劉凌云，毛涵，朱襲嘉

在人類(lèi)肝臟原發(fā)腫瘤中，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%～15%［1］。全球范圍內(nèi)ICC發(fā)病率及病死率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)［2］。由于ICC惡性程度高，根治性切除術(shù)后患者的5年生存率僅為20%～40%［3］。叉頭盒蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)oxM1）是叉頭基因家族成員，人類(lèi)FoxM1基因位于染色體12p13.3末端著絲粒區(qū)域，長(zhǎng)約25 kb，包括10個(gè)外顯子。FoxM1在細(xì)胞由G1期至S期分化過(guò)程中及保持染色體穩(wěn)定性方面起到關(guān)鍵作用，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子［4］。FoxM1可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力促進(jìn)腫瘤形成，而且在晚期腫瘤中促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。目前研究發(fā)現(xiàn)FoxM1在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，如乳腺癌［6］、HCC［7］及胃癌［8］等，并且與其預(yù)后、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而，F(xiàn)oxM1在ICC中的作用及機(jī)制尚未完全清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是鋅鈣依賴(lài)肽鏈內(nèi)切酶家族成員，其中MMP-9和MMP-2與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。阻斷FoxM1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能通過(guò)抑制MMP-2表達(dá)，從而降低肝細(xì)胞癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的遷移和侵襲［10］。目前MMP-9和MMP-2在ICC中的作用尚不十分清楚，探索其對(duì)ICC的影響及是否與FoxM1相互關(guān)聯(lián)具有重要意義。本研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC細(xì)胞株，構(gòu)建FoxM1上調(diào)及下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并觀察FoxM1表達(dá)變化對(duì)ICC細(xì)胞生物學(xué)行為及MMP-9和MMP-2表達(dá)的影響，為臨床ICC的診治奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人ICC細(xì)胞株HCCC-9810、RBE和SSP-25（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Life Technologies公司）；LV-FoxM1-RNAi、FoxM1過(guò)表達(dá)慢病毒、聚凝胺（中國(guó)吉?jiǎng)P基因公司）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus，貨號(hào)RR820A，日本TaKaRa公司）；RIPA蛋白提取試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）；FoxM1兔抗人多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；MMP-9及MMP-2兔抗人多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司）；山羊抗兔二抗、GAPDH抗體（北京博奧森生物有限公司）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Transwell小室（美國(guó)Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的HCCC-9810、RBE和SSP-25細(xì)胞分別置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。

1.2.2 Western blot檢測(cè)ICC細(xì)胞系FoxM1及MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá) 收集各種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ICC細(xì)胞，加入RIPA和PMSF提取總蛋白，然后BCA法檢測(cè)總蛋白含量，將已定量的總蛋白液與加樣緩沖液以5∶1比例混合，經(jīng)蛋白變性后制成待檢測(cè)樣品。配制5%濃縮膠和10%分離膠，將蛋白質(zhì)樣品加入各孔道配平，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳產(chǎn)物以恒壓電轉(zhuǎn)至PVDF膜（80 V 30 min，110 V 60 min），室溫下用5%蛋白封閉液于搖床上緩慢封閉2 h，用TBST漂洗后加入稀釋的一抗（FoxM1、MMP-9、MMP-2：1∶1 000；GAPDH：1∶2 000）低速水平搖床上4℃孵育過(guò)夜，次日TBST漂洗后加入稀釋的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫低速搖床孵育1 h，洗膜后滴加配好的ECL化學(xué)發(fā)光液曝光成像。以GAPDH為內(nèi)參，圖像處理軟件Image J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染ICC細(xì)胞株 慢病毒載體帶有綠色熒光蛋白基因和嘌呤霉素抗性等特征，即轉(zhuǎn)染成功后的細(xì)胞可以正常表達(dá)綠色熒光并對(duì)嘌呤霉素耐藥。按照慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)，轉(zhuǎn)染前24 h，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目標(biāo)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)條件下，24孔板每孔加入（2～10）×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞融合率達(dá)到70%～90%時(shí)，吸除舊培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mL懸浮稀釋的慢病毒（5～8 mg/L，已加入含有聚凝胺的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，分為上調(diào)組HCCC-9810-FoxM1及下調(diào)組SSP-25-shFoxM1），同時(shí)以對(duì)照陰性慢病毒（加有聚凝胺）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞建立對(duì)照組細(xì)胞株（分為HCCC-9810-Control組及SSP-25-Control組），細(xì)胞常規(guī)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后12 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如無(wú)明顯毒性作用，約48 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后96 h可在倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)亮度較好并生長(zhǎng)穩(wěn)定情況下，加入嘌呤霉素（1 mg/L）篩選去除轉(zhuǎn)染差的細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FoxM1蛋白表達(dá)變化情況，細(xì)胞熒光高表達(dá)及生長(zhǎng)穩(wěn)定后可繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組ICC細(xì)胞增殖力 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)，96孔板中每孔加入（5～10）×103個(gè)細(xì)胞（100μL），邊緣孔加入無(wú)菌PBS液，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)平行對(duì)照孔，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察48 h和72 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入5 g/L MTT液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，37℃搖床震蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下每孔的光密度（OD）值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FoxM1對(duì)ICC細(xì)胞侵襲的影響 將預(yù)冷的RPMI 1640無(wú)血清培養(yǎng)基與Matrigel Matrix基質(zhì)膠按體積比1∶8比例充分混勻稀釋?zhuān)靠准尤?0μL上述稀釋液至小室聚碳酸酯膜（小室底膜）的上室面，37℃培養(yǎng)箱中放置4 h使其聚合成凝膠。上室加入準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液（HCCC-9810組，1×105個(gè)/孔，100μL；SSP-25組，5×104個(gè)/孔，50μL）。下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。種板時(shí)需避免產(chǎn)生氣泡，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽頭輕柔擦掉小室上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定小室30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗凈風(fēng)干后顯微鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野（上、中、下、左及右）小室下表面細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照。該實(shí)驗(yàn)同樣條件下重復(fù)3次。

1.2.6 qPCR檢測(cè)FoxM1變化對(duì)ICC細(xì)胞MMP-9及MMP-2 mRNA表達(dá)的影響 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用Trizol法提取其總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，總體系20μL，使用TaKaRa公司SYBR Green染料法進(jìn)行qPCR反應(yīng)，GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。使用NCBI在線Primer Blast設(shè)計(jì)引物，反應(yīng)體系中引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次取平均值。記錄各階段Ct值，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 qPCR sequence of primers表1 qPCR檢測(cè)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 6.0和SPSS 20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICC細(xì)胞株中FoxM1蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)3種ICC細(xì)胞株HCCC-9810、RBE和SSP-25的FoxM1蛋白表達(dá)水平分別為0.24±0.05、0.82±0.04、1.74±0.10（F=347.600，P＜0.01），SSP-25細(xì)胞株表達(dá)最高，HCCC-9810表達(dá)最低，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Expression levels of FoxM1 protein in ICC cell lines圖1 ICC細(xì)胞株中FoxM1蛋白表達(dá)情況

2.2 ICC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及鑒定 選取HCCC-9810作為上調(diào)FoxM1目標(biāo)細(xì)胞株（HCCC-9810-FoxM1組），SSP-25作為下調(diào)FoxM1目標(biāo)細(xì)胞株（SSP-25-shFoxM1組）。2株細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)90%以上，進(jìn)一步使用添加嘌呤霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（1 mg/L）篩選，2株細(xì)胞均能持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白且生長(zhǎng)狀態(tài)良好，見(jiàn)圖2。Western blot檢測(cè)結(jié)果提示HCCC-9810-FoxM1組較HCCC-9810-Control組FoxM1表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)（1.53±0.11vs.0.38±0.05，t=13.990，P＜0.01），而SSP-25-shFoxM1組較SSP-25-Control組FoxM1表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)（0.20±0.05vs.0.87±0.07，t=10.480，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

Fig.2 Representative graph of green fluorescent protein expression in ICC cell lines after lentivirus transfection圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后ICC細(xì)胞株綠色熒光蛋白表達(dá)圖

Fig.3 Expression of FoxM1 in ICC stably transfected cell lines圖3 ICC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株FoxM1表達(dá)情況

2.3 ICC細(xì)胞增殖能力比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始48 h后HCCC-9810-FoxM1組增殖能力明顯高于HCCC-9810-Control組，而SSP-25-shFoxM1組增殖能力明顯低于SSP-25-Control組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of the proliferation ability between the four groups of ICC cells表2 各組ICC細(xì)胞增殖能力對(duì)比（n=3，OD490，±s）

Tab.2 Comparison of the proliferation ability between the four groups of ICC cells表2 各組ICC細(xì)胞增殖能力對(duì)比（n=3，OD490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別HCCC-9810-Control組HCCC-9810-FoxM1組t SSP-25-Control組SSP-25-shFoxM1組t 24 h 0.36±0.01 0.34±0.02 1.107 0.35±0.01 0.36±0.01 0.725 48 h 0.76±0.07 1.07±0.10 4.544＊0.81±0.06 0.59±0.06 3.908＊72 h 1.21±0.08 2.08±0.08 11.322＊＊1.65±0.09 1.02±0.09 7.288＊＊

2.4 FoxM1表達(dá)變化影響ICC細(xì)胞的侵襲能力 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCCC-9810-FoxM1組的穿透細(xì)胞數(shù)目明顯高于HCCC-9810-Control組（單 位：個(gè)/視 野，394.00±9.64vs.219.00±12.53，t=21.650，P＜0.01）；而 SSP-25-shFoxM1組穿透細(xì)胞數(shù)目明顯低于SSP-25-Control組（197.00±10.58vs.463.67±20.50，t=32.000，P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Fig.4 Transwell cell invasion test(×100)圖4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)（×100）

2.5 FoxM1表達(dá)變化影響ICC細(xì)胞MMP-9及MMP-2 mRNA表達(dá) HCCC-9810-FoxM1組中MMP-9及MMP-2 mRNA表達(dá)水平較HCCC-9810-Control組明顯升高，而SSP-25-shFoxM1組中MMP-9及MMP-2 mRNA表達(dá)水平較SSP-25-Control組明顯降低（均P＜0.01），見(jiàn)表3。

3 討論

ICC的生物學(xué)行為較HCC更具侵略性，預(yù)后較HCC更差［11］。而ICC肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致ICC術(shù)后生存率低的主要因素［3，12］。目前，由于缺乏敏感性和特異性高的生物標(biāo)志物，ICC早期診斷困難［11］，從而直接影響ICC的后續(xù)治療及預(yù)后。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物，對(duì)于提高ICC早期診斷率及療效具有重要的臨床意義。

Tab.3 Effects of FoxM1 expression changes on the relative expression levels of MMP-9 and MMP-2 mRNA in ICC cells表3 FoxM1表達(dá)變化對(duì)ICC細(xì)胞MMP-9及MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of FoxM1 expression changes on the relative expression levels of MMP-9 and MMP-2 mRNA in ICC cells表3 FoxM1表達(dá)變化對(duì)ICC細(xì)胞MMP-9及MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別HCCC-9810-Control組HCCC-9810-FoxM1組t SSP-25-Control組SSP-25-shFoxM1組t MMP-9 1.08±0.12 2.29±0.25 10.464＊＊1.05±0.05 0.47±0.01 10.521＊＊MMP-2 1.00±0.09 2.40±0.31 15.640＊＊1.04±0.03 0.53±0.08 15.992＊＊FoxM1 1.05±0.11 2.71±0.28 15.044＊＊1.03±0.04 0.27±0.11 18.603＊＊

FoxM1在惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生、增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。一項(xiàng)研究通過(guò)siRNA干擾非漿液性上皮性卵巢癌細(xì)胞株FoxM1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)FoxM1表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成［13］。另一項(xiàng)研究報(bào)道FoxM1影響HCC組織染色體穩(wěn)定性，在HCC發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用［14］。Yu等［15］發(fā)現(xiàn)FoxM1在高轉(zhuǎn)移潛能HCC細(xì)胞MHCCLM3中的表達(dá)較低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞SMMC7721明顯升高，并且與HCC細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，從而促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移。FoxM1在多種惡性腫瘤包括HCC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等演進(jìn)過(guò)程中具有重要作用，深入研究其特點(diǎn)及機(jī)制具有重要價(jià)值。而目前FoxM1影響ICC細(xì)胞惡性表型方面的功能尚不清楚，在ICC細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。

本研究首先運(yùn)用Western blot技術(shù)分別檢測(cè)3種ICC細(xì)胞株中FoxM1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SSP-25細(xì)胞株中FoxM1表達(dá)最高，HCCC-9810中表達(dá)最低，決定選取HCCC-9810作為上調(diào)FoxM1細(xì)胞株，SSP-25作為下調(diào)FoxM1細(xì)胞株。筆者選用目前已經(jīng)廣泛使用且穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)的慢病毒載體作為FoxM1轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)手段，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)及摸索最佳轉(zhuǎn)染條件，成功建立了FoxM1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ICC細(xì)胞株。隨后經(jīng)Western blot驗(yàn)證，HCCC-9810-FoxM1、SSP-25-shFoxM1及兩種相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞株HCCC-9810-Control、SSP-25-Control均能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)FoxM1，且HCCC-9810-FoxM1上調(diào)FoxM1表達(dá)明顯，SSP-25-shFoxM1則下調(diào)明顯，達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。接下來(lái)一系列體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)HCCC-9810-FoxM1細(xì)胞較Control組細(xì)胞在增殖及侵襲能力上明顯增強(qiáng)，而下調(diào)FoxM1表達(dá)的SSP-25-shFoxM1細(xì)胞較Control組細(xì)胞在增殖及侵襲能力上明顯降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FoxM1能夠體外促進(jìn)ICC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及轉(zhuǎn)移。

研究表明，下調(diào)FoxM1表達(dá)降低了MMP-9及MMP-2的表達(dá)和活性，從而抑制了腎透明細(xì)胞癌的遷移及侵襲［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)ICC細(xì)胞侵襲能力，而MMP-9和MMP-2表達(dá)增加，表明MMP-9及MMP-2表達(dá)變化可能在FoxM1參與調(diào)控ICC侵襲過(guò)程中起到一定作用，但MMP-9和MMP-2表達(dá)是否為FoxM1直接調(diào)控或者是間接控制，目前尚不明確。

綜上，本研究初步闡明了FoxM1在ICC中上調(diào)可明顯增強(qiáng)ICC細(xì)胞增殖及侵襲能力，而下調(diào)FoxM1表達(dá)可顯著抑制其增殖及侵襲能力，F(xiàn)oxM1可能促進(jìn)ICC中MMP-9及MMP-2表達(dá)，促進(jìn)ICC增殖及侵襲，并可能通過(guò)MMP-9及MMP-2起作用，但相關(guān)具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。FoxM1有望成為ICC新的生物標(biāo)志物及ICC治療的新靶點(diǎn)。本研究為揭示ICC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，并為探索ICC有效的診治策略提供了新思路。