李程程，張子蕤，宋曉萱，孔娟娟，韓陽(yáng)，阮亞男

遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036

近地層臭氧（O3）是一種分布較廣且對(duì)生物有害的氣體污染物，它不僅直接威脅著人類(lèi)和動(dòng)物的健康，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育也有影響（Lefohn et al.，2018；Grulke et al.，2020；Kuerban et al.，2020）。由于 O3污染的不斷加劇及對(duì)農(nóng)林植物的損害強(qiáng)度的增加，O3問(wèn)題已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注（Edenhofer et al.，2014；Wang et al.，2016；Emberson，2020）。

近地層 O3大量來(lái)自人為排放的氮氧化物（NOx）、植物可揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs，volatile organic compounds）、一氧化碳（CO）和甲烷（CH4）等前體物在強(qiáng)光下的光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物，以及少量來(lái)自平流層大氣的O3傳輸（馮兆忠，2020）。中國(guó)國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò) 2013—2017年的數(shù)據(jù)表明，中國(guó)近地層O3年均摩爾分?jǐn)?shù)以3 nmol·mol-1的速度升高（Wang et al.，2019）。全國(guó)近地層O3摩爾分?jǐn)?shù)每日8 h滑動(dòng)平均最大值（MDA8）的年平均值達(dá)到(41.2±6.3) nmol·mol-1，長(zhǎng)江三角洲等地 MDA8 最大值年平均值高達(dá)60—70 nmol·mol-1（Lu et al.，2018；馮兆忠等，2020）。由于O3形成的前體物質(zhì)排放濃度不穩(wěn)定，而且無(wú)規(guī)律性，以及光輻射的晝夜變化、季節(jié)性變化及陰雨天氣的影響，導(dǎo)致近地層 O3濃度波動(dòng)較大。O3污染具有日周期變化的特點(diǎn)，夜間O3濃度僅為白天的60%，在天氣晴朗的夏季表現(xiàn)尤為突出（Bullbovas et al.，2014；易睿等，2015；阮亞男等，2017）。

O3是具有極強(qiáng)氧化毒性的二次污染物，對(duì)植物葉片的可見(jiàn)傷害是最直觀的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，200 nmol·mol-1O3熏蒸 10 d即可造成銀杏（Ginkgo biloba）葉片邊緣卷曲和壞死現(xiàn)象（易睿等，2015）。高濃度 O3通過(guò)植物氣孔進(jìn)入到葉肉細(xì)胞，溶于細(xì)胞壁的結(jié)合水中，直接參與或形成活性氧（ROS）間接與細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜的生物大分子發(fā)生反應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、影響植物正常代謝，對(duì)植物形態(tài)、生理生化、基因表達(dá)、蛋白表達(dá)等均有不同程度的影響（Zhao et al.，2005；Bullbovas et al.，2014；阮亞男等，2017）。O3誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量ROS可誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)啟動(dòng)防御機(jī)制，抗壞血酸等抗氧化物在細(xì)胞質(zhì)外體清除ROS，過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)等重要抗氧化物質(zhì)在共質(zhì)體內(nèi)清除余下的 ROS（馮兆忠等，2020）。但植物依靠自身的抗氧化代謝抵御近地層 O3濃度升高是有一定限度的。短期升高的O3濃度（100 nmol·mol-1）下大豆（Glycinemax）葉片影響三羧酸（TCA）循環(huán)、細(xì)胞壁組成和氨基酸的代謝物，促進(jìn)氣孔關(guān)閉的茉莉酸相關(guān)代謝物被誘導(dǎo)，比自然濃度處理升高了125倍（Zhang et al.，2021）。而低濃度O3處理卻可以增加植物葉面積和生物量，60 nmol·mol-1熏蒸豇豆（Vignaunguiculata）幼苗使豇豆葉面積增加71.2%、生物量也顯著增加（Malaiyandi et al.，2014）。O3脅迫使敏感型大豆的葉面積降低，而耐受型大豆表現(xiàn)出相反的結(jié)果（Britz et al.，2001）。因此，不同的O3濃度通過(guò)誘導(dǎo)特定的生化和分子反應(yīng)，可以對(duì)植物產(chǎn)生不同程度的影響（Li et al.，2021)。

O3濃度迅速變化的這種特性迫使植物經(jīng)常經(jīng)歷高濃度O3脅迫之后的濃度急劇下降，因此植物在受到O3脅迫后必須快速響應(yīng)。因此，在O3污染加劇且濃度迅速變化的條件下，研究在不同濃度O3處理后，O3濃度恢復(fù)時(shí)作物氧化代謝變化，不僅有助于探究作物在恢復(fù)期對(duì)于O3濃度變化的響應(yīng)機(jī)制，而且有助于確定明晰大豆生產(chǎn)中短期O3脅迫后的可修復(fù)濃度（Short et al.，2012；Changey et al.，2018）。大豆是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物，其整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程包括6個(gè)生育時(shí)期，分別為種子萌發(fā)期、幼苗期、分枝期、開(kāi)花期、結(jié)莢鼓粒期和成熟期。大多數(shù)大豆品種具有臭氧的高敏感性（Osborne et al.，2016）。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度臭氧熏蒸處理，9 d后停止臭氧通入，使大豆幼苗在自然環(huán)境下自我修復(fù)，通過(guò)測(cè)定熏蒸處理后恢復(fù)時(shí)期植株的生長(zhǎng)、抗氧化酶活性、非酶抗氧化物質(zhì)水平及抗逆基因的差異表現(xiàn)，擬解決以下問(wèn)題：（1）短時(shí)間的高濃度及低濃度O3熏蒸是否會(huì)引起大豆體內(nèi)ROS爆發(fā)，而誘導(dǎo)特定的生化及分子響應(yīng)，最終導(dǎo)致生殖生長(zhǎng)發(fā)生變化？（2）大豆應(yīng)對(duì)短期高濃度與低濃度O3熏蒸后，恢復(fù)期的抗氧化機(jī)制是否存在差異，是否存在誘導(dǎo)抗性？

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況與實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)區(qū)位于中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)樹(shù)木園（41°46′N(xiāo)，123°26′E），屬北溫帶受季風(fēng)影響的半濕潤(rùn)大陸性氣候，四季分明，雨熱同期，年平均溫度6.2—9.7 ℃，降雨量755.4 mm。樹(shù)木園占地5 hm2，栽培大量東北地區(qū)木本植物，森林覆蓋率達(dá)57.3%，屬城市近自然林（阮亞男等，2008）。

供試大豆品種為遼豆 23號(hào)，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供，2017年5月28日播種。采用內(nèi)徑40 cm，高30 cm的聚乙烯塑料桶進(jìn)行盆栽。每盆裝風(fēng)干土 15.0 kg，施營(yíng)養(yǎng)素 N：1 g·kg-1；P2O5：0.6 g·kg-1；K2O：0.8 g·kg-1。形式分別為：尿素（H2NCONH2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鉀（KCl）。出苗3 d后間苗至每盆4株大豆幼苗，6月30日將植株移入開(kāi)頂式氣室進(jìn)行緩苗。大豆種植期間的水分、肥料均勻一致，無(wú)病蟲(chóng)害及雜草等限制因素。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用開(kāi)頂式氣室（Open-Top Chambers，OTCs）模擬熏蒸方法，設(shè)備為9個(gè)結(jié)構(gòu)完全相同的OTCs（橫截面為正八邊形，直徑4 m，高3 m）及配套的通氣和監(jiān)測(cè)設(shè)備，主要包括臭氧發(fā)生設(shè)備（XH-2000，廣州鑫弘智能環(huán)保設(shè)備有限公司，中國(guó)）、固定式氣體檢測(cè)儀（S-900，Aeroqual Inc.，新西蘭）、臭氧濃度自動(dòng)控制器（Campbell Scientific Inc.，美國(guó)）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)開(kāi)頂箱內(nèi)臭氧濃度，及時(shí)調(diào)整臭氧濃度，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

O3熏蒸試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，O3摩爾分?jǐn)?shù)分別為(40.16±8.22) nmol·mol-1（CK，自然環(huán)境臭氧摩爾分?jǐn)?shù)）、80 nmol·mol-1、200 nmol·mol-1，每個(gè)處理隨機(jī)選擇3個(gè)OTCs，氣室內(nèi)均放置9盆大豆植株。處理時(shí)間為7月3—12日，每天熏蒸O38 h（09:00—17:00），共熏蒸72 h。熏蒸結(jié)束后將植株置于自然臭氧濃度中，進(jìn)入恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)量性狀與生理指標(biāo)的測(cè)定方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定方法

于大豆完熟期每個(gè)處理隨機(jī)選取3株，對(duì)大豆植株進(jìn)行株高和葉面積測(cè)定。葉面積采用剪紙法，測(cè)定其第一完全展開(kāi)葉葉面積。于完熟期在每個(gè)處理內(nèi)隨機(jī)選取3株進(jìn)行套透明紗網(wǎng)袋處理，大豆收獲后取地上及地下構(gòu)件并進(jìn)行分解，地上構(gòu)件包括莖、葉、莢3部分，地下構(gòu)件為根，于75 ℃烘干至恒重并獲得生物量。對(duì)所有大豆植株，測(cè)定單株結(jié)莢數(shù)和籽粒數(shù)，待籽粒自然風(fēng)干后，測(cè)定單株籽粒生物量。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定方法

大豆分枝期進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，取樣時(shí)間為停止急性熏蒸后的第0、1、2、4、8、24、48、72小時(shí)，即不同的恢復(fù)時(shí)間。所取葉片均為完全展開(kāi)葉，用錫紙包裹放入液氮內(nèi)，隨后保存至-80 ℃?zhèn)溆?。帶回?shí)驗(yàn)室后對(duì)樣品進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定：參照鹽酸羥胺法（Ke et al.，2002）測(cè)定O2·-產(chǎn)生速率；硫酸鈦法（Mukherjee et al.，1985）測(cè)定H2O2含量；金屬離子比色法（Pellegrino et al.，2013）測(cè)定AsA及脫氫抗壞血酸（DHA）含量；GR-DTNB（谷胱甘肽還原酶-5, 5′-二硫代-2-硝基苯甲酸）循環(huán)法（Griffith，1980）測(cè)定GSH含量；氮藍(lán)四唑（NBT）還原法（Giannopolitis et al.，1977）測(cè)定SOD活性；紫外吸收法（Pryor，1995）測(cè)定CAT活性；Nakano& Asads方法（Nakano et al.，1981）測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）及谷胱甘肽還原酶（GR）活性；硫代巴比妥酸（TBA）法（Buege et al.，1978）測(cè)定丙二醛（MDA）含量。

1.4 抗逆基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定方法

TRIZOL法提取葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiFiScript cDNA Synthesis Kit，CW2569M）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在NCBI檢索序列信息，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，利用合成的引物對(duì)各基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative real-time PCR，qRTPCR）擴(kuò)增。以Actin3基因作為內(nèi)參，利用 2-ΔΔCt方法（Livak et al.，2001）進(jìn)行計(jì)算，得出大豆中SOD基因家族（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD）、CAT基因家族（CAT1、CAT2、CAT3、CAT4、CAT5）、APX、GR、AO、Aatin3基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2007與SPSS 19.0軟件對(duì)大豆完熟期的主要數(shù)量性狀及分枝期 O2·-產(chǎn)生速率、H2O2含量、丙二醛（MDA）含量、抗壞血酸（AsA）含量、谷胱甘肽（GSH）含量、抗氧化酶活性（APX、DHAR、MDAR和GR），及SOD基因家族、CAT基因家族、APX基因、GR基因相對(duì)表達(dá)量的影響進(jìn)行方差分析，采用t檢驗(yàn)（P＜0.05）比較各指標(biāo)處理間差異的顯著性；采用重復(fù)測(cè)量方差分析恢復(fù)時(shí)間與熏蒸濃度對(duì)大豆以上各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響。應(yīng)用Sigma Plot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)指標(biāo)的比較

經(jīng)方差分析和多重比較，大豆表型主要形態(tài)性狀對(duì)不同濃度臭氧處理的響應(yīng)存在一定的差異（表1）。其中，在生長(zhǎng)性狀上，相同葉序的葉面積和株高在低濃度（80 nmol·mol-1）處理下與對(duì)照值相近，高濃度（200 nmol·mol-1）處理下則顯著低于對(duì)照（P＜0.05）；在物質(zhì)生產(chǎn)和分配上，地上生物量在低濃度處理下與對(duì)照值沒(méi)有顯著差異，高濃度處理下則顯著低于對(duì)照，地下生物量則兩種處理均顯著低于對(duì)照，表明兩種處理對(duì)根系生長(zhǎng)均產(chǎn)生了不利影響；在結(jié)實(shí)性狀上，單株豆莢數(shù)和單株種子數(shù)低濃度處理下均顯著高于對(duì)照，而高濃度處理與對(duì)照無(wú)顯著差異，表明兩種濃度O3處理對(duì)結(jié)實(shí)性狀均未產(chǎn)生不利影響；在種子大小性狀上，單株種子重在低濃度處理下與對(duì)照值相近，高濃度處理下則顯著低于對(duì)照。但兩種濃度O3處理的大豆種子百粒重都顯著低于對(duì)照，表明兩種處理的種子均變小，即不同濃度的O3處理可能對(duì)種子質(zhì)量均產(chǎn)生了不利影響。

表1 不同濃度臭氧處理下大豆主要數(shù)量性狀的多重比較Table 1 Multiple comparison of main quantitative traits of soybean with different ozone concentrations

2.2 葉片生理活性物質(zhì)的變化

2.2.1 活性氧

經(jīng)方差分析和多重比較，O2·-產(chǎn)生速率在低濃度（80 nmol·mol-1）處理下與對(duì)照值無(wú)顯著差異，之后緩慢波動(dòng)，72 h后速率降低12.7%（P＜0.01）；H2O2含量在低濃度處理下與對(duì)照值無(wú)顯著差異。表明低濃度處理并未對(duì)大豆產(chǎn)生不利影響。大豆葉片O2·-產(chǎn)生速率值和 H2O2含量在高濃度（200 nmol·mol-1）處理下顯著升高（P＜0.01），1 h 后達(dá)到最高值，之后逐漸下降，72 h時(shí)與對(duì)照值接近（圖1a、b）。臭氧濃度、恢復(fù)時(shí)間以及兩者的交互處理對(duì)分枝期大豆的 O2·-產(chǎn)生速率（P＜0.01）、H2O2含量（P＜0.01）有顯著影響。

圖1 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片O2·-產(chǎn)生速率、H2O2含量的影響Figure 1 Effects of elevated ozone pretreatment to O2·-production rate, H2O2 content in soybean leaves

2.2.2 抗氧化酶

經(jīng)O3處理的大豆在恢復(fù)期內(nèi)，SOD活性均顯著高于對(duì)照值（P＜0.005），且前24 h高濃度O3處理SOD活性顯著高于低濃度O3處理（圖2a）。CAT含量在低濃度處理后恢復(fù)4 h時(shí)達(dá)到最大值，高濃度處理恢復(fù)8 h時(shí)達(dá)到最大值（圖2b）。表明低濃度O3處理對(duì)SOD、CAT活性可能存在馴化，植株曝露到正?？諝庵锌裳杆倩謴?fù)。臭氧濃度、恢復(fù)時(shí)間以及兩者的交互處理對(duì)分枝期大豆的 SOD（P＜0.01）、CAT活性（P＜0.05）都有顯著影響。

經(jīng)方差分析和多重比較，APX活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，低濃度處理與對(duì)照值在1 h后達(dá)到最大值，8 h后低于對(duì)照值；高濃度處理1 h后顯著低于對(duì)照值，2 h之后顯著升高（P＜0.05）（圖3a）。DHAR活性于高濃度處理下2 h后急劇上升，回落后于72 h后無(wú)顯著差異（圖3b）。MDHAR活性在高低濃度處理后1 h均顯著上升（P＜0.05），之后逐漸下降（圖3c）。GR活性在高低濃度處理下恢復(fù)期間變化趨勢(shì)與對(duì)照值相同（圖 3d）。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表明，恢復(fù)時(shí)間、臭氧濃度及二者的交互作用對(duì)分枝期大豆ASA-GSH循環(huán)的關(guān)鍵酶：APX、DHAR、MDAR和GR活性都有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片AsA-GSH循環(huán)酶活性的影響Figure 3 Effects of elevated ozone pretreatment to the primary enzyme activities in AsA-GSH of soybean leaves

2.2.3 非酶抗氧化物

方差分析和多重比較結(jié)果表明，低濃度處理下，AsA呈波動(dòng)變化，且均高于對(duì)照值；在高濃度處理下恢復(fù)1 h后顯著升高，隨后略有下降（圖4a）。低濃度處理下，DHA在恢復(fù)1 h后顯著降低，4 h后時(shí)達(dá)最大峰值，4—72 h后下降，但與低濃度無(wú)顯著差異；高濃度處理下恢復(fù)1 h后顯著增加了80%，之后緩慢降低（圖4c）。，低濃度處理下，AsA/DHA恢復(fù)期間與對(duì)照值無(wú)顯著差異；高濃度處理下 2 h后呈現(xiàn)最高值狀態(tài)（圖 4e）。低濃度處理下，GSH呈波動(dòng)下降的趨勢(shì)；高濃度處理下恢復(fù)1 h后迅速下降（圖4b）。高低濃度處理下，GSSG在恢復(fù)1 h時(shí)均達(dá)到峰值（圖4d）。GSH/GSSG則在高低濃度處理下恢復(fù)1 h時(shí)顯著降低（圖4f）。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，臭氧濃度、恢復(fù)時(shí)間及兩者交互作用對(duì)分枝期大豆AsA、DHA、AsA/DHA、GSSG與GSH/GSSG均有顯著的影響（P＜0.05），對(duì)GSH、GSSG和GSH/GSSG均有極顯著的影響（P＜0.001）。

圖4 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片抗壞血酸與谷胱甘肽含量的影響Figure 4 Effects of elevated ozone pretreatment to AsA and GSH content in soybean leaves

2.2.4 丙二醛

方差分析和多重比較結(jié)果表明，MDA含量在低濃度處理下與對(duì)照值不存在顯著差異；高濃度處理后1 h顯著升高（P＜0.001），之后持續(xù)下降，48 h后無(wú)顯著差異（圖5）。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，臭氧預(yù)熏蒸濃度與恢復(fù)時(shí)間對(duì)分枝期大豆葉片MDA含量均有極顯著影響（P＜0.001）。

圖5 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片MDA含量的影響Figure 5 Effects of elevated ozone pretreatment to MDA content in soybean leaves

2.3 臭氧熏蒸對(duì)基因表達(dá)水平的影響

量化了分枝期大豆葉片5個(gè)CAT基因（CAT1、CAT2、CAT3、CAT4、CAT5）的轉(zhuǎn)錄水平。CAT1表達(dá)量在低濃度臭氧處理后24 h時(shí)達(dá)到最大值，高濃度處理后8 h時(shí)達(dá)到最大值，顯著上調(diào)，72 h時(shí)高低濃度處理均與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖6a）。CAT2表達(dá)量在高低濃度處理后均顯著上調(diào)，2 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大值（圖6b）。CAT3、CAT5相對(duì)表達(dá)量較低（圖6c、e）。CAT4表達(dá)量在低濃度處理后24 h時(shí)顯著上調(diào)；高濃度處理下8 h時(shí)顯著上調(diào)（圖6d）。

圖6 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片CATs基因表達(dá)水平的影響Figure 6 Effects of elevated ozone pretreatment to CATs genes expression in soybean leaves

量化了分枝期大豆葉片3個(gè)SOD基因（Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD）的轉(zhuǎn)錄水平。Cu/Zn-SOD表達(dá)量在高低濃度處理下均顯著上調(diào)（圖7a）。Mn-SOD相對(duì)表達(dá)量在低濃度處理下0—4 h時(shí)顯著上調(diào)（圖7b）。Fe-SOD表達(dá)量總體較低，僅低濃度處理下在2—4 h顯著上調(diào)，高濃度處理下4 h時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)（圖7c）。

圖7 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片SODs基因表達(dá)水平的影響Figure 7 Effects of elevated ozone pretreatment to SODs genes expression in soybean leaves

APX與GR都是AsA-GSH循環(huán)主要酶。分枝期大豆葉片APX表達(dá)量在低濃度處理下顯著上調(diào)，高濃度處理后2 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，8 h后無(wú)顯著差異（圖8a）。GR表達(dá)量在高低濃度處理后1 h時(shí)顯著上調(diào)，但隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量下調(diào)（圖8b）。

圖8 不同濃度臭氧處理結(jié)束后對(duì)大豆葉片APX、GR基因表達(dá)水平的影響Figure 8 Effects of elevated ozone pretreatment to APX and GR gene expression in soybean leaves

3 討論

近 20年來(lái)，伴隨著中國(guó)城市化和工業(yè)化的快速發(fā)展，大量的溫室氣體排放到空氣中，近地層的O3濃度不斷升高，導(dǎo)致植物長(zhǎng)期面臨臭氧環(huán)境的脅迫作用（Liang et al.，2021）。本研究表明，不同濃度的臭氧脅迫對(duì)大豆植株數(shù)量性狀存在差異性影響，如低濃度（80 nmol·mol-1）臭氧熏蒸后生殖指標(biāo)（豆莢數(shù)和單株粒數(shù)）顯著增加，但種子百粒重下降，而高濃度（200 nmol·mol-1）熏蒸后相關(guān)指標(biāo)均顯著降低。一方面表明低濃度的 O3有利于大豆受到脅迫后的資源權(quán)衡，能量?jī)A向于生殖生長(zhǎng)，單株種子數(shù)增加，但可能導(dǎo)致種子質(zhì)量降低。另一方面高濃度 O3確實(shí)對(duì)大豆的生殖產(chǎn)生不利影響，并且葉面積、株高、地上生物量、地下生物量等營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)指標(biāo)也在脅迫下顯著降低（Malaiyandi et al.，2014；Zhang et al.，2021）。因此，處于恢復(fù)階段的大豆植株將面臨缺少光合產(chǎn)物積累、迅速衰老的困境。而實(shí)際生產(chǎn)中我們?nèi)∮玫氖谴蠖沟姆N子，對(duì)其受到臭氧脅迫后的生理響應(yīng)過(guò)程進(jìn)行探究成為必然的目標(biāo)。

大豆經(jīng)歷驟然高濃度臭氧脅迫后，大豆葉片O2·-產(chǎn)生速率、H2O2含量顯著升高，導(dǎo)致ROS爆發(fā)，造成植物氧化損傷，這印證了第一個(gè)假設(shè)（Vaultier et al.，2015）。已有研究表明，高濃度臭氧熏蒸導(dǎo)致小麥（Triticumaestivum）、辣椒（Capsicum annum）、食莢菜豆（Phaseolusvulgaris）、水稻（Oryza sativa）等植物葉片內(nèi) ROS含量增加（Salvatori et al.，2015；Yamaguchi et al.，2015；Pandey et al.，2018；Macias et al.，2021）。大豆在高濃度臭氧脅迫解除后進(jìn)入恢復(fù)期，體內(nèi)的平衡再次被打破，代謝機(jī)制又一次受到?jīng)_擊，由于過(guò)剩的活性氧水平不能及時(shí)消耗掉，所以大豆葉片 ROS水平在恢復(fù)初期仍有短暫的升高，但隨著恢復(fù)期的延長(zhǎng)，植物逐漸適應(yīng)新的平衡，體內(nèi)過(guò)剩的活性氧被逐步降解。本實(shí)驗(yàn)中低濃度處理下的 ROS水平活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異。在紫外線（UV-B）照射的研究中也觀察到相似的情況（Yang et al.，2014）。

非酶促抗氧化物抗壞血酸和谷胱甘肽在植物應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)具有重要作用（Dumont et al.，2017；Karam et al.，2017）。植物還原型AsA的水平反映了抗壞血酸參與抗氧化反應(yīng)的能力，代表其應(yīng)對(duì)臭氧脅迫的氧化應(yīng)激潛力（Calatayud et al.，2001）。本研究中，大豆在低濃度臭氧處理后的恢復(fù)期內(nèi)總AsA含量增加，還原型AsA與氧化型AsA含量始終保持較高水平，表明大豆的抗氧化能力增強(qiáng)。與之相反，高濃度臭氧處理后AsA含量顯著降低，在恢復(fù)期呈上升趨勢(shì)，有利于加速大豆植株的修復(fù)。另外，O3脅迫可抑制抗氧化酶活性，降低了GSSG的還原比率（Mahalingam et al.，2006），導(dǎo)致高濃度O3處理下大豆GSSG含量急速上升。

植物抗氧化酶活性對(duì)臭氧濃度的升高的響應(yīng)程度受脅迫強(qiáng)度、脅迫時(shí)間以及物種差異共同影響（Sim et al.，2009；Yamaguchi et al.，2015；Pellegrini et al.，2017）。本研究中，恢復(fù)期內(nèi)，短期各O3處理9 d的大豆葉片SOD活性顯著高于對(duì)照。通過(guò)對(duì)Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、Fe-SOD（Bowler，1992；Perry et al.，2009；Alscher et al.，2002）3種SOD相關(guān)的基因表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)臭氧處理下大豆葉片Cu/Zn-SOD表達(dá)量處于相對(duì)較高水平，表明在修復(fù)高濃度O3造成的大豆氧化應(yīng)激中，Cu/Zn-SOD的高表達(dá)對(duì)SOD活性起重要作用。CAT是一種高效的ROS清除劑（Gill et al.，2010；Qiao et al.，2015），本研究發(fā)現(xiàn)高濃度O3使大豆葉片CAT活性下降，但在恢復(fù)期經(jīng)低濃度O3處理CAT活性升高響應(yīng)比對(duì)高濃度O3處理更迅速。目前在大豆中發(fā)現(xiàn)的CAT基因有5種不同亞型，且在高濃度臭氧刺激下均能表達(dá)（Slupphaug et al.，2003）。大豆O3脅迫恢復(fù)期內(nèi)，葉片CAT1整體相對(duì)表達(dá)量較高，CAT活性與CAT1呈顯著正相關(guān)（r=0.429），可見(jiàn)CAT1亞基在控制大豆O3脅迫恢復(fù)期CAT的表達(dá)發(fā)揮主要作用。不同亞型CAT基因在發(fā)揮作用時(shí)確實(shí)具有差異性表達(dá)的特點(diǎn)（Du et al.，2010），在大豆的臭氧脅迫中應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注CAT1基因。大豆APX含量在低濃度臭氧處理后的恢復(fù)初期（0—2 h）顯著高于對(duì)照，但此時(shí)的H2O2含量及CAT活性無(wú)顯著變化，因此在恢復(fù)初期很可能是APX催化的清除H2O2反應(yīng)發(fā)揮主要作用（Kaur et al.，2021）?；謴?fù)4 h時(shí)CAT活性明顯上調(diào)，催化清除H2O2能力得到增強(qiáng)。MDHAR和DHAR可分別將MDHA和DHA還原為ASA。恢復(fù)期間，MDHAR和DHAR活性之和與APX活性值基本相當(dāng)，說(shuō)明大豆葉片內(nèi)AsA合成與消耗可以達(dá)到相對(duì)平衡，從而維持植物氧化還原平衡，降低ROS誘導(dǎo)的對(duì)植物細(xì)胞的損傷（Costa et al.，2021）。

進(jìn)入恢復(fù)期后，大豆ROS經(jīng)抗氧化系統(tǒng)清除調(diào)整后下降，緩解氧化脅迫造成的細(xì)胞膜脂損傷，MDA含量下降。同時(shí)，本研究表明，O3輕度脅迫情況下 ROS的產(chǎn)生和隨后的氧化信號(hào)傳導(dǎo)的改變可能啟動(dòng)其防御機(jī)制，以減輕氧化傷害，在恢復(fù)期內(nèi)大豆代謝恢復(fù)比較迅速，且SOD、CAT等抗氧化酶要顯著高于對(duì)照，抗氧化活性增強(qiáng)（Mahmood et al.，2021）。當(dāng)脅迫強(qiáng)度較高時(shí)，細(xì)胞修復(fù)速率不能跟上ROS的產(chǎn)生速率，便會(huì)加劇氧化應(yīng)激，嚴(yán)重情況下會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷和生理能力喪失（Rozp?dek et al.，2015；Kask et al.，2021）。

4 結(jié)論

低濃度 O3（80 nmol·mol-1）處理大豆在恢復(fù)期內(nèi)，與對(duì)照相比 ROS水平下降，抗氧化酶活性升高，抗氧化物含量升高，抗氧化酶基因表達(dá)量增加，引發(fā)誘導(dǎo)抗性，但輕度的脅迫導(dǎo)致了植物資源的再權(quán)衡，生殖生長(zhǎng)優(yōu)先，單株豆莢數(shù)和種子數(shù)、單株種子重增加，造成當(dāng)代大豆種子產(chǎn)量增加，但種子百粒重減小，種子質(zhì)量可能受影響。高濃度O3（200 nmol·mol-1）處理下恢復(fù)期大豆葉片ROS水平顯著高于對(duì)照與低濃度 O3處理，抗氧化系統(tǒng)清除能力不能迅速緩解氧化傷害誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量ROS，只能隨著恢復(fù)期的延長(zhǎng)，植物在適宜的環(huán)境下逐步緩解高濃度O3處理下誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。但短期的重度O3處理導(dǎo)致大豆生殖生長(zhǎng)受限，植株生物量、種子產(chǎn)量、數(shù)量均有下降。