張麗靜，任召珍

（1.威海市文登區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東威海 264400；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東威海 264300）

西洋參是五加科、人參屬多年生草本植物，其味苦、微甘，性良，具有滋陰補(bǔ)氣、生津止渴、除煩躁、清虛火、扶正氣、抗疲勞等功效[1-3]，含有的人參皂苷成分，具有提高人體抵抗力的功效[4-5]，野生西洋參資源稀少，已瀕臨絕種，在中草藥野生資源日漸減少的情況下，為了使供應(yīng)量得到保證，將其從野生轉(zhuǎn)化為人工種植是大勢(shì)所趨[6]。在漫長(zhǎng)的野生西洋參人工馴化過(guò)程中，由于生長(zhǎng)環(huán)境的變化，人工馴化栽培類型的西洋參品種對(duì)病原菌的敏感性大大增加[7-8]。據(jù)權(quán)威數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，有多達(dá)15 種以上的病蟲(chóng)害會(huì)影響西洋參的正常生長(zhǎng)，侵害西洋參的根、花、果，導(dǎo)致西洋參的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降[9]。基于長(zhǎng)期的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所積累的經(jīng)驗(yàn)，西洋參病蟲(chóng)害防治的傳統(tǒng)方法是化學(xué)法[10-11]，但化學(xué)農(nóng)藥毒性大、殘留量高，不僅破壞環(huán)境，還會(huì)殘留于西洋參產(chǎn)品中，使其品質(zhì)與野生西洋參有一定的差距，這些殘留的化學(xué)品還會(huì)對(duì)患者的身體健康造成危害[12-13]。因此，在西洋參人工馴化過(guò)程中農(nóng)藥殘留的控制是廣大參農(nóng)和種植協(xié)會(huì)的一個(gè)永恒的課題，相關(guān)國(guó)家法規(guī)對(duì)這一問(wèn)題也在持續(xù)關(guān)注，其中，《中華人民共和國(guó)藥典》作為制藥領(lǐng)域的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)中藥材農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)的種類也在日益增加，如2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中藥材和飲片檢定通則增加了33 種禁用農(nóng)藥的檢測(cè)[14]。

發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)西洋參農(nóng)藥殘留種類及限量的標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)高于中國(guó)[15]，因此進(jìn)一步拓展西洋參中農(nóng)藥殘留的分析方法具有重要的意義，尤其是在分析方法的靈敏度與選擇性方面。近年來(lái)，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）分析憑借其在選擇性、靈敏度、高通量和準(zhǔn)確定量性能方面的優(yōu)勢(shì)而成為農(nóng)藥分析的首選方法[16-17]。本實(shí)驗(yàn)參考2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中所涉及的農(nóng)藥目錄，以GC-MS/MS 為檢測(cè)手段，對(duì)西洋參中有機(jī)磷、有機(jī)氯等40種有代表性的農(nóng)藥殘留的快速篩查方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B 氣相色譜-7000D GC/MS Triple Quad三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；TDL-40B低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；N-EVAPTM112 氮吹儀，美國(guó)organomation 公司；BWT-2500 多位渦混儀，UK BIO-WAY TECNOLOGY LIMITED；KQ-500E 型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；0.01 g 電子分析天平，PL2002，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；色譜柱為HP-5MS UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國(guó)安捷倫科技有限公司；HLB Pro 固相萃取柱，200 mg、6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；

甲醇、乙腈、乙酸乙酯，色譜純，美國(guó)TEDIA；丙酮，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸，色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司和北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；磷酸三苯酯（100 μg/mL），購(gòu)于上海玉博生物科技有限公司；氯化鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 樣品前處理

將清洗干凈、晾干表面水分的鮮西洋參樣品切碎，放入勻質(zhì)機(jī)中勻質(zhì)，將勻質(zhì)后的樣品裝入聚乙烯瓶中。準(zhǔn)確稱取勻質(zhì)試樣10.00 g（精確到0.01 g），置于100 mL 聚乙烯離心管中，加入30 mL 乙腈，勻漿2 min（轉(zhuǎn)速12 000 r/min），加入5 g 氯化鈉，蓋緊旋塞劇烈震搖1 min，4 000 r/min 離心5 min 使有機(jī)相和水相分層。取上層有機(jī)相于100 mL 雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至3～5 mL，放置冷卻，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻。

取上述制備的提取液3～5 mL，通過(guò)HLB 固相萃取柱（200 mg、6 mL）凈化，收集全部?jī)艋夯靹颍芤迫∩锨逡? mL 于10 mL 離心管中，40 ℃氮吹至干，殘?jiān)?0 μL 磷酸三苯酯內(nèi)標(biāo)溶液和1 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，之后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：取1 mL、100 μg/mL 的磷酸三苯酯溶液于100 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得1 μg/mL的磷酸三苯酯工作液。

取100 μg/mL 的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（單標(biāo)或混標(biāo)），用丙酮配制成濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.1、0.2、0.5、1、1.5、2 mL 混標(biāo)溶液于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度。配制成系列濃度為10、20、50、100、150、200 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 GC-MS/MS 條件

1.4.1 色譜條件

進(jìn)樣口溫度280 ℃。程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min 升至120 ℃；再以5 ℃/min 升至310 ℃；總運(yùn)行時(shí)間40.5 min。載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；恒流模式，流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

接口溫度280 ℃。電離模式：電子轟擊電離（EI）；轟擊能量70 eV。離子源溫度：280 ℃。碰撞氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%）。溶劑延遲：3 min。選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（dMRM）模式。GCQQQ 軟件用于儀器控制，musshunter 軟件用于數(shù)據(jù)處理。40 種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)化合物的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 40 種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)化合物GC-MS/MS 分析的保留時(shí)間、定量離子對(duì)及碰撞能量Table 1 Retention times,quantitative ion pair,and collision energies of the 40 pesticides and internal standard

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取陰性鮮西洋參樣品，經(jīng)上述方法處理后得空白基質(zhì)溶液。分別取空白基質(zhì)溶液1 mL 于6 個(gè)10 mL 離心管中，40 ℃氮吹至干，殘?jiān)?0 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，再分別加入1 mL 配制的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，配成10、20、50、100、150、200 μg/L 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，之后上機(jī)測(cè)定，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1（見(jiàn)第63 頁(yè)）。以待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍與儀器檢出限

各化合物相關(guān)系數(shù)及檢出限（LOD）見(jiàn)表2（下頁(yè)），由表可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在10～200 μg/L 濃度范圍內(nèi)，各種農(nóng)藥相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，呈良好的線性關(guān)系。以信噪比（S/N）的3 倍計(jì)算方法的檢出限（LOD），得40種農(nóng)藥的LOD 在1.4～9.3 μg/kg，完全滿足檢測(cè)需求。

表2 40 種待測(cè)化合物線性方程、R2、檢出限、回收率及RSD 值Table 2 Linear equations,correlation coefficients (R2),LOD,spiked recoveries and RSD of the 40 pesticides

2.2 方法的回收率和精密度

用陰性西洋參樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加混合對(duì)照農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為20、50、100 μg/kg，每個(gè)濃度平行試驗(yàn)3 次。采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，在3個(gè)加標(biāo)水平下，40 種農(nóng)藥的回收率為74.3%～117.1%，RSD 均在15%以內(nèi)（見(jiàn)表2）。表明該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可用于鮮西洋參中40 種農(nóng)藥的快速篩查。

2.3 西洋參樣品分析

西洋參樣品含有揮發(fā)油、氨基酸、色素等成分基質(zhì)復(fù)雜，在樣品處理過(guò)程中，樣品中的色素、磷脂等雜質(zhì)會(huì)與目標(biāo)化合物一起被提取出來(lái)，這些共提物會(huì)對(duì)檢測(cè)儀器的色譜柱、離子源產(chǎn)生干擾，影響色譜分析，因此樣品前處理過(guò)程中簡(jiǎn)單有效的過(guò)濾凈化手段對(duì)保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)在樣品前處理過(guò)程中采用HLB 填料固相萃取柱進(jìn)行凈化，該手段去除了色素、磷脂等干擾雜質(zhì)（如圖2），并且使農(nóng)藥殘留保持了較高的回收率。

圖2 HLB 固相萃取柱凈化效果圖Fig.2 Comparison of purification effect of HLB solid phase extraction column

3 結(jié)論

本試驗(yàn)參考2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中所涉及的農(nóng)藥殘留目錄，結(jié)合威海市文登區(qū)西洋參種植產(chǎn)業(yè)中農(nóng)藥的使用情況，以有機(jī)磷、有機(jī)氯等40 種有代表性的農(nóng)藥殘留為研究對(duì)象，建立了鮮西洋參中農(nóng)藥殘留的快速篩查方法。樣品用乙腈提取后，經(jīng)HLB 固相萃取法凈化，采用dMRM模式采集數(shù)據(jù)進(jìn)行定性、定量分析。分析結(jié)果表明，40 種農(nóng)藥殘留在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在3 個(gè)不同質(zhì)量濃度水平下做加標(biāo)回收，平均回收率為74.3%～117.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于15%。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確、靈敏，適用于鮮西洋參產(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留的篩查與測(cè)定。