王文文 馬骉 厲佳麗 許健

人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染被認為是宮頸癌的主要病因之一。全世界70%的宮頸癌病例與高危型HPV16和HPV18的持續(xù)感染相關［1］。我國每年宮頸癌患病人數(shù)10.97萬，尤其在15~44歲年齡段女性中，癌癥感染風險高居第3位［2］。宮頸癌篩查已從單獨的細胞形態(tài)學觀察，發(fā)展到現(xiàn)在的HPV病毒核酸檢測［3］。目前HPV16和HPV18的分子水平檢測技術主要是熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和環(huán)介導等溫擴增技術LAMP（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），前者依賴昂貴儀器不適合現(xiàn)場檢測，后者受限于多重能力不適合多目標同步檢測［4］。HPV基因組中的L1保守區(qū)廣泛用于病毒的鑒定［5］。檢測宮頸上皮細胞樣本中病毒的高保守、高特異性片段，有助于判斷高危型HPV16和HPV18的感染程度。本研究將重組酶聚合酶擴增（RPA）技術［6］與側向流免疫層析技術（LFIC）聯(lián)合［7］，使用銪納米粒子（EuNPs）取代膠體金作為標記物［8］，實現(xiàn)HPV16和HPV18病毒核酸同時檢測，提供一種快速、簡便、敏感、高效的臨床早期篩查方法。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與核酸提取 選取2019年8月至2020年1月浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院采集的女性宮頸分泌物樣本248例。樣本經(jīng)過PCR-反向點雜交法［人乳頭瘤病毒基因分型（23型）檢測試劑盒］篩查后確定HPV病毒感染分型。選取單一感染（n=123），混合感染（n=60）和陰性（n=65）樣本，其中HPV16陽性樣本29例，HPV18陽性樣本26例，保存在-80 ℃。采用裂解法快速提取病毒基因組DNA：取200 μL樣本液，與裂解液［800 mM鹽酸胍，50 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.5% Triton-X100，1% Tween-20，40 μg/mL 蛋白酶K］混勻后，95 ℃孵育10 min。6,000 r/min離心，1 min后，上清液保存在-20℃，用于核酸擴增。

1.2 主要試劑與儀器 羧基修飾的EuNPs［購自和卓生物科技（上海）有限公司）］；牛血清白蛋白（BSA）、Triton-X100（購自美國Sigma-Aldrich公司）；羊抗鼠二抗、Hi-Flow Plus 180硝酸纖維素膜（300×25 mm）、Ahlstrom玻璃纖維膜（用作樣品墊和結合墊）、H21吸水紙（用作吸水墊）與PVC底板（購自浙江迪恩生物科技股份有限公司）；nfo RPA恒溫擴增試劑盒（購自英國TwistDX公司）；Tween-20（購自阿拉丁試劑（上海）有限公司）；其他化學試劑均為分析純（購自上海國藥集團化學試劑有限公司）。Mini-6KS便攜式低速離心機（杭州奧盛儀器有限公司）用于HPV病毒基因組的快速提取；T2DDA臺式點膜噴金一體機、C6切條機（杭州韓感科技有限公司）用于制備熒光免疫層析試紙條；365 nm便攜式紫外燈（北京海天有誠科技有限公司）用于觀察熒光試紙條視覺檢測結果分析；FICS2011-B14熒光讀數(shù)儀（蘇州海爾曼精密儀器有限公司）用于EuNPs熒光試紙條的掃描分析；F-4500熒光光譜儀（日本東京Hitachi公司）用于EuNPs納米顆粒及其標記單克隆抗體探針的表征分析。

1.3 引物和探針設計 針對HPV16和HPV18基因保守區(qū)域（L1），使用Primer 5軟件自行設計特異性引物和探針。選取序列的GenBank登錄號分別為HPV16（FJ797058.1）和HPV18（MH057744.1）。采用地高辛（Digoxin）標記下游引物，生物素（Biotin）和羧基熒光素（FAM）分別標記nfo探針。引物和探針見表1。

表1 HPV16和HPV18特異性RPA引物探針序列

1.4 熒光免疫層析試紙條的制備 用800 μL MES緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2）溶解2 mg羧基修飾的EuNPs。加入30 μL的EDC孵育30 min后，離心（12,000 r/min，25 min）去除多余活化劑。加入10 μg抗地高辛單克隆抗體（anti-digoxin mAb）攪拌偶聯(lián)（25℃，2 h），離心（12,000 r/mim，2 min）去除多余抗體。重懸沉淀后的EuNPs-mAb保存在4℃?zhèn)溆谩Ｃ庖邔游鲈嚰垪l由樣品墊，結合墊，硝酸纖維素膜，吸水紙和PVC底板組成。NC膜上的兩條測試線和控制線間隔3 mm，分別固定1.2 mg/mL抗FAM抗體（anti-FAM antibody，T1線）、0.8 mg/mL抗生物素抗體（anti-biotin antibody，T2線）和1.5 mg/mL羊抗鼠二抗（IgG，C線）。EuNPs-mAb稀釋20倍，以1 μL/cm的噴涂量均勻分布在結合墊上。NC膜和結合墊置于37℃恒溫干燥箱2 h。試紙條組裝后室溫干燥，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙重EuNPs-LFIC-RPA檢測 RPA反應體系體積為50 μL，包含2x反應緩沖液、10 μmol/L引物、2.5 μmol/L探針、14 μmol/L醋酸鎂、反應酶和模板DNA。反應液37℃孵育10 min，用Tris buffer（pH 8.0）稀釋50倍后滴入熒光免疫層析試紙條。靜置5 min后，在365 nm紫外燈下觀察結果。隨后利用FIC-S2011-B14熒光讀數(shù)儀掃描EuNPs熒光試紙條，進行定量分析。

1.6 參數(shù)優(yōu)化 為達到最優(yōu)的檢測效果，對引物探針濃度比例、核酸擴增時間、抗體標記量、試紙條包被濃度、免疫孵育時間、EuNPs-mAb偶聯(lián)物與單克隆抗體濃度等進行優(yōu)化。引物探針濃度比例分別設置為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8；核酸擴增時間分別設置為5、10、15、20 min；抗體標記濃度分別設置為2.5、5、10、20、40 μg/mL；T線包被抗體濃度依次為：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，C線包被抗體濃度依次為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL；試紙條孵育時間分別設置為1、5、10、20 min；T線抗體包被抗體濃度依次為：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，EuNPs-mAb偶聯(lián)物濃度依次為：2、4、6、8、10 ng/mL。每個參數(shù)條件測試3次記錄數(shù)據(jù)進行分析。

1.7 樣品分析 通過10倍濃度梯度稀釋提取的HPV16和HPV18病毒DNA進行敏感度實驗。以濃度對數(shù)值為X軸，以相對熒光強度（T/C值）為Y軸繪制標準曲線。應用其他亞型樣本提取DNA進行特異性測試，觀察是否出現(xiàn)交叉反應。采用EuNPs-LFIC-RPA方法檢測樣本，結果與PCR-反向點雜交法對比。

1.8 統(tǒng)計學方法 計數(shù)資料以n（%）表示，采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光免疫層析試紙條結果判讀 RPA上游引物與標記了地高辛的下游引物配對，同時加入與下游引物重疊區(qū)同源且標記熒光素的nfo探針進行反應。利用nfo酶識別探針中四氫呋喃（THF）位置的特點，通過Bsu聚合酶延伸，生成FAM或Biotin標記的雙鏈DNA擴增產(chǎn)物。RPA擴增產(chǎn)物一端被EuNPs-mAb捕獲，另一端被標記對應基團的特異性抗體捕獲并固定在T線處。固定在C線上的pAb作為分析對照，捕獲EuNPs-mAb。在365 nm激發(fā)光下獲得熒光信號，借助讀數(shù)儀獲取T線與C線的熒光信號強度比。若T1線或T2線檢測出熒光值，分別表明HPV16和HPV18為陽性；若C線無熒光值，證明試紙條失效。

2.2 參數(shù)優(yōu)化 通過優(yōu)化實驗確定，引物探針濃度比例為1∶1時，HPV16和HPV18擴增效果最好。RPA反應進行到10 min后，相對熒光強度（T/C值）趨于平穩(wěn)。制備熒光探針（EuNPs-mAb）的抗體標記量為5 μg/mL時，獲得最高的測試熒光值。T線包被抗體濃度為0.8 mg/mL，C線包被抗體濃度為1.5 mg/mL，EuNPs-mAb偶聯(lián)物濃度為8 ng/mL時，T/C值最高。試紙條孵育5 min即可達到理想的讀數(shù)狀態(tài)。

2.3 敏感度和特異性評估 敏感度實驗結果顯示，EuNPs-LFIC-RPA可以檢測到100 ng/μL水平的HPV病毒。應用最小二乘法擬合，以相應病毒濃度對數(shù)值為橫坐標，相對熒光強度（T/C值）為縱坐標，得到線性回歸方程分別為HPV16：y=0.2653x-0.0108，R2=0.9926；HPV18：y=0.2852x-0.177，R2=0.9911。相關系數(shù)表明在106~100 ng/μL范圍內(nèi)線性較好。特異性實驗結果中，HPV其他亞型擴增后，并未測得熒光值，只有HPV16和HPV18擴增產(chǎn)物掃描得到較高的熒光值。

2.4 實際樣本檢測分析 采用EuNPs-LFIC-RPA方法對經(jīng)過PCR-反向點雜交法鑒定的248例臨床樣本檢測，HPV16、HPV18和HPV16/18的陽性檢出率分別為12.50%、11.29%和19.35%，均略高于試劑盒檢測結果（見表2）。EuNPs-LFIC-RPA方法檢測HPV16的陽性預測值和陰性預測值分別為90.32%和99.54%；檢測HPV18的陽性預測值和陰性預測值分別為85.71%和99.09%；同時檢測HPV16和HPV18的陽性預測值和陰性預測值分別為100%和98.50%。

表2 EuNPs-LFIC-RPA方法和PCR-反向點雜交法檢測臨床樣本的結果比較

3 討論

HPV是DNA病毒，其主要結構蛋白為HPVLl蛋白，HPVLl蛋白和L2蛋白構成HPV衣殼蛋白，HPV衣殼蛋白包裹HPV形成新的病毒顆粒，高危型HPVLl蛋白為變異體，和L2蛋白不能組裝成HPV病毒顆粒，從而使DNA病毒在宿主細胞內(nèi)大量復制并整合到宿主細胞DNA中，引起感染HPV的細胞無限增殖，導致細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［9］。HPV有多種亞型，引起宮頸病變的有30多種亞型，HPV16和HPV18是最常見的高危型HPV感染亞型，高危型HPV感染后更易導致感染細胞發(fā)生永生化，使病毒清除時間延長，從而引起HPV感染，不僅引起外生殖器疣，還可引起宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌等［10］，而早期宮頸癌患者的預后相對較好。因此，針對性開展HPV基因檢測及基因分型篩查，能及時發(fā)現(xiàn)宮頸癌高危人群，且可對HPV陽性群體風險進行分級評價，有利于對病情準確評估，也可減少對患者過度的有創(chuàng)診斷。

早期宮頸細胞學檢查是做好癌前病變篩查的主要方法，有助于降低宮頸癌罹患風險并及早預防治療［11］。針對高危型HPV病毒的分子水平檢測技術，除了作為細胞學檢查的輔助方法，越來越多地應用到臨床檢測領域［12-13］。本研究建立的EuNPs-LFIC-RPA檢測方法，采用RPA技術在37℃等溫條件下具有快速擴增未經(jīng)純化微量核酸樣品的獨特優(yōu)勢，加上免疫層析技術非常適合現(xiàn)場診斷的特點，通過檢測熒光信號強度定量分析病毒載量，實現(xiàn)對宮頸細胞樣本內(nèi)高危亞型HPV16和HPV18病毒的聯(lián)合快速篩查。核酸擴增過程中可能會出現(xiàn)干擾結果，假陰性結果可能誤導診斷且喪失最佳治療時機，假陽性結果可能帶來頻繁復查和心理負擔。使用熒光納米材料EuNPs取代傳統(tǒng)膠體金，不僅提高檢測敏感度，還減少假陰性結果的出現(xiàn)。核酸擴增體系加入的nfo探針，不僅可以更好地與免疫層析試紙條銜接，更增加識別目標片段的特異性，降低假陽性檢測風險。