扶曉琴 王 娜 王佳林 陳松林 趙法箴

半滑舌鰨顆粒酶B基因的克隆和表達(dá)分析*

扶曉琴1,2王 娜2王佳林2陳松林1,2趙法箴1,2①

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院 江蘇 無(wú)錫 214081；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071)

顆粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎癥反應(yīng)必不可少的介質(zhì),可激活半胱天冬酶3，進(jìn)而誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增和RACE技術(shù)獲得了半滑舌鰨()顆粒酶B基因()的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其序列特征和表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，cDNA全長(zhǎng)為923 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為780 bp，編碼259個(gè)氨基酸(前19個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列)，5′非編碼區(qū)為49 bp，3′非編碼區(qū)為94 bp。的基因組結(jié)構(gòu)比較保守，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。CsGzmBl蛋白包含2個(gè)N端糖基化位點(diǎn)、1個(gè)催化三聯(lián)體“His63Asp112Ser207”、1個(gè)“PHSRPYMA”結(jié)構(gòu)域及6個(gè)保守的半胱氨酸。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在半滑舌鰨健康成魚(yú)不同組織中均有表達(dá)，其中，在脾臟中表達(dá)量最高，頭腎、中腎、肝臟和鰓中表達(dá)量次之，在肌肉中表達(dá)量最低。與對(duì)照組0 h相比，在哈維氏弧菌()感染后的不同時(shí)間點(diǎn)的脾臟、腸、肝臟、皮膚、鰓和腎臟中的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。研究表明，基因在半滑舌鰨抵御哈維氏弧菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

半滑舌鰨；哈維氏弧菌；顆粒酶B基因；表達(dá)分析

半滑舌鰨()是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，主要分布在我國(guó)沿海地區(qū)，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，具有良好的市場(chǎng)需求和養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)潛力。然而，高密度集約化養(yǎng)殖以及環(huán)境污染等導(dǎo)致半滑舌鰨多種疾病頻繁暴發(fā)。其中，最嚴(yán)重的是由哈維氏弧菌()引起的細(xì)菌性疾病，嚴(yán)重制約了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(陳政強(qiáng)等, 2012; 于孟君等, 2017; 王雙艷等, 2019)。近年來(lái)，以提高魚(yú)體抗病力為目標(biāo)的良種選育，被認(rèn)為是當(dāng)下解決半滑舌鰨病害的一種行之有效的方法(Zhou, 2019)。長(zhǎng)期以來(lái)，魚(yú)類(lèi)免疫機(jī)制及抗病分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究比較薄弱，嚴(yán)重阻礙了魚(yú)類(lèi)抗病育種的發(fā)展(陳松林, 2004; 周欣等, 2021)。因此，對(duì)半滑舌鰨抗病分子機(jī)制的研究迫在眉睫，這將為其病害防治提供重要的理論依據(jù)。目前，關(guān)于基因在半滑舌鰨中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)半滑舌鰨基因()的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行克隆，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)了該基因在健康半滑舌鰨不同組織中的表達(dá)模式，以及哈維氏弧菌感染后不同組織的表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步研究該基因在半滑舌鰨免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 正常組織樣品采集 本實(shí)驗(yàn)所用半滑舌鰨均購(gòu)自山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)公司，在22℃循環(huán)海水中養(yǎng)殖。選取5尾健康、體重為(104.9±4.6) g的半滑舌鰨個(gè)體，分別收集鰓、頭腎、肝臟、腸、皮膚、腦、中腎、肌肉和脾臟共9個(gè)組織，立即置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)入–80℃保存。

1.1.2 哈維氏弧菌感染與樣品采集 采用Wei等(2018)的方法，對(duì)10月齡健康半滑舌鰨進(jìn)行哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)。首先定量培養(yǎng)哈維氏弧菌(Wang, 2017)，然后用無(wú)菌PBS將哈維氏弧菌稀釋至終濃度為1.0×104CFU/mL，用于半滑舌鰨腹腔注射實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組注射等體積的無(wú)菌PBS。分別在感染前0 h與感染后12、24、48、72及96 h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取3尾半滑舌鰨，取其肝臟、脾臟、腎臟，腸、鰓和皮膚共6個(gè)組織，放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)入–80℃保存。

1.2 RNA提取與cDNA合成

使用RNA提取試劑盒(Invitrogen, 美國(guó))提取各組織的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。RNA質(zhì)量鑒定合格后，使用Prime ScriptRTreagent kit with gDNA eraser試劑盒(TaKaRa, 日本)合成cDNA。使用SmartTMRACE cDNA amplification kit (TaKaRa, 日本)合成RACE-Ready cDNA。

1.3 CsGzmBl基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)半滑舌鰨全基因組測(cè)序結(jié)果(Chen, 2014)，獲得基因的預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM_008328902.3)，以該序列片段設(shè)計(jì)引物(表1)，先進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其ORF區(qū)。普通PCR擴(kuò)增體系：2×ExMix(TaKaRa, 日本) 25 μL，CsPRF1l- ORF-F/R引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 4 min；35個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用DNA膠回收試劑盒(天根，中國(guó))進(jìn)行純化回收。將純化的片段連接到pEasy-T1載體(全式金，中國(guó))，通過(guò)42℃熱激法轉(zhuǎn)入到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中(全式金，中國(guó))，最后挑取單克隆，送華大基因進(jìn)行測(cè)序，成功獲得的ORF區(qū)序列。

以得到的ORF區(qū)序列設(shè)計(jì)RACE引物(表1)，以合成的RACE-Ready-cDNA為模板，通過(guò)降落PCR進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE PCR擴(kuò)增。第1輪反應(yīng)體系為10 μL，按照TMhot start (TaKaRa, 日本)說(shuō)明書(shū)加樣。PCR程序：94℃ 30 s；72℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 5 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將第1輪的PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍后作為第2輪普通PCR的模板，普通PCR體系和程序均同上所述。擴(kuò)增完成后，進(jìn)行分子克隆實(shí)驗(yàn)，并挑取單克隆送測(cè)序。成功獲得5′和3′端序列，然后，通過(guò)DNAstar軟件進(jìn)行拼接，最終獲得的cDNA全長(zhǎng)序列。

1.4 序列分析

利用在線(xiàn)程序ORFinder (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/)推導(dǎo)基因的氨基酸序列。使用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)不同物種GzmB的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索。使用ExPASy在線(xiàn)軟件的ProtParam程序(http://au.expasy. org/tools/protparam.html)計(jì)算CsGzmB的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)等理化參數(shù)?；赟MART 4.0程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽序列及功能結(jié)構(gòu)域。使用在線(xiàn)程序SoftBerry-Psite (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc)預(yù)測(cè)該蛋白的功能位點(diǎn)。使用Predict Protein (https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用在線(xiàn)軟件GSDS 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/index.php)比較不同物種的基因組結(jié)構(gòu)。使用BioEdit軟件進(jìn)行脊椎動(dòng)物GzmB的氨基酸序列比對(duì)。使用MEGA 7.0軟件通過(guò)NJ法–鄰位相連法構(gòu)建GzmB的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 檢測(cè)CsGzmBl基因的表達(dá)模式

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)基因在半滑舌鰨健康成魚(yú)不同組織以及哈維氏弧菌刺激后免疫相關(guān)組織中的表達(dá)水平。選用作為內(nèi)參基因，用于qRT-PCR的引物均列在表1中。使用SYBR?Premix ExTM(TaKaRa, 日本)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)在ABI 7500 Fast Real-time (Applied Biosystems, 美國(guó))儀器上進(jìn)行基因的定量分析。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，使用2–ΔΔCt方法(Livak, 2001)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較。當(dāng)<0.05時(shí)為差異顯著(<0.05)；當(dāng)<0.01時(shí)為差異極顯著(<0.01)。

表1 本研究所用的引物

Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 CsGzmBl基因的cDNA序列分析

基因的cDNA全長(zhǎng)為923 bp，其開(kāi)放閱讀框(ORF)為780 bp，5′非編碼區(qū)(UTR)為49 bp，3′UTR為94 bp (在polyA尾部上游5 bp處存在一個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA))。ORF編碼一個(gè)由259個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，分子量為29.06 kDa，理論等電點(diǎn)為9.23，總平均疏水系數(shù)為–0.353，脂肪系數(shù)為77.53，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為42.36，表明該蛋白不穩(wěn)定。信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，該蛋白的N端存在一個(gè)由19個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含2個(gè)N端糖基化位點(diǎn)(分別為NSSH和NNSK)以及5個(gè)二硫鍵。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CsGzmBl屬于胞外分泌蛋白(圖1)。

圖1基因的核苷酸與氨基酸序列

Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of

非編碼區(qū)用小寫(xiě)字母表示，編碼區(qū)用大寫(xiě)字母表示。2個(gè)預(yù)測(cè)的N端糖基化位點(diǎn)(NSSH和NNSK)用灰色陰影標(biāo)注。起始密碼子和終止密碼子用紅色加粗字母表示。聚腺苷酸化信號(hào)和多聚腺昔氨酸加尾信號(hào)分別用方框和下劃線(xiàn)標(biāo)出。

UTR is in lowercase, and ORF is in uppercase. Two predicted N-glycosylation sites (NSSH and NNSK) are shaded in greys. The start codon and stop codon are red in bold. The polyadenylation signal and polyadenylation tail are boxed and underlined, respectively.

2.2 多氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化分析

對(duì)不同物種的GzmB氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在脊椎動(dòng)物GzmB中比較保守的一些功能域及位點(diǎn)也同樣存在于CsGzmBl中。CsGzmBl具有一個(gè)典型的絲氨酸蛋白酶家族所特有的“催化三聯(lián)體His63Asp112Ser207”，一個(gè)保守的蛋白活性中心，一個(gè)保守的前導(dǎo)肽(ED)，一個(gè)保守的“PHSRPYMA”序列以及6個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)(圖2)。保守的Cys分別為Cys 48、Cys 64、Cys 146、Cys 177、Cys 192和Cys 213，其中，Cys 48與Cys 64，Cys 146與Cys 213，Cys 177與Cys 192分別各自形成了二硫鍵。此外，CsGzmBl的Cys 5與Cys 13，Cys 203與Cys 229也分別各自形成了二硫鍵。CsGzmBl 5個(gè)二硫鍵位置如圖2所示。

為更明確CsGzmBl的進(jìn)化地位，選用CsGzmBl與其他物種的GzmB、GzmA及GzmM的氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖3所示，所有物種的GzmA聚為一大支；CsGzmBl與其他物種的GzmB聚為另一大支，其中，部分物種的GzmM與GzmB聚在一起。在GzmB這一支中，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)主要的不同分支，其中，所有硬骨魚(yú)類(lèi)的GzmB聚為一支，其他脊椎動(dòng)物的GzmB聚為一支，這2大支最終匯聚在一起。因此，脊椎動(dòng)物Gzm氨基酸的同源性符合進(jìn)化規(guī)則。

圖2 CsGzmBl基因與其他脊椎動(dòng)物GzmB基因的多氨基酸序列比對(duì)

相同氨基酸和相似氨基酸分別用黑色和淺灰色陰影表示。星號(hào)表示6個(gè)保守的半胱氨酸的位置，三角形表示保守的催化三聯(lián)體，黑色長(zhǎng)方形表示保守的蛋白活性中心。不同物種信號(hào)肽的位置用白色框標(biāo)注。CsGzmBl蛋白的二硫鍵由雙箭頭表示，其前導(dǎo)肽由雙線(xiàn)表示。

Identical and similar amino acids are shaded in black and light gray, respectively. Asterisks indicate 6 conserved cysteines, black triangles indicate conserved catalytic triads, and black rectangles indicate conserved protein active centers. The positions of signal peptides of different species are marked with white boxes. The disulfide bond of the CsGzmBl protein is represented by a double arrow, and its activation di-peptide peptide is represented by a double line.

圖3 GzmB、GzmA以及GzmM氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

CsGzmBl用黑色五角星表示。

CsGzmBl was marked with a black five-pointed star.

2.3 GzmB的基因組結(jié)構(gòu)

以基因的全長(zhǎng)cDNA序列與半滑舌鰨全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，獲得的基因組DNA序列，將之與的ORF序列進(jìn)行比較分析，得到的基因結(jié)構(gòu)?；蛴?890個(gè)堿基組成，包括5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子。外顯子–內(nèi)含子邊界均符合AG/GT拼接規(guī)則，所有的3′末端受體位點(diǎn)具有共同的AG序列，所有的5′末端供體位點(diǎn)部位都有共同的GT序列。將半滑舌鰨與其他物種的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)的基因組結(jié)構(gòu)比較保守，均是由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成(圖4)。

圖4 CsGzmBl和其他物種GzmB基因的外顯子–內(nèi)含子結(jié)構(gòu)比較

Exons are in blue rounded rectangles; 5′UTR and 3′UTR are in orange rounded rectangles. Lines indicate the introns. The mRNA and gene accession numbers of different speciesare as follows:: XM_008328902.3, NC_024322.1;(): XM_017478999.1, NC_030425.1;): XM_019268918.2, NC_040028.1;(): XM_020594827.1, NW_018127904.1;(): XM_015052332.1, NW_015113718.1;(): XM_034180280.1, NC_047112.1

2.4 CsGzmBl在不同組織中的表達(dá)模式

半滑舌鰨健康成魚(yú)鰓、頭腎、肝臟、腸、皮膚、腦、中腎、肌肉、脾臟共9個(gè)組織中的表達(dá)情況如圖5所示。從圖5可以看出，在這些組織中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)情況，其中，在脾臟中表達(dá)量最高，在頭腎、中腎、肝臟和鰓中表達(dá)量次之，在其他組織中表達(dá)量較低，在肌肉中表達(dá)量最低。

2.5 哈維氏弧菌刺激后CsGzmBl基因的表達(dá)變化

哈維氏弧菌刺激后，與對(duì)照組0 h相比，mRNA的表達(dá)水平在脾臟、腸、肝臟、皮膚、鰓和腎臟中均有不同程度的上調(diào)。如圖6所示，在脾臟、腸和鰓中，的表達(dá)水平僅在細(xì)菌感染48 h后有明顯的上調(diào)趨勢(shì)(0.05或0.01)，在其他時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。在皮膚中，mRNA的表達(dá)量在細(xì)菌感染72 h后顯著增加(<0.05)，在其余時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(>0.05)。在肝臟和腎臟中，細(xì)菌感染后96 h，的表達(dá)水平顯著上升(<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異(>0.05)。

3 討論

本研究通過(guò)RACE方法獲得了基因的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因具有一些保守的功能域或功能位點(diǎn)。CsGzmBl具有一個(gè)序列為“His63Asp112Ser207”的催化三聯(lián)體，催化三聯(lián)體是膚凝乳蛋白酶的典型特征，是形成可實(shí)現(xiàn)精確三維定向的支架所必需的部分(Branden, 1991)，在Gzm蛋白家族成員中高度保守(Smyth, 1996)，如大西洋鱈GzmA/K、尼羅羅非魚(yú)Gzm及銀鯽Gzm中均具有催化三聯(lián)體“His57Asp102Ser195”(Matsuura, 2014; Praveen, 2006; Wernersson, 2006)。此外，CsGzmBl蛋白還具有一個(gè)保守的前導(dǎo)肽ED(GluAsp)，在攜帶翻譯信息的酶轉(zhuǎn)移到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞外顆粒過(guò)程中起不可或缺的作用(Praveen, 2004)。大多數(shù)哺乳動(dòng)物，如馬、人、大鼠及小鼠的GzmB蛋白的N末端都具有一個(gè)高度保守的序列“GlyGlu(EG)或Glu-Glu(GG)”的前導(dǎo)肽(Caputo, 1993)。研究表明，Gzm氨基酸激活的前肽后面1～4位(IIGG)與9～16位(PHSRPYMA)高度保守(Trapani, 2001; Piuko, 2007; Pham, 1999)。哺乳動(dòng)物，如人、大鼠，小鼠及馬Gzm蛋白中均具有這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中，IIGG結(jié)構(gòu)域是前肽裂解激活蛋白酶所必需的(Smyth, 1995)。本研究中，CsGzmBl前導(dǎo)肽后1～4位為“IVNG”，類(lèi)似于哺乳動(dòng)物Gzm蛋白的“IIGG”，第10～16位是保守的“PHSRPYMA”結(jié)構(gòu)域。

圖5 CsGzmBl mRNA在健康半滑舌鰨成魚(yú)不同組織中的表達(dá)水平

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(=3)。柱狀圖上方的不同字母表示各個(gè)組織之間存在顯著性差異(<0.05)。

All data are shown as Mean±SE (=3). Different letters above the bars indicate significant difference at the level of<0.05.

Huang等(2010)報(bào)道稱(chēng)，魚(yú)類(lèi)Gzms與哺乳動(dòng)物的GzmA/B/K關(guān)系更近，可能是因?yàn)镚zmA/B是更古老的祖先基因。因此，推測(cè)GzmB在進(jìn)化上處于更高地位，而GzmM可能由GzmB進(jìn)化而來(lái)。本研究選擇A和M作為進(jìn)化分析的組成部分，而最終的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)的GzmM與GzmB聚在一起，證實(shí)了此推測(cè)。本研究還發(fā)現(xiàn)，所有物種的GzmB始終聚在一起，符合GzmB的同源進(jìn)化規(guī)則?；蚪Y(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，與其他魚(yú)類(lèi)基因均由5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子組成。據(jù)報(bào)道，家族所有成員的基因結(jié)構(gòu)極其保守，如鯉、斑馬魚(yú)()、尼羅羅非魚(yú)及人與基因均由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成(Huang, 2010; Praveen, 2006)。本研究中，的基因結(jié)構(gòu)符合外顯子和內(nèi)含子法則(Mount, 1982)，但與其他魚(yú)類(lèi)基因相比，基因的長(zhǎng)度明顯較短。以上結(jié)果表明，既具備Gzm家族的典型特征，也具有GzmB的特點(diǎn)，進(jìn)化上與Gzms家族其他成員有明確區(qū)別，因此，該基因?qū)儆谟补囚~(yú)類(lèi)同源基因。

關(guān)于魚(yú)類(lèi)基因組織表達(dá)模式的研究十分有限，僅在幾種魚(yú)中有報(bào)道鯉中基因在脾臟、鰓及頭腎中高表達(dá)(腎臟中最高)，其次是腎臟和腸，在肝臟和皮膚及肌肉中表達(dá)量最低(Huang, 2010)。尼羅羅非魚(yú)的僅在腎臟和血液中被檢測(cè)到，在肝臟、脾臟、鰓及肌肉中均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)(Praveen, 2006)。在銀鯽中，mRNA在鰓和脾臟中表達(dá)量最高，在肝臟中表達(dá)量最低(Matsuura, 2014)。雖然魚(yú)類(lèi)基因呈現(xiàn)出不同的組織表達(dá)模式，但它總能在免疫相關(guān)組織中被檢測(cè)到。本研究發(fā)現(xiàn)，mRNA在半滑舌鰨健康成魚(yú)9個(gè)組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，其中，在脾臟中表達(dá)量最高，頭腎、中腎、肝臟和鰓中表達(dá)量次之，肌肉中表達(dá)量最低。綜合表明，基因可能在半滑舌鰨先天性免疫中具有重要作用。

許多研究表明，基因在病毒和細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，相關(guān)研究在哺乳動(dòng)物中有大量報(bào)道。然而，關(guān)于魚(yú)類(lèi)基因在細(xì)菌感染后的表達(dá)研究十分有限在鯉中發(fā)現(xiàn)GzmA/K可以被SVCV病毒所誘導(dǎo)(Huang, 2010)。鯽魚(yú)的基因可以被遲緩愛(ài)德華氏菌()所調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌感染后，基因在肝臟、腎臟、脾臟、腸、鰓及皮膚6個(gè)組織中均顯著上調(diào)，說(shuō)明參與半滑舌鰨的免疫防御作用，但其具體的功能和作用機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

圖6 哈氏弧菌感染后脾臟、腸、肝臟、皮膚、鰓和腎臟中CsGzmBl mRNA的表達(dá)情況

樣品取自感染后0、12、24、48、72及96 h。數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(=3)。星號(hào)表示顯著性差異(**<0.01，*<0.05)。

The samples are tested at 0, 12, 24, 48, 72 and 96 h after infection. All the data are shown as Mean±SE (=3). The asterisk indicates a significant difference (**<0.01, *<0.05).

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)基因的克隆、序列特征描述以及表達(dá)模型分析，初步表明參與半滑舌鰨免疫應(yīng)答過(guò)程，為進(jìn)一步研究在半滑舌鰨抗病免疫中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Characterization and Expression Analysis ofGene in Half Smooth Tongue Sole ()

FU Xiaoqin1,2, WANG Na2, WANG Jialin2, CHEN Songlin1,2, ZHAO Fazhen1,2①

(1. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi, Jiangsu 214081, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao, Shandong 266071, China)

B is an indispensable mediator of the immune inflammatory response, which can induce apoptosis of target cells by activating caspase 3. In this study, we cloned the full-length cDNA oflike gene () and analyzed its sequence characteristics and expression levels. The full-length cDNA ofwas 923 bp, containing a 49 bp 5?UTR, 94 bp 3?UTR, and 780 bp ORF regions encoding 259 amino acid proteins with 19 amino acid signal peptides. The genome structure ofis highly conserved and consists of five exons and four introns. The CsGzmBl protein possesses two N-terminal glycosylation sites, a catalytic triad “His63Asp112Ser207,” a “PHSRPYMA” domain, and six conserved cysteines. qRT-PCR indicated thatwas expressed in different tissues of healthyadults, with the highest expression in the spleen, followed by that in the head kidney, kidney, liver, and gills, with the lowest expression in muscle. After infection with,was up-regulated to varying degrees in six immune-related tissues (spleen, intestine, liver, skin, gills, and kidneys) at different time points compared to the control group at 0 h. These results indicate thatplays an important role in the immune response ofagainstinfection.

;;; Expression analysis

ZHAO Fazhen, Email: zhaofz@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20210518002

*國(guó)家自然科學(xué)基金(31530078; 31973006)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2020TD20)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31530078; 31973006), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD20)]. 扶曉琴，E-mail: qinxiaoqinxiao@163.com

趙法箴，E-mail: zhaofz@ysfri.ac.cn

2021-05-18,

2021-06-08

Q522

A

2095-9869(2022)04-0136-11

http://www.yykxjz.cn/

扶曉琴, 王娜, 王佳林, 陳松林, 趙法箴. 半滑舌鰨顆粒酶B基因的克隆和表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(4): 136–146

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(編輯 馮小花)