劉曉飛 張爽爽 EndriHendriansyah 李英瑞 蘇 琳 李相前 修云吉 顧 偉

牙鲆半乳糖凝集素6基因的克隆、表達(dá)及功能研究*

劉曉飛1,2張爽爽2EndriHendriansyah1李英瑞1,2蘇 琳2李相前3修云吉2顧 偉1①

(1. 南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇 南京 210023；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 山東 青島 266109；3. 淮陰工學(xué)院 江蘇省益生制劑重點建設(shè)實驗室 江蘇 淮安 223003)

半乳糖凝集素6 (-)是-半乳糖苷結(jié)合凝集素家族的成員之一。本研究首次分離并鑒定了牙鲆()-(-)，分析了其分子特征和表達(dá)模式，并對其免疫相關(guān)功能進(jìn)行了研究。-基因的開放閱讀框長為1089 bp，共編碼362個氨基酸，其中包含2個糖識別結(jié)構(gòu)域(CRDs)。同源序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，-與大菱鲆()-的相似性為80.9%。組織分布結(jié)果顯示，-基因主要在腸組織中特異性表達(dá)。遲緩愛德華氏菌()感染后，-基因在腸組織中的表達(dá)顯著升高，感染后12 h表達(dá)量最高，隨后逐漸降低并恢復(fù)至正常水平。細(xì)菌結(jié)合實驗證實，-重組蛋白(rPoGalectin-6)能夠結(jié)合枯草芽孢桿菌()、蠟樣芽孢桿菌()、殺鮭氣單胞菌()、遲緩愛德華氏菌和創(chuàng)傷弧菌()，但并不結(jié)合短小芽孢桿菌()。此外，rPoGalectin-6以鈣離子依賴的方式對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、殺鮭氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌表現(xiàn)出明顯的凝集作用。研究表明，-基因參與了由遲緩愛德華氏菌感染引起的免疫應(yīng)答，這一發(fā)現(xiàn)為探索-在硬骨魚類中的免疫功能奠定了基礎(chǔ)。

糖凝集素6；牙鲆；遲緩愛德華氏菌；免疫應(yīng)答

半乳糖凝集素(galectins)是一種能夠體外結(jié)合-半乳糖苷的可溶性凝集素，其家族成員按分子結(jié)構(gòu)特征可分為原型、嵌合型和串聯(lián)重復(fù)型(Thijssen, 2015)。半乳糖凝集素廣泛存在于動物中，目前，共有15種半乳糖凝集素被分離、鑒定并命名，其相關(guān)功能已在許多物種中被廣泛研究，包括真菌(Butschi, 2010)、刺胞動物門(Hwang, 2010)、昆蟲(Rao, 2016)、線蟲(Takeuchi, 2016)、軟體動物(Bai, 2018)、頭索動物(Yu, 2007)和尾索動物(Vizzini, 2012)等。研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素在生物體的許多生物過程中發(fā)揮作用，如細(xì)胞粘附(Ferragut, 2019)、細(xì)胞凋亡(Liu, 2011)、炎癥反應(yīng)(Nita-Lazar, 2015)和腫瘤轉(zhuǎn)移(Shatz- Azoulay, 2020)等。

半乳糖凝集素6 (-)是一種典型的串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素，-在動物體內(nèi)的功能研究尚不全面。研究發(fā)現(xiàn)，埃及伊蚊()體內(nèi)的-能阻礙cry11aa [蘇云金芽孢桿菌()產(chǎn)生的一種晶體毒素，對埃及伊蚊有致命毒性]與堿性磷酸酶1 (ALP1)和氨肽酶N (APN2)結(jié)合，對埃及伊蚊體起到保護(hù)作用(Hu, 2020)。對小鼠()-()研究發(fā)現(xiàn)，是一種新型的抗菌蛋白(antimicrobial proteins, AMPs)，可能起到調(diào)節(jié)皮膚纖維化的作用，其表達(dá)水平受皮膚微生物組的影響(Natsuga, 2016)。此外，Gitt等(1998)研究發(fā)現(xiàn)，和小鼠-()具有高度的同源性，在小鼠消化道中，與的表達(dá)模式幾乎相同，且和在核酸水平和氨基酸水平的一致性分別高達(dá)93%和83%，暗示它們在小鼠體內(nèi)可能具備相似的功能。研究表明，-參與炎癥反應(yīng)、腸上皮傷口愈合(Paclik, 2008)和腸道中表達(dá)人類血型抗原的大腸桿菌()殺滅過程(Stowell, 2010)，但-是否具有類似功能，還需要進(jìn)一步驗證。事實上，-可能有一些尚未證實的潛在功能。Houzelstein等(2013)推測，-的潛在功能并不是由其表達(dá)模式的改變引起的，而可能是由其特異性結(jié)合新配體的獨特蛋白結(jié)構(gòu)引起的。

目前，有關(guān)-的報道主要集中在哺乳動物中，而在硬骨魚類中缺乏相關(guān)研究。本研究在牙鲆()中發(fā)現(xiàn)一種-(-)，對-的基因序列和氨基酸序列進(jìn)行分析鑒定，構(gòu)建-與串聯(lián)重復(fù)型galectins (-、-、-和-)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，驗證-在免疫組織中的分布和表達(dá)水平，表達(dá)純化重組PoGalectin-6蛋白用于細(xì)菌結(jié)合和凝集實驗，可為進(jìn)一步研究-的相關(guān)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牙鲆購自山東煙臺，平均體重為(120±10) g，平均體長為(22±3) cm。健康牙鲆在15℃水溫海水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d。遲緩愛德華氏菌()為本實驗室保存菌種，經(jīng)16S rRNA測序進(jìn)行菌種鑒定。

1.2 樣品處理和采集

隨機取9條健康牙鲆進(jìn)行組織取樣，每3條魚的肝、脾、腎、腦、鰓、腸、皮膚和肌肉組織混合作為1個生物學(xué)重復(fù)，樣品在液氮中快速冷凍后轉(zhuǎn)移至–80℃保存，用于總RNA提取。

采用浸泡法對健康牙鲆進(jìn)行遲緩愛德華氏菌 (6×107CFU/mL)感染實驗，感染2 h后轉(zhuǎn)入海水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)正常養(yǎng)殖。在感染之前，隨機抽取9條健康牙鲆的腸組織作為對照(0 h)，恢復(fù)養(yǎng)殖后的2、8、12、24、48和72 h分別取9條魚的腸組織，按上述方法冷凍保存，留待實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。

1.3 RNA提取和cDNA制備

根據(jù)TRIzol試劑盒(Invitrogen, 美國)的說明書，進(jìn)行組織的總RNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，用超微量分光光度計(Thermo Scientific, 中國)檢測其純度和濃度。用PrimeScript? RT reagent kit (TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系：2 μL 5× PrimeScript Buffer，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5 μL Oligo dT Primer，0.5 μL Random 6 mers，Total RNA用量為500 μg，補充RNase Free dH2O至10 μL。上述反應(yīng)體系在37℃條件下反轉(zhuǎn)錄15 min，然后，于85℃反應(yīng)5 s，使反轉(zhuǎn)錄酶失活。將cDNA在–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PoGalectin-6基因序列分析

利用NCBI網(wǎng)站Blast程序(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)對-基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比對；利用Open Reading Frame Finder (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找ORF；使用SMART (simple modular architecture research tool)在線軟件分析PoGalectin-6蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.5 PoGalectin-6同源序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI網(wǎng)站查詢不同物種的串聯(lián)重復(fù)型galectins (Galectin-6、Galectin-4、Galectin-8和Galectin-9)的氨基酸序列。采用DNAMAN軟件對PoGalectin-6 (XP_019943943.1)與硬骨魚類Galectin-6和Galectin-4的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，包括斑馬擬麗魚() Galectin-6(XP_023009370. 2)、白斑狗魚() Galectin-6 (XP_019900129.1)、秀美花鳉() Galectin-6(XP_016527155. 1)、大菱鲆() Galectin-4 (AXR99075.1)、烏鱧() Galectin-4 (KAF3693285.1)和尼羅羅非魚() Galectin-4(XP_025753881.1)。

1.6 PoGalectin-6基因qRT-PCR分析

根據(jù)-基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計-特異性引物(--qF和--qR)，以牙鲆基因作為內(nèi)參，引物序列見表1。使用TB Green?Premix ExTMⅡ(TaKaRa, 日本)試劑盒，qRT-PCR按照說明書于BioRad CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為10 μL：5 μL TB Green Premix ExⅡ(2×)，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，0.8 μL模板cDNA，3.4 μL ddH2O。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 30 s；95℃ 5 s，65℃ 1 min，擴增35個循環(huán)；熔解曲線95℃ 10 s，65℃ 5 s，95℃ 0.5℃/cycle。采用2-ΔΔCt方法計算-基因的相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。使用SigmaPlot 11.0軟件作圖以及單因素方差分析(one-way ANOVA)，<0.05為具有顯著性差異。

1.7 重組PoGalectin-6的表達(dá)純化

根據(jù)-基因序列合成一對引物--eF和--eF(表1)，用于擴增-基因。PCR擴增體系為25 μL：12.5 μL 2×PCR Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，2 μL模板cDNA，9.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，擴增34個循環(huán)；延伸72℃ 1 min，4℃冷卻。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR結(jié)果進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果無誤后，將PCR產(chǎn)物回收，并利用超微量分光光度計檢測其純度和濃度。使用相同的限制性內(nèi)切酶(RⅠ和dⅢ)對PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行處理，使用T4 DNA連接酶將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒連接，構(gòu)建--重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，使用0.5mmol/L IPTG于37℃條件下培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，同時，以未加IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對照組，通過超聲破碎法提取-重組蛋白(rPoGalectin-6)。將破碎后的菌液于12 000 r/min、4℃離心10 min后，收集沉淀進(jìn)行變性及復(fù)性，然后經(jīng)Ni-NTA樹脂純化，并利用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定。rPoGalectin-6蛋白濃度通過Bradford法進(jìn)行測定。

1.8 rPoGalectin-6與微生物的親和力檢測

通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測rPoGalectin-6對3株革蘭氏陽性菌[枯草芽孢桿菌()、蠟樣芽孢桿菌()和短小芽孢桿菌()]及3種革蘭氏陰性菌[殺鮭氣單胞菌()、遲緩愛德華氏菌和創(chuàng)傷弧菌()]的親和力。上述細(xì)菌均取自本實驗室保存菌種，將上述細(xì)菌于磷酸鹽緩沖液(PBS)中重懸至1×108CFU/mL，各取100 μL的細(xì)菌懸液置于96孔EIA/RIA板(康寧，中國)，4℃下過夜培養(yǎng)。然后每孔加入250 μL封閉緩沖液(5%脫脂奶粉溶于PBST)，繼續(xù)在4℃條件下封閉1 h。用PBS將rPoGalectin-6稀釋至終濃度分別為0.1、1和5 μg/mL，以PBS作為對照，各取100 μL rPoGalectin-6加入孔中，并在22℃下培養(yǎng)1 h，每個蛋白濃度均設(shè)置3個平行。接著將小鼠抗His抗體(全式金，中國)按照1∶2000的比例稀釋至5%脫脂奶粉中，分別向每孔中加入100 μL小鼠抗His抗體，并在37℃下孵育1 h。然后，將羊抗鼠IgG (全式金，中國)按照1∶4000的比例稀釋至5%脫脂奶粉中，分別向每孔中加入100 μL含HRP標(biāo)簽的羊抗鼠IgG，并于37℃下孵育1 h。在上述每一步結(jié)束時，均用300 μL PBST洗滌3次。以上反應(yīng)結(jié)束后，分別向每孔加入100 μL TMB溶液顯色5 min，最后每孔加入100 μL濃度為1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，在450 nm處測定吸光值。

表1-基因克隆和熒光定量所用引物

Tab.1 Primers for PCR and qRT-PCR of PoGalectin-6 gene

1.9 rPoGalectin-6與微生物的凝集活性檢測

利用2株革蘭氏陽性菌(短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)和2株革蘭氏陰性菌(殺鮭氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌)檢測rPoGalectin-6的細(xì)菌凝集活性，上述細(xì)菌均取自本實驗室保存菌種。將細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)中期后重懸于Tris緩沖鹽溶液(TBS)中至終濃度為1×108CFU/mL。實驗組處理方法：將25 μL rPoGalectin-6蛋白(60 μg/mL)與25 μL各菌液在室溫下混合均勻，并加入5 μL濃度為0.1 mol/L的CaCl2溶液，置于200 r/min搖床中培養(yǎng)1 h。同時，將rPoGalectin-6蛋白和細(xì)菌混合培養(yǎng)作為對照組，驗證無Ca2+存在的情況下rPoGalectin-6蛋白的微生物凝集活性。在相同條件下，用相同體積和濃度的牛血清白蛋白(BSA)代替rPoGalectin-6蛋白作為空白對照組。微生物凝集實驗結(jié)果均在光學(xué)顯微鏡下觀察得到。

2 結(jié)果

2.1 PoGalectin-6基因序列分析和結(jié)構(gòu)特征

通過NCBI網(wǎng)站對-的核酸序列進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，-的ORF長1089 bp，共編碼362個氨基酸(aa)，預(yù)測其分子量為39.11 kDa，理論等電點(pI)為5.89。利用SMART軟件對其氨基酸序列分析，顯示PoGalectin-6是一個串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素，在其ORF兩端各有1個糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，長度分別為127 aa和126 aa。2個CRD之間通過一個長度為65 aa的富含甘氨酸的連接區(qū)域連接。此外，PoGalectin-6的2個CRD均含有一個典型的-半乳糖苷結(jié)合基序(HXNPR，X代表任何氨基酸) (圖1)。

2.2 PoGalectin-6的同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將PoGalectin-6與其他硬骨魚類的Galectin-6和Galectin-4進(jìn)行同源比對，顯示其相似性為58.10%～ 80.90%。其中，PoGalectin-6與大菱鲆Galectin-4的相似性最高，為80.90%；與尼羅羅非魚Galectin-4的相似性最低，為58.10%。將PoGalectin-6與上述6種串聯(lián)重復(fù)型galectins進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果顯示，不同硬骨魚類的Galectin-6和Galectin-4的2個CRD并不保守，但在每個CRD上都存在一段高度保守的氨基酸基序HXNPR (X代表任何氨基酸)(圖2)。

利用MEGA 5.0軟件對PoGalectin-6與其他硬骨魚類的串聯(lián)重復(fù)型galectins (Galectin-6、Galectin-4、Galectin-8和Galectin-9)的氨基酸序列比對，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹由兩大分支組成，Galectin-6和Galectin-4聚為一支，Galectin-8和Galectin-9聚為一支。PoGalectin-6在進(jìn)化上與大菱鲆Galectin-4親緣關(guān)系最為密切，與其他物種的Galectin-8和Galectin-9親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 PoGalectin-6的組織分布

利用qRT-PCR方法分析-在不同組織(肝、脾、腎、腦、腸、鰓、皮膚和肌肉)中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，-在組織中的表達(dá)具有明顯的特異性(圖4)，-主要在牙鲆的腸組織中有大量表達(dá)。相對于腸組織中的表達(dá)量，在腦、皮膚以及肌肉組織中表達(dá)量非常低，而在肝、脾、腎和鰓組織中均不表達(dá)。

2.4 遲緩愛德華氏菌感染后PoGalectin-6在腸組織中的表達(dá)

遲緩愛德華氏菌感染牙鲆能夠誘導(dǎo)-在腸組織中的表達(dá)變化。在感染0、2、8、12、24、48、72 h，-在腸組織中的表達(dá)水平如圖5所示，-呈現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)趨勢。其表達(dá)水平在感染后12 h呈現(xiàn)顯著上調(diào)，并達(dá)到峰值，是0 h表達(dá)量的4.2倍。感染后48 h達(dá)到第2個峰值，是0 h表達(dá)量的2.4倍，隨后-表達(dá)水平下降，并在感染后72 h恢復(fù)至正常水平。

2.5 重組PoGalectin-6蛋白的表達(dá)純化

以為表達(dá)載體，重組PoGalectin-6蛋白經(jīng)鎳柱分離純化，純化的rPoGalectin-6蛋白包含來自載體質(zhì)粒約15 kDa的標(biāo)簽蛋白和39.11 kDa的PoGalectin-6蛋白。重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分析(圖6)，在55 kDa處有條帶，與預(yù)測目的條帶大小基本一致。陰性對照和上清液中均未發(fā)現(xiàn)目的條帶，說明成功表達(dá)并分離純化了rPoGalectin-6蛋白。

2.6 rPoGalectin-6蛋白與微生物結(jié)合能力

rPoGalectin-6蛋白與微生物結(jié)合實驗驗證了對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的結(jié)合能力。結(jié)果如圖7所示，rPoGalectin-6與微生物的結(jié)合能力與細(xì)菌種類有關(guān)，其對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、殺鮭氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌和創(chuàng)傷弧菌均表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力，且蛋白濃度越高，其結(jié)合能力越強，而rPoGalectin-6蛋白與短小芽孢桿菌并沒有表現(xiàn)出明顯的結(jié)合能力。

圖1 牙鲆Galectin-6 ORF序列和推測的氨基酸序列

左邊的數(shù)字代表核苷酸和推測的氨基酸序列。紅色字體表示起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)。黃色陰影的氨基酸序列代表2個CRD。紅色陰影的氨基酸序列代表連接區(qū)域。黑框代表CRD中的保守基序HXNPR(X代表任何氨基酸)。

The numbers on the left represent the nucleotide and deduced amino acid sequences. Red font indicates the start codon (ATG) and the stop codon (TGA). The yellow shaded amino acid sequence represents two CRDs. The red shaded amino acid sequence represents the linker. The black boxes represent the conserved motifs HXNPR (X represents any amino acid) in the CRD.

圖2 PoGalectin-6多序列比對

氨基酸序列比對采用DNAMAN軟件構(gòu)建。紅框代表2個CRD。黃框代表CRDs中的保守基序HXNPR (X代表任何氨基酸)。

The amino acid sequence alignment was constructed by the DNAMAN. Red boxes represent two CRDs. The yellow boxes represent the conserved motifs HXNPR (X represents any amino acid) in CRDs.

圖3 PoGalectin-6與其他硬骨魚類的串聯(lián)重復(fù)型galectins的系統(tǒng)進(jìn)化樹

使用MEGA 5.0中的neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，構(gòu)建了-和-、-、-和-等串聯(lián)重復(fù)型galectins的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

Phylogenetic tree was constructed using a neighbor-joining algorithm in MEGA 5.0. The phylogenetic trees of-and other tandem repeats galectin was constructed, including-,-,-, and-.

圖4 PoGalectin-6在牙鲆正常組織中的相對表達(dá)量

2.7 rPoGalectin-6蛋白與微生物凝集活性

細(xì)菌凝集實驗結(jié)果如圖8所示，rPoGalectin-6蛋白均能夠顯著凝集短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、殺鮭氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌。對照組中，BSA并未展現(xiàn)出對細(xì)菌的凝集反應(yīng)。此外，在Ca2+不存在的情況下，rPoGalectin-6蛋白未表現(xiàn)出明顯的細(xì)菌凝集現(xiàn)象，這說明只有在Ca2+存在的情況下，rPoGalectin-6才能展現(xiàn)出較強的微生物凝集活性。

圖5 遲緩愛德華氏菌感染牙鲆后腸道中PoGalectin-6的表達(dá)水平

以0 h時的表達(dá)水平為對照，不同時間點(2、8、12、24、48和72 h)的表達(dá)量通過qRT-PCR獲得。*代表顯著性差異(<0.05)。

The data determined by qRT-PCR at different time points (0, 2, 8, 12, 24, 48, and 72 h) compared with the 0 h time point respectively. The symbol * represent<0.05.

圖6 純化rPoGalectin-6蛋白的SDS-PAGE分析

M：蛋白質(zhì)Marker；1：未誘導(dǎo)的細(xì)菌總提取物；2：未誘導(dǎo)的細(xì)菌提取物沉淀；3：未誘導(dǎo)的細(xì)菌提取物上清液；4：誘導(dǎo)的細(xì)菌總提取物；5：誘導(dǎo)的細(xì)菌提取物沉淀；6：誘導(dǎo)的細(xì)菌提取物上清液；7：純化的rPoGalectin-6蛋白

Lane M: Molecular weight marker; Lane 1: Total soluble cellular extract from negative control; Lane 2: Total precipitation cellular extract from negative control; Lane 3: total supernatant cellular extract from negative control; Lane 4: Total soluble cellular extract from the experimental group; Lane 5: Total precipitation cellular extract from the experimental group; Lane 6: Total supernatant cellular extract from the experimental group; Lane 7: Concentrated purified recombinant-

圖7 rPoGalectin-6蛋白與微生物結(jié)合能力驗證

*代表與PBS組相比具有顯著性差異(<0.05)。

* indicates a significant difference compared with PBS (<0.05).

圖8 rPoGalectin-6蛋白與微生物的凝集活性

3 討論

半乳糖凝集素是一種具有保守CRD的可溶性凝集素，它們廣泛存在于哺乳動物和昆蟲體內(nèi)，并在機體免疫過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物體內(nèi)，半乳糖凝集素主要參與細(xì)胞粘附、生長調(diào)節(jié)和免疫等生物過程，尤其在疾病防控等方面起到關(guān)鍵作用(Oyanadel, 2018; Rao, 2016; Wdowiak, 2018)。雖然在哺乳動物中已經(jīng)鑒定出-，但在硬骨魚中尚無-的相關(guān)研究，因此，其應(yīng)對細(xì)菌感染的免疫功能尚不清楚。本研究通過分析-的分子特征，探究其在體內(nèi)發(fā)揮的相關(guān)功能，旨在為硬骨魚類中-的功能研究奠定基礎(chǔ)。

本研究成功從牙鲆體內(nèi)分離并鑒定了-，序列分析表明，-是一種標(biāo)準(zhǔn)的串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素，它擁有2個能夠特異性識別并結(jié)合糖的CRD，每個CRD上都包含一個非常保守的糖結(jié)合基序(HXNPR，X代表任何氨基酸)，CRD之間是由65個氨基酸編碼的富含甘氨酸的結(jié)合肽組成的連接區(qū)域。同源序列比對分析表明，-與大菱鲆-相似性最高(80.90%)，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，-和-分布在同一分支。同源序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹實驗結(jié)果證實，-與大菱鲆-親緣關(guān)系上更接近，這也與Gitt等(1998a)發(fā)現(xiàn)和高度相似的結(jié)論相一致。Gitt等(1998b)是在研究小鼠的過程中意外發(fā)現(xiàn)一個由8個外顯子編碼、具有2個CRD的新的串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素，即。隨后，將與進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，二者同源性非常高，不同之處在于，的2個CRD之間的連接區(qū)域相較于缺少24個氨基酸。因此，Gitt等(1998b)推測，連接區(qū)域長度的差異可能會影響CRD間交聯(lián)配體的功能活性，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠和存在功能上的差異。這種現(xiàn)象在哺乳動物的-中已有先例，如哺乳動物腸道中的-具有較長的連接區(qū)域，而其他組織中的-則具有較短的連接區(qū)域，這表明連接區(qū)域的長度差異可能導(dǎo)致不同組織中-的功能差異(Wada, 1997)。

為了明確-是否在牙鲆機體免疫過程中發(fā)揮作用，在遲緩愛德華氏菌感染牙鲆72 h內(nèi)，對-的組織分布情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，-主要在牙鲆腸組織中大量表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量非常低或基本不表達(dá)，這與Houzelstein等(2013)發(fā)現(xiàn)的小鼠體內(nèi)僅在腸胃中有表達(dá)的結(jié)果一致。鑒于腸道是硬骨魚體內(nèi)能識別微生物并促進(jìn)免疫排斥的主要粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)之一(Fermino, 2011)，且-與均在腸道組織中具有類似的表達(dá)分布，因此，對-是否在牙鲆體內(nèi)也作為抗菌蛋白在免疫中發(fā)揮重要作用進(jìn)行進(jìn)一步驗證。攻毒實驗顯示，遲緩愛德華氏菌感染牙鲆后12 h內(nèi)，腸組織內(nèi)-的表達(dá)量增加了4倍以上，說明-在遲緩愛德華氏菌入侵后參與了機體的免疫應(yīng)答。

半乳糖凝集素作為模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)，可以直接與細(xì)菌和寄生蟲表面的多聚糖相互作用，在抵抗微生物感染的過程中起到調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用(Shi, 2018)。微生物結(jié)合實驗表明，rPoGalectin-6能廣泛識別并結(jié)合革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，暗示-可能參與牙鲆對細(xì)菌感染的先天免疫防御機制。此外，rPoGalectin-6對微生物的結(jié)合能力具有濃度依賴性，即高濃度的rPoGalectin-6對細(xì)菌的結(jié)合能力更強。雖然rPoGalectin-6與細(xì)菌的結(jié)合能力已被證實，但rPoGalectin-6與細(xì)菌的作用機制尚不清楚。-已被證明具有-半乳糖苷結(jié)合活性(Gitt, 1998a)，然而，rPoGalectin-6是否通過結(jié)合細(xì)菌表面的-半乳糖苷進(jìn)而展現(xiàn)出與細(xì)菌的親和力還有待進(jìn)一步研究。

凝集活性是半乳糖凝集素最重要的特性，它們可以通過結(jié)合細(xì)胞表面的糖蛋白和糖復(fù)合物來凝集細(xì)胞。細(xì)菌凝集實驗結(jié)果表明，rPoGalectin-6對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有凝集活性，這意味著rPoGalectin-6可能作為一種粘連相關(guān)的蛋白質(zhì)，通過識別、結(jié)合以及凝集微生物，在牙鲆的先天性免疫防御過程中發(fā)揮作用。在對凝集素凝集活性的研究中，認(rèn)為Ca2+是C型動物凝集素發(fā)揮凝集活性的重要因素(Su, 2020)，相反，半乳糖凝集素曾被認(rèn)為是不依賴于Ca2+的S型動物凝集素(Hughes, 2001)。然而，一些半乳糖凝集素確實表現(xiàn)出Ca2+依賴性的凝集活性，例如，中華絨螯蟹()半乳糖凝集素Galectin () (Wang, 2016)和大黃魚-() (Zhang, 2016)。這些結(jié)果表明，非Ca2+依賴的凝集活性可能不是半乳糖凝集素不可或缺的特征。Ca2+在rPoGalectin-6凝集過程中的作用機制可借鑒巨噬細(xì)胞甘露糖受體第4個CRD (CRD-4)與單糖的結(jié)合機制(Mullin, 1997)。CRD-4與甘露糖的結(jié)合由2個Ca2+參與，其中一個Ca2+僅起到定位作用，另一個Ca2+則與CRD-4側(cè)鏈的羰基氧原子形成配位鍵，然后與甘露糖的羥基3或4結(jié)合形成三元絡(luò)合物，完成CRD-4與甘露糖的結(jié)合。因此，Ca2+是Ca2+依賴型凝集素白識別和結(jié)合碳水化合物過程中的一個重要因素，這也解釋了在沒有Ca2+存在的情況下，rPoGalectin-6沒有表現(xiàn)出理想的細(xì)菌凝集活性。

本研究識別并鑒定了-，它主要在腸組織中大量表達(dá)，并且經(jīng)微生物刺激后，-在腸組織中的表達(dá)水平顯著升高。在與細(xì)菌的互作實驗中發(fā)現(xiàn)，rPoGalectin-6具有較強的細(xì)菌結(jié)合能力和凝集活性。綜上所述，-參與了由遲緩愛德華氏菌感染所引起的免疫應(yīng)答，為探索-在硬骨魚類中的免疫功能奠定了基礎(chǔ)。

BAI Y, NIU D, BAI Y,Identification of a novel galectin inand its role in recognition of gram-negative bacteria. Fish and Shellfish Immunology, 2018, 80: 1–9

BUTSCHI A, TITZ A, WALTI M A,. Caenorhabditis elegans N-glycan core beta-galactoside confers sensitivity towards nematotoxic fungal galectin CGL2. PLoS Pathogens, 2010, 6(1): e1000717

FERMINO M L, POLLI C D, TOLEDO K A,. LPS-induced galectin-3 oligomerization results in enhancement of neutrophil activation. PLoS One, 2011, 6(10): e26004

FERRAGUT F, CAGNONI A J, COLOMBO L L,. Dual knockdown of galectin-8 and its glycosylated ligand, the activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM/ CD166), synergistically delaysbreast cancer growth. Biochimica et Biophysica ActaMolecular Cell Research, 2019, 1866(8): 1338–1352

GITT M A, COLNOT C, POIRIER F,. Galectin-4 and galectin-6 are two closely related lectins expressed in mouse gastrointestinal tract. Journal of Biological Chemistry, 1998a, 273(5): 2954–2960

GITT M A, XIA Y R, ATCHISON R E,. Sequence, structure, and chromosomal mapping of the mousegene, encoding galectin-6. Journal of Biological Chemistry,1998b, 273(5): 2961–2970

HOUZELSTEIN D, REYES-GOMEZ E, MAURER M,. Expression patterns suggest that despite considerable functional redundancy, galectin-4 and -6 play distinct roles in normal and damaged mouse digestive tract.Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2013, 61(5): 348–361

HU X, CHEN H, XU J,. Function ofgalectin-6 in modulation of Cry11Aa toxicity.Pesticide Biochemistry and Physiology, 2020, 162: 96–104

HUGHES R C. Galectins as modulators of cell adhesion.Biochimie, 2001, 83(7): 667–676

HWANG J S, TAKAKU Y, MOMOSE T,. Nematogalectin, a nematocyst protein with GlyXY and galectin domains, demonstrates nematocyte-specific alternative splicing in Hydra. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(43): 18539–18544

LIU F T, YANG R Y, SAEGUSA J,. Galectins in regulation of apoptosis. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2011, 705: 431–442

MULLIN N P, HITCHEN P G, TAYLOR M E. Mechanism of Ca2+and monosaccharide binding to a C-type carbohydrate- recognition domain of the macrophage mannose receptor.Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(9): 5668–5681

NATSUGA K, CIPOLAT S, WATT F M. Increased bacterial load and expression of antimicrobial peptides in skin of barrier-deficient mice with reduced cancer susceptibility. Journal of Investigative Dermatology, 2016, 136(1): 99–106

NATSUGA K, WATT F M. Galectin-6 is a novel skin anti-microbial peptide that is modulated by the skin barrier and microbiome. Journal of Dermatological Science,2016, 84(1): 97–99

NITA-LAZAR M, BANERJEE A, FENG C,. Galectins regulate the inflammatory response in airway epithelial cells exposed to microbial neuraminidase by modulating the expression of SOCS1 and RIG1. Molecular Immunology, 2015, 68(2 Pt A): 194–202

OYANADEL C, HOLMES C, PARDO E,. Galectin-8 induces partial epithelial-mesenchymal transition with invasive tumorigenic capabilities involving a FAK/EGFR/ proteasome pathway in Madin-Darby canine kidney cells. Molecular Biology of the Cell, 2018, 29(5): 557–574

PACLIK D, LOHSE K, WIEDENMANN B,. Galectin-2 and –4, but not galectin-1, promote intestinal epithelial wound healing in vitro through a TGF-beta-independent mechanism. Inflammatory Bowel Diseases, 2008, 14(10): 1366–1372

RAO X J, WU P, SHAHZAD T,. Characterization of a dual-CRD galectin in the silkworm. Developmental and Comparative Immunology, 2016, 60: 149–159

SHATZ-AZOULAY H, VINIK Y, ISAAC R,. The animal lectin galectin-8 promotes cytokine expression and metastatic tumor growth in mice. Scientific Reports, 2020, 10(1): 7375

SHI W, XUE C, SU X Z,. The roles of galectins in parasitic infections. Acta Tropica, 2018, 177: 97–104

STOWELL S R, ARTHUR C M, DIAS-BARUFFI M,. Innate immune lectins kill bacteria expressing blood group antigen. Nature Medicine, 2010, 16(3): 295–301

SU Y, LIU Y, GAO F,. A novel C-type lectin with a YPD motif from(PtCLec1) mediating pathogen recognition and opsonization. Developmental and Comparative Immunology, 2020, 106: 103609

TAKEUCHI T, ARATA Y, KASAI K I. Galactosebeta1-4fucose: A unique disaccharide unit found in N-glycans of invertebrates including nematodes. Proteomics, 2016, 16(24): 3137–3147

THIJSSEN V L, HEUSSCHEN R, CAERS J,. Galectin expression in cancer diagnosis and prognosis: A systematic review. Biochimica et Biophysica Acta, 2015, 1855(2): 235–247

VIZZINI A, PARRINELLO D, SANFRATELLO M A,. Inducible galectins are expressed in the inflamed pharynx of the ascidian. Fish and Shellfish Immunology, 2012, 32(1): 101–109

WADA J, KANWAR Y S. Identification and characterization of galectin-9, a novel beta-galactoside-binding mammalian lectin. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(9): 6078– 6086

WANG M Q, WANG L L, HUANG M M,. A galectin fromfunctions as pattern recognition receptor enhancing microbe agglutination and haemocytes encapsulation. Fish and Shellfish Immunology, 2016, 55: 10–20

WDOWIAK K, FRANCUZ T, GALLEGO-COLON E,. Galectin targeted therapy in oncology: Current knowledge and perspectives. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(1): 210

YU Y, YUAN S, YU Y,. Molecular and biochemical characterization of galectin from amphioxus: Primitive galectin of chordates participated in the infection processes. Glycobiology, 2007, 17(7): 774–783

ZHANG D L, Lü C H, YU D H,. Characterization and functional analysis of a tandem-repeat galectin-9 in large yellow croaker. Fish and Shellfish Immunology, 2016, 52: 167–178

Cloning, Expression and Function of-from

LIU Xiaofei1,2, ZHANG Shuangshuang2, HENDRIANSYAH Endri1, LI Yingrui1,2, SU Lin2, LI Xiangqian3, XIU Yunji2, GU Wei1①

(1. College of Marine Science and Engineering, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210023, China; 2. School of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China; 3. Jiangsu Provincial Key Construction Laboratory of Probiotics Preparation, Huaiyin Institute of Technology, Huaian, Jiangsu 223003, China)

Galectin-6 is a member of the β-galactoside-binding lectin family, which has been widely studied in mammals (e.g.,).-has been cloned from several teleost fishes, such as,, and, but there are few studies on its function. In this study, we analyzed the molecular characteristics of Galectin-6 extracted from(-) and studied its immune-related functions. The full length of the open reading frame (ORF) of-cDNA is 1089 bp, encoding 362 amino acids containing two carbohydrate recognition domains (CRDs). Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that-is highly similar to-(approximately 80.9%Tissue distribution experiments demonstrated that-is specifically expressed inintestinal tissues. The expression level of PoGalectin-6 in the intestine significantly increased afterstimulation, and the highest expression level was observed at 12 h after infection. Recombinant PoGalectin-6 (rPoGalectin-6) exhibited binding ability to gram-positive (, and) and gram-negative (,, and) bacteria. rPoGalectin-6 showed Ca2+-dependent agglutination activity against,,and. This study suggests that PoGalectin-6 may play an important role in the immune response againstinfection, laying the foundation for exploring the immune functions of-in teleosts.

-;;; Immune response

GU Wei, E-mail: skywei426@sina.com

10.19663/j.issn2095-9869.20210510001

S917.1

A

2095-9869(2022)04-0147-11

*國家自然科學(xué)基金項目(32002421)資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (32002421)]. 劉曉飛，E-mail: lxf370784@163.com

顧 偉，副教授，E-mail: skywei426@sina.com

2021-05-10,

2021-06-04

http://www.yykxjz.cn/

劉曉飛, 張爽爽, Hendriansyah Endri, 李英瑞, 蘇琳, 李相前, 修云吉, 顧偉. 牙鲆半乳糖凝集素6基因的克隆、表達(dá)及功能研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(4): 147–157

LIU X F, ZHANG S S, HENDRIANSYAH E, LI Y R, SU L, LI X Q, XIU Y J, GU W. Cloning, expression and function of-from. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(4): 147–157

(編輯 馮小花)