蔣 鑫 王 希 朱春霞 李成龍

(都江堰市人民醫(yī)院1 血液科，2 檢驗(yàn)科，四川省都江堰市 611830；3 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川省成都市 610031)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由髓樣祖細(xì)胞引起的致死性血液惡性腫瘤，是成人最常見的急性白血病類型，其特征是處在不同階段的髓樣祖細(xì)胞成熟停滯而惡性增殖，同時白血病細(xì)胞凋亡受損，這是一種異質(zhì)性疾病，可導(dǎo)致人類造血細(xì)胞的整體減少[1-3]?；熃Y(jié)合造血干細(xì)胞移植是AML的首選治療方法，也是其主要治療方法[4]。雖然目前治療技術(shù)取得了很大進(jìn)步，但治療后AML患者的復(fù)發(fā)率很高，總生存率仍然很低[5]。因此，尋找新的治療方法以降低復(fù)發(fā)率，對于提高AML患者的生存率極為重要。甘草甜素也稱為甘草酸，是甘草的有效成分，它具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤和保肝等多種藥理特性[6]。Hibasami等[7]研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素可誘導(dǎo)人AML細(xì)胞 HL-60發(fā)生凋亡。腺苷單磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，MTOR)信號通路在細(xì)胞生長、增殖、凋亡、遷移等過程中具有重要作用[8]。抑制MTOR并激活A(yù)MPK的藥物在治療AML方面具有很好的應(yīng)用前景[9]。目前關(guān)于甘草甜素對AMPK/MTOR信號通路的作用鮮見報告。因此，本研究探究甘草甜素對AML細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的影響，并分析其是否通過AMPK/MTOR通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HL-60細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。CCK-8試劑盒購自美國Abcam公司(貨號：ab228554)。Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號：C1062)、Hoechst 33342染色液(貨號：C1025)均購自上海碧云天生物有限公司。B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)一抗(貨號：15071)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗(貨號：89477)、MTOR一抗(貨號：2983)、磷酸化MTOR(phosphorylated MTOR,p-MTOR)一抗(貨號：5536)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)一抗(貨號：13110)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)一抗(貨號：55506)、活化型Caspase3(cleaved Caspase-3)一抗(貨號：9664)、羊抗兔二抗(貨號：7074)、β-actin一抗(貨號：4970)均購自美國Cell Signaling Technology公司。AMPK一抗(貨號：MA5-15815)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)一抗(貨號：44-1150G)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。RPMI 1640完全培養(yǎng)基(貨號：31800022)、胎牛血清(貨號：S9020)均購自北京索萊寶科技有限公司。甘草甜素[純度≥98%(高效液相色譜法)；貨號：IG0730]和二甲基亞砜(純度>99.5%；貨號：D8371)均購自北京索萊寶科技有限公司。碘化丙啶(純度≥94.0%；產(chǎn)品編號：ST1569)購自上海碧云天生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Forma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，ZS-AE7S型中生流式細(xì)胞儀購自中生(蘇州)醫(yī)療科技有限公司，BX53型電子熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，GelDoc XR型凝膠成像儀、550型全自動酶標(biāo)儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù)：復(fù)蘇HL-60細(xì)胞后，使用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)傳代，培養(yǎng)至生長對數(shù)期備用。將處于生長對數(shù)期的細(xì)胞分為對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組，在甘草甜素低、中、高劑量組細(xì)胞中分別加入終濃度為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL的甘草甜素，在對照組細(xì)胞中加入等體積的二甲基亞砜。

1.3.2 CCK-8法評估細(xì)胞增殖情況：將HL-60細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為2×104個/孔，按1.3.1方法處理各組細(xì)胞，48 h后每孔分別加入10 μL的CCK-8溶液，設(shè)3個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值。計(jì)算存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組單個樣本吸光度值/對照組所有樣本平均吸光度值×100。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.3 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞以400個/孔接種于6孔板，使其均勻分布。按照1.3.1方法處理細(xì)胞，24 h后取出細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1周后，使用多聚甲醛固定細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)每組的細(xì)胞克隆數(shù)，以>25個細(xì)胞聚集時設(shè)定為1個有效細(xì)胞克隆。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況：將HL-60細(xì)胞以5×104個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中，按照1.3.1方法處理各組細(xì)胞，設(shè)3個復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，30 s/次，然后將細(xì)胞重懸于含有Annexin Ⅴ的FITC和碘化丙啶結(jié)合的緩沖液中，在室溫下孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.5 Hoechst 33342染色法檢測細(xì)胞凋亡情況：將HL-60細(xì)胞以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中，按照1.3.1方法處理各組細(xì)胞，設(shè)3個復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞，使用PBS清洗30 s后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，再用PBS清洗30 s，隨后在室溫下用Hoechst 33342避光染色細(xì)胞10 min，再次使用PBS清洗后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。隨機(jī)選取5個視野，在400倍鏡下進(jìn)行觀察。若觀察到細(xì)胞核碎裂或細(xì)胞皺縮，則判定為凋亡的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.6 Western blot分析蛋白表達(dá)水平：將HL-60細(xì)胞以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中，按照1.3.1方法處理各組細(xì)胞，設(shè)3個復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，30 s/次，加入蛋白酶抑制劑和細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白并檢測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF膜2 h，然后4 ℃孵一抗(PCNA、cyclin D1、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、AMPK、p-AMPK、MTOR、p-MTOR的稀釋倍數(shù)為1 ∶500，β-actin的稀釋倍數(shù)為(1 ∶1 000)過夜，用TBST洗膜3次，10 min/次，然后在室溫下孵育二抗(稀釋倍數(shù)為1 ∶2 000)2 h，再次用TBST洗膜3次，10 min/次，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑曝光顯色，以β-actin為內(nèi)參蛋白，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 甘草甜素對HL-60細(xì)胞增殖的影響 4組HL-60細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細(xì)胞存活率依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組HL-60細(xì)胞存活率的比較(x±s，%)

2.2 甘草甜素對HL-60細(xì)胞克隆形成的影響 4組的HL-60細(xì)胞有效克隆數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細(xì)胞有效克隆數(shù)依次減少(均P<0.05)。見表2。

表2 4組HL-60細(xì)胞有效克隆數(shù)的比較(x±s，個)

2.3 甘草甜素對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，4組HL-60細(xì)胞的凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組HL-60細(xì)胞的凋亡率依次升高(均P<0.05)，見圖1和表3。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，與對照組相比，甘草甜素各劑量組中核碎片和凝結(jié)的HL-60細(xì)胞比例明顯增加，HL-60細(xì)胞凋亡率升高，見圖2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表3 4組HL-60細(xì)胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖2 Hoechst 33342染色結(jié)果(×400)

2.4 甘草甜素對HL-60細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 4組HL-60細(xì)胞的PCNA、cyclin D1蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組HL-60細(xì)胞的PCNA、cyclin D1蛋白表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 4組增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表4 4組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.5 甘草甜素對HL-60細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 4組HL-60細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平依次降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 4組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表5 4組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.6 甘草甜素對HL-60細(xì)胞AMPK/MTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 4組HL-60細(xì)胞的p-AMPK、p-MTOR蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)，p-MTOR蛋白表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。但4組HL-60細(xì)胞的AMPK和MTOR蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖5和表6。

圖5 4組 AMPK/MTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表6 4組均AMPK/MTOR通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

AML是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)疾病，其特征為多種遺傳/表觀遺傳變異，以及造血干細(xì)胞和髓系祖細(xì)胞分化、增殖和自我更新的改變[10]?；熓侵委烝ML最常用的方法，但它也會殺死正常細(xì)胞，從而引起多種不良反應(yīng)[11]。研發(fā)替代治療策略以降低化療引起的不良反應(yīng)，具有重要意義。甘草甜素是甘草根的成分，是一種三萜皂苷[12]。已知甘草甜素的抗癌機(jī)制包括抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、凋亡[13]。研究表明，甘草甜素可抑制人食管癌細(xì)胞ECA109和肝癌細(xì)胞MHCC97-H的增殖[14-15]，并能夠以時間和劑量依賴性的方式抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[16]。本研究結(jié)果顯示，給予甘草甜素干預(yù)后，HL-60細(xì)胞生長受到抑制，與增殖相關(guān)的PCNA、cyclin D1蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，且具有一定的劑量依賴性，表明甘草甜素可抑制HL-60的細(xì)胞增殖，對AML具有一定的治療作用。

凋亡是一種細(xì)胞死亡過程，受不同分子機(jī)制的調(diào)節(jié)，其中Caspase在凋亡的激活中起著至關(guān)重要的作用。人類癌癥細(xì)胞的基本特征之一是逃避凋亡，這使得腫瘤進(jìn)一步發(fā)展并對治療產(chǎn)生抵抗性[17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，甘草甜素可以促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的凋亡[18-19]。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白Bad、Bid、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x、Mcl-1。Bcl-2可通過介導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C至細(xì)胞質(zhì)來調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而激活下游無活性的Caspase-9并使Caspase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，甘草甜素各劑量組的HL-60細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)，且呈劑量依賴關(guān)系，表明甘草甜素可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡。

AML細(xì)胞的增殖與AMPK/MTOR信號通路密切相關(guān)。AMPK是一種細(xì)胞能量傳感器，是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量和代謝的關(guān)鍵因子，可通過調(diào)節(jié)多個下游信號分子促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在髓系惡性腫瘤的促分化中發(fā)揮重要作用[22]。MTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，激活A(yù)MPK可抑制MTOR信號傳導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[23]。有研究顯示，辛伐他汀對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖的抑制作用和細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用與AMPK/MTOR信號通路有關(guān)[24]；而亞硒酸鈉可激活A(yù)MPK，抑制MTOR活化，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，在甘草甜素作用下，HL-60細(xì)胞的p-AMPK蛋白表達(dá)水平升高，p-MTOR蛋白水表達(dá)平降低，表明甘草甜素可促進(jìn)AMPK磷酸化，抑制MTOR磷酸化水平，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，甘草甜素有效抑制HL-60細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈一定的劑量依賴性，其機(jī)制可能與促進(jìn)AMPK的磷酸化水平、抑制MTOR磷酸化有關(guān)。