（P<0.05）。同一貯藏期（第3天開始），處理組A、B對應的K值顯著低于對照組（P<0.05）。對照組的K值在貯藏中后期上升幅度較大，處理組B的K值在貯藏后期（第9、12天）顯著低于處理組A（P<0.05）。貯藏第9天，對照組、處理組A、處理組B均為一級鮮度。

圖4不同處理方式對大黃魚貯藏期間K值影響Figure 4 Effects of different treatments on K value in Larimichthys crocea during storage

2.1.5 大黃魚貯藏期間鹽溶性蛋白溶出比變化如圖5所示，與處理組比較，對照組貯藏第6、9、12天大黃魚鹽溶性蛋白溶出比顯著降低（P<0.05），且處理組B顯著高于處理組A（P<0.05）。貯藏第12天，處理組B、處理組A、對照組鹽溶性蛋白溶出比分別為74.92%、65.48%、51.00%，處理組A、處理組B鹽溶性蛋白溶出比為對照組的1.28、1.46倍。說明，處理組B對應的鹽溶性蛋白溶出比維持在較高水平，大黃魚肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性較好。

圖5 不同處理方式對大黃魚貯藏期間鹽溶性蛋白溶出比影響Figure 5 Effects of different treatments on dissolution ratio of salt-soluble protein in Larimichthyscrocea during storage

2.1.6 大黃魚貯藏期間酸價變化 如圖6所示，試驗組的酸價隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。不同貯藏時間（第9、12天），酸價大小順序依次為處理組B<處理組A<對照組，且各水平間酸價差異顯著（P<0.05）。貯藏第12天，對照組、處理組A、處理組B酸價分別為8.06、6.35、5.75 g/100g，處理組A、處理組B與對照組比較，下降了21.22%、28.56%。由此可知，在貯藏末期，處理組（檸檬醛、檸檬醛-殼聚糖）協(xié)同流化冰處理可減緩大黃魚脂肪的水解酸敗。

2.1.7 大黃魚貯藏期間TBARS值變化 如圖7所示，隨著貯藏時間的延長，大黃魚對照組及處理組TBARS值均呈上升趨勢，且不同貯藏期內(nèi)各水平間對應TBARS值差異顯著（P<0.05）。由相關性分析可知，大黃魚TBARS值與貯藏時間呈正相關，其相關系數(shù)r分別為0.989、0.980、0.983，且均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。貯藏前期（第3天）TBARS值增長較緩慢，從第6天開始呈快速增長趨勢，貯藏第12天，對照組、處理組A、處理組B的TBARS值分別為6.57、3.42、2.74 mg/kg。由此可知，貯藏期內(nèi)，處理組可顯著抑制大黃魚的脂肪氧化。

圖6不同處理方式對大黃魚貯藏期間酸價影響Figure 6 Effects of different treatments on acid value in Larimichthyscrocea during storage

圖7 不同處理方式對大黃魚貯藏期間硫代巴比妥酸反應物的影響Figure 7 Effects of different treatments on TBARS value in Larimichthyscrocea during storage

2.1.8 大黃魚貯藏期間丙二醛（MDA）含量變化由圖8可知，大黃魚MDA隨著貯藏時間延長呈上升趨勢，不同貯藏期各水平間對應的MDA存在顯著差異（P<0.05）。貯藏期內(nèi)（第3~12天），大黃魚MDA值大小順序依次為對照組<處理組A<處理組B，且各試驗組間差異顯著（P<0.05）。處理組B、處理組A、對照組在第12天對應的丙二醛含量分別為0.624、0.645、0.844 mg/kg，處理組A、處理組B為對照組的76.42%、77.25%。

圖8 不同處理方式對大黃魚貯藏期間丙二醛含量的影響Figure 8 Effects of different treatments on MDA value in Larimichthyscrocea during storage

2.2 大黃魚貯藏期間各品質指標主成分分析

由表1可知，特征值（7.315）大于1的有1個主成分，總方差貢獻率91.440%。檸檬醛-殼聚糖涂膜協(xié)同流化冰貯藏對養(yǎng)殖大黃魚品質指標由初始8個降為1個主成分，達到降維目的。由表2可知，pH、揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)、K值、鹽溶性蛋白溶出比、酸價、TBARS值、MDA值在第1主成分上有較高載荷，說明第1主成分可以主要反映這8個指標信息，其中，pH、揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)、K值、酸價、TBARS值、MDA在正坐標處具有較高載荷，而鹽溶性蛋白溶出比在負坐標處有較高載荷。在主成分矩陣中，檢測絕對值反映對主成分貢獻率大小。比較第1主成分中貢獻率大小為鹽溶性蛋白溶出比>菌落總數(shù)=TBARS>揮發(fā)性鹽基氮>K值>pH>酸價>MDA。通過得分系數(shù)可將各個變量進行線性組合，建立關于Y1（第1主成分）與X1（pH）、X2（揮發(fā)性鹽基氮）、X3（菌落總數(shù)）、X4（K值）、X5（鹽溶性蛋白溶出比）、X6（酸價）、X7（TBARS值）、X8（MDA含量）的得分系數(shù)模型，由此第1主成分提取為：Y1=0.131X1+0.133X2+0.133X3+0.132X4-0.134X5+0.130X6+0.133X7+0.118X8。

表1 主成分方差分析Table 1 Analysis of variance for PCA

表2 成分載荷矩陣Table 2 Loading matrix for PCA

3 討論

魚體宰殺后其pH值通常表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢［22-23］。這主要是貯藏前期糖原和ATP分解產(chǎn)生乳酸和磷酸，pH值呈現(xiàn)下降趨勢，而貯藏中后期魚體自身內(nèi)源酶及微生物產(chǎn)生的外源酶分解蛋白質產(chǎn)生堿性胺類物質導致pH值出現(xiàn)上升。本研究中，處理組B、處理組A均可一定程度上抑制大黃魚貯藏期間pH值上升，且在貯藏后期，處理組B的抑制效果較顯著。可推測這與檸檬醛抑菌性有關，大黃魚經(jīng)復合保鮮液涂膜處理后，表面腐敗菌生長受到抑制，產(chǎn)生胺類等堿性物質相應降低，而殼聚糖涂膜可減少檸檬醛在魚體表面的流失，進一步強化了該效應。雷麗萍等［24］嘗試采用茶多酚對大黃魚進行冰藏保鮮，大黃魚貯藏期間pH值顯著低于空白對照組，其大黃魚樣品（3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm魚片）貯藏12 d的pH值為6.85，稍低于本試驗處理組B貯藏12 d的pH值（7.05），這也與大黃魚樣品（（200±20）g整魚）及分割處理有關。揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）與水產(chǎn)品鮮度有較好相關性，常用于評價魚類等水產(chǎn)品的腐敗程度［25］。一般認為，海水魚對應TVB-N值≤20 mg/100g為一級鮮度，TVB-N值在20~30 mg/100g為二級鮮度。對比標準，貯藏第6天，對照組大黃魚揮發(fā)性鹽基氮接近一級鮮度上限，貯藏末期（第12天），大黃魚處理組A與處理組B均處于一級鮮度，而對照組接近二級鮮度上限，就考察一級鮮度而言，處理組B可延長貨架期約6 d。盧亭等［26］采用5種保鮮技術應用于大黃魚（1 000±100）g的貯藏保鮮，研究發(fā)現(xiàn)，復配保鮮劑組（殼聚糖、磷酸鹽、海藻酸鈉）可有效抑制其TVB-N上升，推薦貨架期為6~9 d，這與本研究結果較一致，但大黃魚樣品的尺寸大小也是影響貨架期的重要因素，有待后續(xù)進一步研究比較。菌落總數(shù)常作為衡量魚肉腐敗程度的重要指標［4］。本研究中，貯藏末期（第12天），對照組超出6.0 lg（CFU/g）二級鮮度標準，而處理組A、處理組B為一級鮮度水平，就菌落總數(shù)指標而言，處理組B較對照組延長貨架期約6 d。這主要與檸檬醛-殼聚糖抑菌性有關，另外，流化冰低溫效應可進一步延緩腐敗菌對蛋白質的分解作用，從而抑制TVB-N值與菌落總數(shù)的上升。K值能反映水產(chǎn)品在貯藏過程中新鮮度的變化情況［17］。水產(chǎn)品的K值范圍對應不同的鮮度水平，一級鮮度為20%以下，二級新鮮度為20%~40%，初級腐敗為60%~80%。貯藏第9天，對照組、處理組A、處理組B均為一級鮮度，貯藏第12天，對照組處于二級鮮度，處理組仍維持一級鮮度。本試驗中，處理組A、處理組B在貯藏中后期可顯著抑制大黃魚K值的上升，且檸檬醛-殼聚糖協(xié)同流化冰處理效果較優(yōu)（P<0.05）。檸檬醛-殼聚糖復合保鮮液具有較好的抑菌效果，可有效降低微生物及酶對魚體的分解作用，本研究中采用的流化冰降溫速度快，可有效降低微生物細胞膜流動性及生理代謝作用，減緩大黃魚貯藏期K值上升。鹽溶性蛋白溶出比決定了蛋白質的功能特性［18］。本研究中，處理組A、處理組B在貯藏中后期可顯著減緩大黃魚鹽溶性蛋白溶出比下降，這倪渠峰等［27］的研究結果較一致。在低溫載體流化冰貯藏條件下，蛋白質受微生物污染分解變性程度得到抑制，從而減緩了大黃魚蛋白質變性程度。此外，鹽溶性蛋白溶出比的降低也與巰基氧化成二硫鍵有關，本研究中處理組采用的檸檬醛-殼聚糖復合膜具備一定的阻氧性，可降低巰基的氧化作用，從而抑制鹽溶性蛋白溶出比的降低。酸價的變化能反映水產(chǎn)品脂肪水解程度。本研究中，檸檬醛-殼聚糖復合膜具有一定抑菌及阻氧性，可減緩蛋白質受微生物作用水解及脂肪氧化酸敗程度，有研究表明蛋白質水解及脂肪水解酸敗呈一定正相關性，對照圖5中鹽溶性蛋白溶出比的變化趨勢，進一步驗證了該結論。脂肪氧化是水產(chǎn)品品質劣化的重要原因之一［28］。陳士達等［29］采用茶多酚、冷鹽水浸泡、液氮凍結等方法對大黃魚進行預處理并冷藏保鮮，研究指出，與其他處理組比較，茶多酚預處理組可有效降低大黃魚貯藏期TBARS，這可能與茶多酚的抗氧化能力有關。本研究中，檸檬醛具備一定的抗氧化性，檸檬醛-殼聚糖復合保鮮劑協(xié)同流化冰低溫作用減緩其TBARS上升，另外殼聚糖涂膜具備一定的阻氧性，降低了大黃魚表面氧氣分壓，也是其TBARS值上升幅度減緩的原因之一，而關于檸檬醛、殼聚糖對大黃魚TBARS交互影響有待進一步研究。MDA含量是判斷魚肉脂肪氧化程度的指標之一［30］。本研究中，處理組A、處理組B在貯藏期內(nèi)可顯著抑制大黃魚MDA上升，維持其較好的脂肪特性。這與張娟等［21］采用蘋果枝條多酚處理草魚貯藏期MDA的變化趨勢一致。章斌等［31］研究檸檬皮提取所得精油具備一定抑菌及抗氧化性能，進一步表明檸檬醛-殼聚糖復合膜具有抑制大黃魚貯藏期MDA的上升能力，同時其抑菌性也可能促進其抗氧性能的提升。另外，殼聚糖的濃度、大黃魚樣品尺寸大小、涂膜厚度也是影響氧氣分壓的因素，進而影響MDA值變化。

本研究中，1個主成分能較好地反映大黃魚的品質變化，即跟蹤測定的8個指標具有較大的相關及信息重疊性。第1主成分主要反映大黃魚貯藏期間蛋白質變性及脂肪酸敗程度，即大黃魚蛋白質變性與脂肪氧化酸敗及水解各指標均有高度相關性，這與趙宏強等［32］關于應用超高壓處理對鱸魚片進行冷藏，其樣品TBARS值、TVB-N值、菌落總數(shù)呈正相關的報道一致。得分系數(shù)表示各個指標對主成分的影響程度，本研究中擬定的線性回歸函數(shù)可為大黃魚綜合保鮮效果評價提供參考。

4 結論

1）與對照組相比，處理組A、處理組B可有效延緩pH值、揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)、K值、酸價、TBARS值及MDA含量上升，同時可顯著抑制大黃魚鹽溶性蛋白溶出比下降（P<0.05），且貯藏中后期，處理組B效果顯著優(yōu)于處理組A（P<0.05）。處理組B可有效維持大黃魚低溫貯藏品質，較對照組而言可延長貨架期約6 d。

2）通過對8個指標進行主成分分析可知，pH值、揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)、K值、酸價、TBARS值、MDA含量指標間呈正相關性，上述指標均與鹽溶性蛋白溶出比呈負相關，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。8個檢測指標可降維為1個主成分，其方差貢獻率達91.440%，能較好地反映大黃魚貯藏期的品質變化。