周昭彬 丁亞南 白心亮 宋澤和 賀 喜* 劉自逵*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長沙 410128；3.內(nèi)蒙古昶輝生物科技股份有限公司，通遼 028400)

自2020年起，我國禁止在畜禽飼料中添加抗生素，因此作為抗生素替代品的各種植物添加劑的開發(fā)變得愈加重要。水飛薊素是從水飛薊干燥成熟果實中提取得到的黃酮類天然化合物，其主要成分是水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧[1]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素具有保護肝臟[2]、調(diào)節(jié)免疫功能[3]、抗氧化[4]以及降血脂[5]等作用。近年來，水飛薊素在養(yǎng)殖業(yè)上的用途愈加廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加100 mg/kg水飛薊素能夠調(diào)節(jié)吉富羅非魚幼魚肝臟脂肪代謝和抗氧化功能[6]，飼糧中添加1 000 mg/kg水飛薊素能夠提高黃曲霉毒素攻毒肉雞平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和平均日增重(average daily gain，ADG)[7]。黃羽肉雞是我國優(yōu)質(zhì)肉雞品類，但目前缺少水飛薊素對黃羽肉雞的作用探索。因此，本試驗旨在研究飼糧中添加不同劑量水飛薊素對快大型黃羽肉雞生長性能、屠宰性能、脂質(zhì)代謝和膽汁酸代謝相關(guān)基因表達的影響，從而為水飛薊素作為快大型黃羽肉雞飼料添加劑提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的水飛薊素由內(nèi)蒙古某生物科技股份有限公司提供，其有效成分含量≥80%。

1.2 試驗動物和試驗設(shè)計

試驗選取288羽1日齡體質(zhì)健康的快大型黃羽肉雞母雛，隨機分成4個組，每組6個重復，每個重復12只雞。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，低劑量組(S250組)、中劑量組(S500組)和高劑量組(S750組)分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加250、500和750 g/t水飛薊素的飼糧。試驗期56 d，其中1～28日齡為試驗前期，29～56日齡為試驗后期。

1.3 試驗飼糧

試驗所用基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用3層籠養(yǎng)。試驗前對雞舍進行充分沖洗和嚴格消毒，入雛前24 h將雞舍升溫至32～35 ℃，此后溫度每周降低2～3 ℃，直至保持在22～24 ℃為止。采用連續(xù)光照、自然通風。試驗期舍內(nèi)光照、相對濕度和溫度根據(jù)常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進行控制，雞只按正常免疫程序進行免疫。整個試驗期雞只自由采食和飲水。

1.5 樣品采集

分別于29和57日齡(空腹8 h)，每個重復選取體重相近的1只肉雞進行屠宰取樣。采取頸靜脈血于促凝管中，室溫放置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于離心管中，-80 ℃冰箱中保存待測。采集適量肝臟于液氮中速凍后，-80 ℃冰箱中保存待測。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 生長性能

每天記錄各個重復的采食量和雞只健康狀況，在1、29和57日齡，對每個重復的所有肉雞進行稱重，計算ADFI、ADG和料重比(feed to gain ratio, F/G)。

1.6.2 屠宰性能

分別于29和57日齡(空腹8 h)，每個重復選取體重相近的1只肉雞進行屠宰，測定屠體重、半凈膛重、全凈膛重、腹脂重、胸肌重和腿肌重，計算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、胸肌率和腿肌率。

1.6.3 血清脂質(zhì)代謝

采用邁瑞B(yǎng)S-200全自動生化分析儀測定血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)(氧化酶法)、甘油三酯(triglyceride,TG)(甘油磷酸氧化酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density liptein cholesterol,HDL-C)(直接法)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)(直接法)含量，試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，所有指標嚴格按照相關(guān)試劑盒說明書進行操作。

1.6.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定

將肝臟組織與TRIzol勻漿后，按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒(AG21022，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進行肝臟RNA提取。得到RNA后，按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11706，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用SYBR Green(AG11701，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)嵌合熒光法進行RT-qPCR檢測。引物序列見下表2，其中以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法對定量結(jié)果進行計算分析。

表2 RT-qPCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進行組間多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 水飛薊素對黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素可以顯著提高黃羽肉雞各階段的末重、ADG以及前期ADFI(P<0.05)，并顯著降低各階段F/G(P<0.05)，但對后期和全期ADFI無顯著影響(P>0.05)。

表3 水飛薊素對黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 水飛薊素對黃羽肉雞屠宰性能的影響

由表4可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素對黃羽肉雞屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率均無顯著影響(P>0.05)，但飼糧中添加中、高劑量水飛薊素能顯著降低肉雞腹脂率(P<0.05)。

表4 水飛薊素對黃羽肉雞屠宰性能的影響

2.3 水飛薊素對黃羽肉雞血清脂質(zhì)代謝的影響

由表5可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素顯著提高黃羽肉雞28日齡血清HDL-C含量(P<0.05)(S750組除外)，顯著降低28和56日齡血清LDL-C含量(P<0.05)；飼糧中添加中劑量水飛薊素顯著提高黃羽肉雞28日齡血清TG含量(P<0.05)，飼糧中添加低、中劑量水飛薊素顯著降低56日齡血清TG含量(P<0.05)。

表5 水飛薊素對黃羽肉雞血清脂質(zhì)代謝的影響

2.4 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因表達的影響

由表6可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素可以顯著降低黃羽肉雞28日齡肝臟膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)mRNA相對表達量(P<0.05)，顯著提高28日齡肝臟法尼酯X受體(FXR)、膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)和多藥耐藥蛋白2(MRP2)(S250組除外)mRNA相對表達量(P<0.05)，且中、高劑量比低劑量提升效果更為顯著(P<0.05)；與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素可以顯著提高黃羽肉雞56日齡肝臟BSEP和MRP2(S250組除外)mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧中添加中、高劑量水飛薊素能顯著降低56日齡肝臟CYP7A1 mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧中添加低、高劑量水飛薊素能顯著提高56日齡肝臟FXRmRNA相對表達量(P<0.05)。

表6 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因表達的影響

3 討 論

3.1 水飛薊素對黃羽肉雞生長性能的影響

水飛薊素在畜牧業(yè)上的應(yīng)用逐漸廣泛，有研究表明飼糧中添加水飛薊素可以改善畜禽生長性能。何玉華等[8]在飼糧中添加20%固態(tài)發(fā)酵的水飛薊殘渣提升了雞只營養(yǎng)物質(zhì)消化率，改善了生長性能。Jahanian等[7]在飼糧中添加1 000 g/t水飛薊素改善了黃曲霉毒素攻毒肉雞腸道形態(tài)，提高了肉雞ADFI和ADG。Ahmad等[9]通過在飼糧中添加15 g/kg水飛薊緩解了夏季肉雞應(yīng)激，提高了肉雞ADFI和ADG。本試驗中，飼糧中添加水飛薊素顯著提高了黃羽肉雞ADG，顯著降低了F/G，與前人研究結(jié)果一致，表明飼糧中添加水飛薊素可以提高黃羽肉雞生長性能。

3.2 水飛薊素對黃羽肉雞屠宰性能的影響

屠宰性能是肉雞生產(chǎn)中的重要指標，能衡量肉雞凈肉生產(chǎn)能力，也是用于評估肉類生產(chǎn)性能和動物飼養(yǎng)效果的參數(shù)[10]。研究表明，屠宰率在80%以上、全凈膛率在60%以上，則表明肉雞凈肉生產(chǎn)率高[11-12]。本試驗中，各組黃羽肉雞屠宰率均在88%以上，全凈膛率均在60%以上，且飼糧中添加低、中劑量水飛薊素肉雞屠宰率高達91%，低、中和高劑量水飛薊素組全凈膛率也分別比對照組提高了7.02%、4.07%和2.32%，結(jié)果表明，飼糧中添加水飛薊素可在一定程度上提高肉雞屠宰率和全凈膛率，這與王英偉[13]的研究結(jié)果類似，其在豬飼糧中添加水飛薊殘渣后屠宰率提高了2.38%。水飛薊素是黃酮類化合物，尤明珍[14]研究表明，大豆異黃酮主要通過降脂作用提高谷鴨屠宰率；李垚等[15]也研究表明，飼糧中添加0.2%沙棘黃酮能升高肉雞屠宰率，并且沙棘黃酮也降低了肉雞腹脂率和血清TG含量。以上研究表明，水飛薊素或是通過減少脂肪含量以提升肉雞屠宰率和全凈膛率。呂夢云[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加葛藤黃酮能抑制肉雞脂肪蓄積；周萍芳[17]的研究也表明，飼糧中添加苜蓿黃酮可以減少肉雞胸肌及腿肌中的脂肪積聚。與上述研究結(jié)果類似，本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加中、高劑量水飛薊素可顯著降低黃羽肉雞腹脂率。Li等[18]通過給肉雞飼喂微生物發(fā)酵水飛薊素工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢料證實，水飛薊素可以降低肉雞腹脂率。因此，飼糧中添加水飛薊素能降低肉雞腹脂率，改善屠宰性能，其機理可能與脂質(zhì)代謝的改善相關(guān)。

3.3 水飛薊素對黃羽肉雞血清脂質(zhì)代謝的影響

血清中TG和TC含量可以反映肉雞的脂肪合成強度[19]。研究表明，水飛薊素及其他黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)動物機體脂質(zhì)代謝的作用[20-21]。本試驗中，飼糧中添加低、中劑量水飛薊素顯著降低黃羽肉雞56日齡血清TG含量，這與Kheiripour等[22]的研究結(jié)果具有相似性，其通過建立糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)水飛薊素能降低肝臟TG含量。蕭培珍[23]進一步研究表明，水飛薊素通過抑制肝細胞脂肪酸合成酶(FAS)和固醇輔酶A去飽和酶1(SCD1)基因的表達以降低TG含量。此外，本試驗中，飼糧中添加中劑量水飛薊素顯著提高黃羽肉雞28日齡血清TG含量，可能是由于前期飼養(yǎng)環(huán)境溫度偏低，水飛薊素加快脂質(zhì)代謝造成機體TG積累。HDL-C含量提高和LDL-C含量降低是拮抗動脈粥樣硬化的重要因素[24]。高潔麗[25]研究表明，水飛薊賓可提高大鼠血清HDL-C含量，降低血清LDL-C含量。Jiang等[26]也通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可降低LDL-C含量。水飛薊素可能是通過促進ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達繼而調(diào)節(jié)脂蛋白含量，Vecera等[27]通過高甘油三酯血癥大鼠的代謝綜合征模型證實了這一點。與高潔麗[25]、Jiang等[26]的研究結(jié)果類似，本試驗中，飼糧中添加低、中劑量水飛薊素能顯著提高黃羽肉雞28日齡血清HDL-C含量，添加3種不同劑量的水飛薊素能顯著降低28和56日齡血清LDL-C含量。因此，飼糧中添加水飛薊素能提高黃羽肉雞血清HDL-C含量，降低血清TG、LDL-C含量，改善脂質(zhì)代謝，這也證實水飛薊素能通過改善脂質(zhì)代謝繼而提升肉雞屠宰性能。

3.4 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因表達的影響

膽汁酸在肝臟細胞中由膽固醇合成而來，CYP7A1是其合成的關(guān)鍵限速酶[28]，F(xiàn)XR可以通過活化下游微小異源二聚體伙伴(SHP)基因負調(diào)控CYP7A1的表達[27,29]。Gu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可以激活HepG2細胞FXR，并下調(diào)其下游基因CYP7A1的表達；Suguro等[31]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能下調(diào)非酒精性脂肪肝炎模型小鼠肝臟中CYP7A1表達；但Xiao等[32]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加100 g/t水飛薊素上調(diào)了草魚肝臟中CYP7A1 mRNA表達。以上研究表明水飛薊素調(diào)節(jié)動物體肝臟中FXR、CYP7A1表達的作用具有物種差異。本試驗中，飼糧中添加水飛薊素提升了黃羽肉雞28和56日齡肝臟中FXRmRNA相對表達量，降低了肝臟中CYP7A1 mRNA相對表達量，表明水飛薊素可能通過調(diào)節(jié)肉雞肝臟中FXR、CYP7A1的表達以減少肝臟膽汁酸合成，而肝臟膽汁酸合成的減少可能與肝-腸循環(huán)回流至肝臟的膽汁酸含量升高有關(guān)。BSEP能將肝臟中合成的膽汁酸逆濃度梯度泵入毛細膽管[33]；MRP2是肝臟重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白，能促進膽汁酸排泄進腸道[34]。本試驗中，飼糧中添加水飛薊素提升了黃羽肉雞28和56日齡肝臟中BSEP和MRP2 mRNA相對表達量。有研究表明，水飛薊素能恢復膽汁淤積劑造成的BSEP損傷[35]，MRP2是參與膽汁排泄水飛薊素-黃酮醇結(jié)合物的主要小管轉(zhuǎn)運蛋白[36]。與前人研究一致，本試驗中，飼糧中添加水飛薊素可以通過上調(diào)肉雞肝臟中BSEP和MRP2 mRNA表達以促進膽汁酸排泄至腸道，這也證明本研究中添加水飛薊素使得肝臟膽汁酸合成減少，可能是由于腸道回流至肝臟的膽汁酸含量增加所致。膽汁酸代謝可對機體脂質(zhì)代謝產(chǎn)生重要影響[37]。動物機體內(nèi)的脂質(zhì)代謝始終處于動態(tài)平衡之中，脂肪組織、血清和肝臟中的脂質(zhì)水平是相互影響的[38]。本試驗中，飼糧中添加水飛薊素能促進肝臟膽汁酸排泄繼而減少肝臟膽汁酸合成，從而調(diào)節(jié)血清HDL-C、LDL-C和TG含量，降低腹脂率，減少肌肉中脂肪蓄積以提高肉雞屠宰率和全凈膛率。

4 結(jié) 論

飼糧中添加水飛薊素可以通過調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運，改善脂質(zhì)代謝，進而降低肉雞腹脂率并提高屠宰率和全凈膛率，并提升肉雞生長性能，其中以前期(1～28日齡)添加高劑量(750 g/t)、后期(29～56日齡)添加中劑量(500 g/t)為宜。