龍光文，張謙，楊秀林，吉春玲，董裕康

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是急性肺損傷（ALI）較為嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，常伴有炎癥反應(yīng)、肺纖維化和肺功能降低，其中肺纖維化是導(dǎo)致ARDS發(fā)病和死亡的主要原因［1］。ARDS的治療方式主要有機(jī)械通氣、肺水清除與液體管理等［2-3］，但這些支持性治療并不能逆轉(zhuǎn)ARDS的病理生理過程，且目前仍然無有效的治療藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1/Smad信號通路在ARDS肺纖維化中發(fā)揮著重要作用［4］。TGF-β1通過激活下游Smad信號通路促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞過度增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡細(xì)胞過度積累，導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生和發(fā)展［5］。Hu等［6］發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1/Smad通路可減輕ARDS肺纖維化的炎癥反應(yīng)，是改善ARDS肺纖維化的有效措施。miR-33是一種高度保守的miRNA，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)，同時促進(jìn)組織纖維化［7-8］。Nishiga等［9］發(fā)現(xiàn)，抑制miR-33表達(dá)可抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制心肌纖維化。然而，miR-33是否通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路參與ARDS肺纖維化過程目前尚不明確。本研究采用脂多糖（LPS）頸部氣管滴注構(gòu)建ARDS模型，探討抑制miR-33表達(dá)對ARDS大鼠肺纖維化的影響及其可能作用機(jī)制，以期為ARDS提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物 60只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量190～210 g，購于西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SYSK（川）2018-065。所有大鼠均在12 h晝夜循環(huán)，溫度（24±2）℃和濕度45%～55%的環(huán)境下飼養(yǎng)，正常給予食物和水。

1.1.2 主要試劑與儀器 miR-33 antagomir及其陰性對照（antagomir-NC）購自上海GenePharma公司；LPS購自上海阿拉丁試劑有限公司；兔抗TGF-β1、Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、GAPDH及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體均購自英國Abcam公司；Masson染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司；miRcute miRNA提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；RT2miRNA First Strand Kit（331401）購自美國SABiosciences公司；GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司；iScript cDNA Synthesis和SYBR Green試劑盒均購自美國BIO-RAD公司；羥脯氨酸（Hyp）含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PT1000血?dú)夥治鰞x購自武漢明德生物科技股份有限公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)和實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）儀器均購自美國BIO-RAD公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分成假手術(shù)組（Sham組）、ARDS模型組（Model組）、antagomir陰性對照組（antagomir-NC組）和miR-33 antagomir組（antagomir組），每組15只。除Sham組外，其他組大鼠均通過頸部氣管滴注10 mg/kg LPS建立ARDS模型［10］，而Sham組經(jīng)頸部氣管滴注同體積的生理鹽水。若造模大鼠出現(xiàn)食欲下降，精神萎靡，呼吸急促等癥狀且氧合指數(shù)（OI）＜200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），說明ARDS模型構(gòu)建成功，剔除不成功大鼠并及時補(bǔ)充。造模成功后，antagomir-NC組和antagomir組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射80 nmol脂質(zhì)體包被的antagomir-NC和miR-33 antagomir，注射體積為200μL，而Sham組和Model組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量的生理鹽水，1次/周，干預(yù)2周后處死大鼠，取材檢測。

1.2.2 動脈血氧分壓［p（O2）］及OI檢測 充分麻醉大鼠后，打開腹腔，暴露腹主動脈，用含肝素鈉的注射器抽取1 mL主動脈血，采用血?dú)鉁y定試劑盒和PT1000血?dú)夥治鰞x檢測p（O2）和OI，OI=p（O2）/吸入氣中的氧濃度分?jǐn)?shù)（FiO2）。

1.2.3 HE及Masson染色 處死大鼠后取肺組織，用生理鹽水沖洗，置于10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，制成約3μm厚的切片，分別進(jìn)行HE和Masson染色，二甲苯透明，中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化和纖維化程度，其中Masson染色中膠原纖維顯示為藍(lán)色。

1.2.4 堿性水解法檢測Hyp含量 取適量肺組織，用生理鹽水沖洗后，加入適量的6 mol/L鹽酸于100℃下水解5 h，再按照Hyp檢測試劑盒操作說明測定Hyp含量。

1.2.5 ELISA檢測炎性因子水平 處死大鼠后，打開胸腔并結(jié)扎肺組織肺門，頸部氣管做“V”型切口后放入靜脈留置針套管，用500μL的0.9%NaCl溶液反復(fù)灌洗支氣管肺泡3次，收集肺泡灌洗液（BALF），4℃，3 000×g離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒操作說明測定BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子水平。

1.2.6 qPCR檢測miR-33及TGF-β1、膠原（Collagen）Ⅰ和CollagenⅢmRNA水平 采用miRNA提取分離試劑盒提取肺組織中的miRNA，Trizol法提取總RNA，分別取2.0μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。采用20μL反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)。miR-33以U6為內(nèi)參對照，TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA均以GAPDH為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測肺組織中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、α-SMA蛋白表達(dá)水平 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液處理肺組織提取總蛋白，用BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將等量的蛋白質(zhì)加載到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上，然后通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，將膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入TGF-β1抗體（1∶1 000）、Smad2抗體（1∶1 000）、p-Smad2抗體（1∶2 000）、Smad3抗體（1∶1 000）、p-Smad3抗體（1∶2 000）、α-SMA抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），4℃下孵育過夜，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔lgG二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h，再次沖洗后，將膜放置于凝膠成像系統(tǒng)中，加入200μL ECL顯色液覆蓋膜表面，顯影拍照，使用Image 6.0軟件計算各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參對照計算各蛋白相對表達(dá)水平，蛋白磷酸化水平用磷酸化蛋白和各自的總蛋白之間的比率表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠p（O2）及OI比較 與Sham組比較，Model組大鼠p（O2）和OI均降低（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠p（O2）和OI升高（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of p(O2)and OI between the four groups of rats表2 各組大鼠p（O2）及OI比較（n=15，mmHg，±s）

Tab.2 Comparison of p(O2)and OI between the four groups of rats表2 各組大鼠p（O2）及OI比較（n=15，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F p（O2）97.73±7.49 68.11±1.99a 69.60±1.55a 80.24±1.91abc 33.845＊＊OI 459.30±21.27 158.94±18.48a 157.19±13.64a 268.27±22.52abc 162.902＊＊

Fig.1 HE staining and Masson staining of lung tissue(×200)圖1 肺組織HE染色及Masson染色（×200）

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，Sham組無明顯肺泡結(jié)構(gòu)損傷、炎癥或出血；Model組和antagomir-NC組大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，肺泡間隔明顯水腫增厚，炎性細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞增多，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，部分肺泡間隔破裂；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤、出血、肺間質(zhì)腫脹明顯減少，肺組織損傷明顯改善。Masson染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整且無明顯的膠原纖維沉積；與Sham組比較，Model組和antagomir-NC組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)被破壞且肺間質(zhì)明顯有大量藍(lán)色膠原纖維；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠藍(lán)色膠原分布明顯減輕。

2.3 各組大鼠肺組織中Hyp含量比較 Sham組、Model組、antagomir-NC組和antagomir組大鼠肺組織中Hyp含量（μg/g）分別為412.04±31.92、812.67±28.67、810.63±38.51和537.68±29.04，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=15，F(xiàn)=116.472，P＜0.05）。與Sham組比較，Model組大鼠肺組織中Hyp含量升高（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織中Hyp含量降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠BALF中炎性因子水平比較 與Sham組比較，Model組大鼠BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokinesin in lung tissue between the four groups of rats表3 各組大鼠肺組織中炎性因子水平比較（n=15，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokinesin in lung tissue between the four groups of rats表3 各組大鼠肺組織中炎性因子水平比較（n=15，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F IL-1β 28.70±8.30 61.56±11.72a 60.79±8.85a 39.83±2.23bc 10.859＊＊IL-6 41.84±10.71 158.18±24.13a 157.15±35.72a 88.64±12.92abc 18.017＊＊TNF-α 107.51±19.57 431.92±23.58a 430.37±16.17a 288.11±23.74abc 160.420＊＊

2.5 各組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA水平比較 與Sham組比較，Model組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。見表4。

2.6 各組大鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與Sham組比較，Model組大鼠 肺 組 織 中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.05）。見圖2，表5。

Tab.4 Comparison of the expression level of miR-33 and mRNA expression levels of TGF-β1,CollagenI and CollagenⅢbetween the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenI和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平比較（n=15，±s）

Tab.4 Comparison of the expression level of miR-33 and mRNA expression levels of TGF-β1,CollagenI and CollagenⅢbetween the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenI和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F miR-33 1.00±0.27 2.21±0.26a 2.21±0.20a 0.08±0.02abc 71.948＊＊TGF-β1 1.01±0.05 2.18±0.24a 2.15±0.21a 1.38±0.17abc 30.299＊＊CollagenⅠ1.00±0.07 1.80±0.17a 1.80±0.15a 1.46±0.06abc 29.265＊＊CollagenⅢ1.00±0.09 1.97±0.21a 1.94±0.12a 1.35±0.11abc 34.497＊＊

Fig.2 Western blot assay of TGF-β1,Smad2,p-Smad2,Smad3,p-Smad3 andα-SMA in lung tissue of rat in each group圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和α-SMA蛋白印跡圖

3 討論

ARDS是急性肺損傷的一種危險并發(fā)癥，具有很高的發(fā)病率和病死率。ARDS的主要病理特征是肺纖維化，ARDS肺纖維化是由肺部炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)的反復(fù)破壞和修復(fù)引起的持續(xù)性肺泡損傷，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫［11］。在ARDS過程中，當(dāng)肺部受到感染或創(chuàng)傷時，炎癥通路就會被激活。炎癥反應(yīng)有助于清除病原體，但過度的炎癥也會導(dǎo)致肺泡損傷和肺泡水腫液的積累，ARDS肺泡水腫液中含有高水平的炎性細(xì)胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1等，當(dāng)細(xì)胞因子水平過高時，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起肺泡損傷，并伴有Hyp和膠原含量增加，發(fā)生纖維化沉積，發(fā)展成肺纖維化，最終導(dǎo)致急性呼吸衰竭［12］。即使在最大支持容許性高CO2通氣和體外膜氧合的治療情況下，ARDS患者仍表現(xiàn)出肺功能不可逆的惡化［13］，目前還沒有可以完全改善ARDS肺纖維化的治療方法。

Tab.5 Comparison of protein expression levels of TGF-β1,p-Smad2/Smad2,p-Smad3/Smad3 andα-SMA in lung tissue between the four groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)水平比較（n=15，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of TGF-β1,p-Smad2/Smad2,p-Smad3/Smad3 andα-SMA in lung tissue between the four groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)水平比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F TGF-β1 0.31±0.05 0.75±0.07a 0.74±0.05a 0.37±0.02bc 61.722＊＊p-Smad2/Smad2 0.32±0.03 0.87±0.10a 0.87±0.11a 0.56±0.10abc 26.354＊＊p-Smad3/Smad3 0.41±0.06 0.79±0.06a 0.79±0.07a 0.61±0.06abc 23.452＊＊α-SMA 0.21±0.02 0.49±0.05a 0.50±0.07a 0.30±0.04bc 22.852＊＊

miR-33是一種非編碼RNA，也是M1巨噬細(xì)胞表型的炎性介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)miR-33的表達(dá)與IL-6和TNF-α等炎性因子含量呈正相關(guān)，miR-33抑制劑可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1表型分化為M2表型并減少THP-1細(xì)胞中IL-6和TNF-α等炎性因子的表達(dá)［14］。同時miR-33也被認(rèn)為是一種促纖維化miRNA［15］。有研究報道，miR-33參與了肝臟動脈粥樣硬化病變和纖維化反應(yīng)的炎癥過程［16］。Yu等［17］通過基因敲除發(fā)現(xiàn)miR-33a的缺失可通過抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，從而抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖和纖維化。然而抑制miR-33表達(dá)可否改善ARDS肺纖維化尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠肺纖維化模型，采用miR-33 antagomir通過與miR-33靶向互補(bǔ)來沉默miR-33，探討抑制miR-33表達(dá)對ARDS大鼠肺纖維化的影響及其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，Model組大鼠中p（O2）和OI均降低，肺組織中Hyp含量升高，HE染色和Masson染色結(jié)果也顯示肺組織損傷和纖維化嚴(yán)重，表明ARDS造模成功。抑制miR-33表達(dá)后ARDS大鼠中p（O2）和OI升高，Hyp含量降低，且肺組織損傷和纖維化情況明顯改善，說明抑制miR-33表達(dá)可改善ARDS大鼠肺纖維化。

TGF-β1/Smad信號通路被認(rèn)為是組織纖維化的主要調(diào)節(jié)因子，有助于肌成纖維細(xì)胞的激活和膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的過度生成，從而促進(jìn)組織纖維化的形成［18］。TGF-β1激活的Smad信號通路可使Ⅰ型受體介導(dǎo)的Smad2和Smad3磷酸化，從而增加CollagenⅠ和CollagenⅡ等纖維化相關(guān)基因以及IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子的表達(dá)［19］。TGF-β1/Smad信號通路在ARDS肺纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［20］。TGF-β1可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠早期肺纖維化的發(fā)展［21］。抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活可以有效改善組織纖維化。Mu等［22］研究發(fā)現(xiàn)，肝素能有效抑制TGF-β1和p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路改善LPS誘導(dǎo)的ARDS肺纖維化［23］。本研究進(jìn)一步對抑制miR-33表達(dá)改善ARDS大鼠肺纖維化的作用機(jī)制是否與TGF-β1/Smad信號通路有關(guān)進(jìn)行探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ARDS大鼠BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)升高，說明有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，肺組織中TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平及TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)水平均升高，表明TGF-β1/Smad信號通路處于激活狀態(tài)。抑制miR-33表達(dá)后TGF-β1/Smad信號通路被抑制，炎癥反應(yīng)也明顯減輕。因此，抑制miR-33表達(dá)后ARDS大鼠肺纖維化的改善可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，抑制miR-33的表達(dá)可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活，減少炎性因子的產(chǎn)生和異常膠原表達(dá)和分布，從而減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠肺損傷和肺纖維化，miR-33表達(dá)抑制劑可能成為ARDS肺纖維化患者的一種新的治療選擇，但miR-33與TGF-β1/Smad信號通路分子之間的具體作用關(guān)系以及miR-33在ARDS發(fā)病機(jī)制中的作用尚需進(jìn)一步研究。