劉 婷，孟新玲，李 丹，馬 娜，杜 帥，張玉潔

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，占老年癡呆的50%～75%，其發(fā)病率隨著世界人口的老齡化迅速攀升[1]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無(wú)一種學(xué)說(shuō)能夠比較全面、合理地闡明其發(fā)病過(guò)程，除了已知的淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解而成的Aβ多肽片段假說(shuō)外[2]，近幾年研究證實(shí)多種免疫細(xì)胞和炎性因子可以通過(guò)各種方式參與疾病發(fā)展，并與沉積的Aβ相互作用，觸發(fā)一系列神經(jīng)病理反應(yīng)，如Tau蛋白過(guò)磷酸化和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成和神經(jīng)元損傷，最終導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)退行性病變和癡呆[3-4]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種炎性因子，在各種慢性炎癥和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。既往的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，骨橋蛋白表達(dá)的增強(qiáng)很可能是應(yīng)對(duì)加速的神經(jīng)退行性變和病理性變化的反應(yīng)[5-6]。但有關(guān)結(jié)果多局限在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床上確切的炎癥致病機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究的目的是評(píng)估骨橋蛋白水平以及各炎性細(xì)胞因子在診斷AD上的應(yīng)用價(jià)值以及隨訪期間的變化情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性分析2016年11月—2019年3月新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治的AD以及同期非炎癥性神經(jīng)病(noninflammatory neurologic diseases，OND)病人120例，分為AD組和OND組，每組60例。隨訪1年。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，所有病人均由家屬簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) AD的診斷參照美國(guó)神經(jīng)病學(xué)、語(yǔ)言障礙和卒中-老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)工作組(NINCDS-ADRDA)標(biāo)準(zhǔn)中“很可能阿爾茨海默病(probable Alzheimer′s disease with mild tomoderate dementia)”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。OND組選擇同期住院的非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病人，如緊張型頭痛、低鉀性周期性麻痹。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)合臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查明確診斷為AD病人；年齡≥50歲；既往無(wú)腫瘤及精神疾病等病史者；視聽(tīng)功能完好，可完成記憶量表檢測(cè)，無(wú)認(rèn)知功能障礙者；簽署知情同意書者。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 入院時(shí)患精神病或神經(jīng)障礙；頭部損傷導(dǎo)致的意識(shí)喪失者；酒精或藥物濫用者；伴隨可能影響免疫水平疾病的病人，如糖尿病、嚴(yán)重的肺炎、自身免疫性疾病類、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性或慢性炎癥疾病等；伴隨有重大軀體疾病并危及生命者，如急性心肌梗死、嚴(yán)重的慢性阻塞性肺疾??；使用類固醇皮質(zhì)激素及非甾體類抗炎藥物者；隨訪資料不全或中途退出研究者；拒絕簽署知情同意書者。

1.4 方法 入院后收集病人年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)評(píng)分等臨床資料。采集病人腰椎穿刺留取的腦脊液樣本、晨起空腹靜脈血，-80 ℃保存，避免樣本反復(fù)凍融。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清和腦脊液中骨橋蛋白含量，血清白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-17A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平(ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R & D公司)。所有入選病人均通過(guò)門診和住院隨訪1年，隨訪時(shí)間始于病人接受治療的日期，止于病人死亡或隨訪截止日期，對(duì)失訪病例按最后1次隨訪時(shí)間為準(zhǔn)做刪失處理。隨訪1年后，再次檢測(cè)血清骨橋蛋白及IL-1β、IL-6、IL-17A、TGFβ-1和TNF-α水平，進(jìn)行MMSE測(cè)評(píng)。對(duì)比分析隨訪前后各指標(biāo)差異，以及評(píng)估MMSE評(píng)分、骨橋蛋白以及各細(xì)胞因子的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 隨訪1年后，AD組失訪12例，OND組失訪9例。AD組MMSE評(píng)分低于OND組，腦脊液骨橋蛋白、血清骨橋蛋白、TNF-α水平高于OND組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組隨訪1年后各指標(biāo)比較 隨訪1年后，AD組MMSE評(píng)分低于OND組，血清骨橋蛋白、TNF-α水平高于OND組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組隨訪1年后各指標(biāo)比較(±s)

2.3 AD組炎性因子與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，腦脊液骨橋蛋白水平與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.865，P<0.001)，血清骨橋蛋白水平與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.853，P<0.001)，TNF-α水平與MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.776，P<0.001)。詳見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 腦脊液骨橋蛋白水平與MMSE評(píng)分的相關(guān)性

圖2 血清骨橋蛋白水平與MMSE評(píng)分的相關(guān)性

圖3 血清TNF-α水平與MMSE評(píng)分的相關(guān)性

ROC分析結(jié)果顯示，腦脊液骨橋蛋白、血清骨橋蛋白和TNF-α的曲線下面積(AUC)分別為0.981[95%CI(0.921，0.993)]、0.920[95%CI(0.862，0.971)]和0.910[95%CI(0.850，0.970)]，敏感度分別為90%、85%和83%，特異度分別為91%、83%和83%。腦脊液骨橋蛋白的ROC曲線下面積明顯高于血清骨橋蛋白和TNF-α的曲線下面積(P<0.001)。詳見(jiàn)表3、圖4。

表3 不同標(biāo)記物評(píng)估AD的ROC曲線分析

圖4 腦脊液、血清骨橋蛋白及血清TNF-α診斷AD的ROC曲線

3 討 論

AD病人的免疫炎癥反應(yīng)是指腦中固有免疫細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)和釋放大量神經(jīng)炎癥介質(zhì)，包括補(bǔ)體激動(dòng)劑和抑制劑、趨化因子、細(xì)胞因子、氧自由基和炎癥酶系統(tǒng)，這些炎癥介質(zhì)通過(guò)各種方式促進(jìn)淀粉樣蛋白前體蛋白加工進(jìn)而損傷神經(jīng)末梢活性引發(fā)突觸功能障礙，促進(jìn)神經(jīng)元損傷，該過(guò)程一旦啟動(dòng)，將對(duì)AD進(jìn)程產(chǎn)生持續(xù)影響[8-9]。因此，本研究擬評(píng)估骨橋蛋白和炎癥相關(guān)因子與AD病情進(jìn)展之間的相關(guān)性分析。從而在免疫炎癥角度上揭示該疾病的發(fā)病機(jī)制及病情發(fā)展規(guī)律，進(jìn)而為AD的治療提供新的思路和相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果橫向研究顯示，AD組較OND組無(wú)論在入院時(shí)還是隨訪1年，均具有較高的血清TNF-α和骨橋蛋白水平，這與既往研究相似，研究認(rèn)為人腦中所含有小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可以被感染，炎癥性疾病，局部缺血和創(chuàng)傷性損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種病理過(guò)程激活而分泌大量TNF-α等炎性因子[10]，并且對(duì)AD病人死亡后的大腦分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以定位在淀粉樣斑塊中[11]。本研究顯示，入院時(shí)AD組的腦脊液中骨橋蛋白水平較OND組明顯升高，這可能與剛診斷為AD時(shí)，炎癥反應(yīng)主要發(fā)生于內(nèi)嗅、顳頂葉和扣帶回皮質(zhì)等腦脆弱區(qū)，引起急性期蛋白和促炎介質(zhì)的表達(dá)增加有關(guān)。而腦脊液內(nèi)的炎性因子可以直接接觸大腦，能準(zhǔn)確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)正在進(jìn)行的炎癥過(guò)程，因此，腦脊液骨橋蛋白水平的反應(yīng)時(shí)間早于血清骨橋蛋白水平[12]。同時(shí)橫向研究還顯示，隨訪前后兩組之間其余的炎性因子水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。何璐等[13]進(jìn)行的70 種免疫及炎癥相關(guān)蛋白研究也證實(shí)，AD組和健康對(duì)照組之間除TNF-α外，其余常見(jiàn)的如IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17A等炎性因子比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但也有研究和薈萃分析顯示，AD病人外周血中IL-6、IL-8、IL-10等濃度明顯高于健康對(duì)照組[14-16]。這可能與各研究之間存在種族差異以及檢測(cè)手段和平臺(tái)的差異有關(guān)，并且本研究嚴(yán)格排除了AD 以外其他可能影響免疫炎癥水平的各種相關(guān)伴隨疾病。但本研究中縱向隨訪研究顯示，AD組隨訪前后MMSE評(píng)分無(wú)明顯變化，并且各炎性指標(biāo)之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與既往研究相似。Julian等[17]進(jìn)行的一項(xiàng)為期2年的隨訪研究顯示，診斷AD病人的各項(xiàng)炎性因子比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故不是所有的血清炎性細(xì)胞因子的改變都可以預(yù)測(cè)AD病人認(rèn)知功能的下降，還需進(jìn)一步大樣本研究發(fā)現(xiàn)確切的預(yù)測(cè)標(biāo)記物。

相關(guān)性分析也證實(shí)AD組腦脊液和血清骨橋蛋白水平與認(rèn)知障礙嚴(yán)重評(píng)分呈正相關(guān)。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，腦脊液和血清骨橋蛋白水平、TNF-α在預(yù)測(cè)AD上具有較高的敏感度和特異度，這與既往研究相似。Comi等[18]研究表明，MMSE評(píng)分>23分的AD病人腦脊液骨橋蛋白含量明顯高于MMSE評(píng)分≤23分的病人，這可能與認(rèn)知功能下降有關(guān)。盡管骨橋蛋白是AD病人認(rèn)知功能減退的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子，但其確切作用及其潛在機(jī)制尚不清楚。Th17細(xì)胞已被證明是各種炎癥和自身免疫疾病的致病效應(yīng)細(xì)胞。動(dòng)物研究顯示，骨橋蛋白通過(guò)抑制小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞中IL-17A的分泌，在Th17細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。也有研究顯示，AD病人Th17 細(xì)胞增加，骨橋蛋白水平升高可能通過(guò)增強(qiáng)活化T細(xì)胞的存活而加劇AD病人腦中出現(xiàn)的異常免疫反應(yīng)[20]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白在AD病人海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)，骨橋蛋白染色強(qiáng)度與淀粉樣β蛋白負(fù)荷和年齡呈正相關(guān)[21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ誘導(dǎo)的AD模型鼠血清和腦脊液骨橋蛋白同時(shí)升高，且與病程相關(guān)；外源給予骨橋蛋白能夠改善Aβ誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)[22]。這些研究均表明骨橋蛋白在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過(guò)程中可能有兩種相反的作用。一方面，骨橋蛋白通過(guò)上調(diào)髓鞘形成和再髓鞘形成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)劑的作用；另一方面，骨橋蛋白通過(guò)引起神經(jīng)元毒性和死亡而具有疾病加速作用[23-24]。

結(jié)合本研究和既往研究推測(cè)，TNF-α和骨橋蛋白可能是一種新的潛在的AD生物學(xué)標(biāo)志物，并在AD的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但本研究為單中心研究，在排除標(biāo)準(zhǔn)上限制了大量會(huì)影響免疫功能的因素，以及部分病人在隨訪資料不全，導(dǎo)致AD的發(fā)病率有可能被低估；其次，本研究?jī)H評(píng)估了少量炎性細(xì)胞因子的變化情況，由于檢測(cè)指標(biāo)和平臺(tái)的差異，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析；本研究隨訪1年后未能收集腦脊液中骨橋蛋白變化情況，因此仍需進(jìn)一步研究證實(shí)該結(jié)論。

綜上所述，TNF-α和骨橋蛋白與AD病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，在診斷AD上均具有更高的敏感性和特異性，可以作為AD的潛在生物標(biāo)志物組合。但對(duì)于其他炎性因子與AD病情嚴(yán)重程度的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究。