劉秀珍 王蘊(yùn)紅 張冰 彭慶文

1 安慶師范大學(xué)體育學(xué)院（安徽安慶246133）

2 首都體育學(xué)院運(yùn)動科學(xué)與健康學(xué)院（北京100191）

3 清華大學(xué)體育部（北京100084）

4 懷化學(xué)院體育學(xué)院（湖南懷化418000）

馬拉松是目前最受歡迎的一項(xiàng)長跑體育賽事，但同時(shí)也是一項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)的運(yùn)動。勞力性熱射?。╡xertional heat stroke，EHS）是馬拉松運(yùn)動員發(fā)生猝死的重要原因[1]。勞力性熱射病是在運(yùn)動中體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)不堪重負(fù)時(shí)發(fā)生的核心體溫過高（＞40℃/＞104℉）以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[2]。勞力性熱射病是一種醫(yī)學(xué)急癥，病情進(jìn)展極快，半小時(shí)內(nèi)沒有接受快速降溫處理的患者發(fā)生多器官衰竭乃至死亡的病例明顯上升[3]。對于確診病例或疑似患者，必須在現(xiàn)場快速冷卻治療，然后才是轉(zhuǎn)運(yùn)到急診部[4]。

勞力性熱射病發(fā)病機(jī)制涉及高溫?zé)釗p傷、胃腸道缺血、熱休克反應(yīng)、凝血系統(tǒng)激活、腎臟水鹽代謝失衡等方面[5-7]。其冷卻治療機(jī)制可能與腎臟水鹽代謝、熱損傷、胃腸道炎癥變化、凝血功能等有關(guān)，其中水鹽代謝與體溫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[8，9]?？估蚣に兀╲asopressin），是機(jī)體調(diào)節(jié)水平衡的重要激素，其分泌異常增多與運(yùn)動性疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分。Oh 及Siegel[10，11]的研究表明，在馬拉松等耐力性運(yùn)動中發(fā)生的勞力性熱射病及運(yùn)動性低鈉血癥與機(jī)體嚴(yán)重脫水引起的抗利尿激素過度分泌有關(guān)。Kim 等[12]的研究表明，冷應(yīng)激能誘導(dǎo)抗利尿激素mRNA 表達(dá)顯著性下調(diào)，但是有關(guān)冷卻治療是否能誘導(dǎo)勞力性熱射病患者抗利尿激素的改變并沒有進(jìn)一步的研究結(jié)果?？估蚣に赜? 種受體，分別是受體1（V1）、受體2（V2）和受體3（V3），其中V2 受體主要分布在腎臟集合管，介導(dǎo)抗利尿激素在腎臟中對水的重吸收，發(fā)揮抗利尿作用[13，14]。Sun 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境引起大鼠V2 受體合成中V2 mRNA 表達(dá)顯著性降低及利尿現(xiàn)象。但是冷卻治療是否通過調(diào)控抗利尿激素及其受體V2 對機(jī)體水代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究探討了冷卻治療對抗利尿激素及其受體V2 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響，為勞力性熱射病冷卻治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與測試過程

7 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠，初始體重為237.82 ± 30.78 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，人工光照控制晝夜節(jié)律，室溫20℃~25℃，濕度45%~50%。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 天，隨機(jī)分為6 組，常溫對照組（normal control group，NC 組）8 只、熱射病發(fā)病組（heat stroke onset group，HSO 組）9 只、熱射病休息1 組（heat stroke rest group 1，HSR1 組）9 只、熱射病冷浸1 組（heat stroke cold group 1，HSC1 組）7 只、熱射病休息2 組（heat stroke rest group 2，HSR2 組）9 只和熱射病冷浸2 組（heat stroke cold group 2，HSC2 組）8只，各組大鼠體重?zé)o顯著性差異。在高溫運(yùn)動至力竭建立勞力性熱射病大鼠模型及冷卻治療期間進(jìn)行體溫測試，測試時(shí)間點(diǎn)分別為運(yùn)動前、運(yùn)動后、冷浸5 min或休息5 min、休息60 min。對完成預(yù)定實(shí)驗(yàn)的大鼠取材，進(jìn)行生理指標(biāo)測試：血液測試指標(biāo)為紅細(xì)胞比容（hematocrit，Hct）和抗利尿激素；腎臟測試指標(biāo)為抗利尿激素受體V2 mRNA 表達(dá)和V2 蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動物分組及測試過程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)動物分組及測試過程

1.2 實(shí)驗(yàn)動物模型制備與冷卻治療

1.2.1 適應(yīng)性訓(xùn)練

熱射病組大鼠在建模前先進(jìn)行為期5 天的適應(yīng)性訓(xùn)練。跑臺坡度設(shè)置為0。起始運(yùn)動速度為18 m/min，每天遞增2 m/min，最后達(dá)到26 m/min。起始運(yùn)動時(shí)間為30 min，每天遞增10 min，最后達(dá)到60 min。適應(yīng)性訓(xùn)練安排見表1。

表1 大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練安排

1.2.2 勞力性熱射病大鼠模型建立

適應(yīng)性訓(xùn)練后休息3 天，大鼠在跑臺上進(jìn)行一次性高溫力竭運(yùn)動實(shí)驗(yàn)，建立勞力性熱射病大鼠模型。高溫力竭運(yùn)動實(shí)驗(yàn)在高溫高濕實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，溫度控制為36℃±1℃，濕度控制為75% ±5%相對濕度（relative humidity，RH）。根據(jù)Bedford[16]最大攝氧量表及大鼠高溫力竭運(yùn)動預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大鼠進(jìn)行跑臺運(yùn)動時(shí)坡度為5°，速度為28 m/min，相當(dāng)于最大攝氧量60%~80%的運(yùn)動強(qiáng)度。根據(jù)Lam[17]報(bào)道的經(jīng)典型熱射病大鼠模型（暴露在高溫環(huán)境中的大鼠直腸溫度上升到約42℃和平均動脈壓從峰值下降到約25毫米汞柱）和Chang[18]報(bào)道的熱運(yùn)動至力竭誘導(dǎo)勞力性熱射病大鼠模型以及勞力性熱射病大鼠建模預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定勞力性熱射病大鼠模型診斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在高溫環(huán)境中運(yùn)動至力竭，并使直腸溫度上升到約42℃。大鼠運(yùn)動至力竭標(biāo)準(zhǔn)為不能維持既定運(yùn)動強(qiáng)度，滯留于跑臺后擋板，使用聲、電刺激及毛刷連續(xù)驅(qū)趕3次無效。

1.2.3 冷水浸泡治療方案

根據(jù)Riana[7]報(bào)道的海軍陸戰(zhàn)隊(duì)馬拉松運(yùn)動中勞力性熱射病冷卻治療方案和Stewart[6]報(bào)道的耐力運(yùn)動中勞力性熱射病患者院前冷卻治療案例設(shè)定大鼠冷水浸泡預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立大鼠冷水浸泡方案。本研究冷水浸泡方案最終確定為19℃（實(shí)際溫度為19℃±1℃），冷水浸泡5 min。大鼠休息溫度設(shè)定為室溫20℃（實(shí)際溫度為20℃±1℃）。高溫運(yùn)動至力竭建立勞力性熱射病大鼠模型后，HSR1 組大鼠休息5 min，HSC1 組大鼠冷浸5 min，HSR2組大鼠休息5 min+60 min，HSC2組大鼠冷浸5 min，休息60 min。HSC1 組和HSC2 組大鼠用于觀察冷卻治療后不同時(shí)間點(diǎn)的生理反應(yīng)變化，HSC1 組用于觀察冷卻治療后即刻效果，HSC2 組用于觀察冷卻治療后60 min效果。HSR1組和HSR2組大鼠用于觀察未經(jīng)冷卻治療相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的生理反應(yīng)變化，HSR1組用于觀察休息5 min效果（與HSC1組對照），HSR2組用于觀察休息60 min 效果（與HSC2 組對照）。冷卻速率以大鼠冷浸5 min 期間單位時(shí)間內(nèi)核心體溫的減少量來表示，其計(jì)算公式為v＝。

1.3 取材及處理

按照0.32 ml/100 g 體重的劑量給大鼠注射10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。冰上解剖大鼠，從腹主動脈取4 ml 血液，2 ml 血液用于測試血常規(guī)，另2 ml 血液用于測試抗利尿激素；摘取腎臟后立即放入液氮中冷凍及保存。

1.4 測試指標(biāo)與方法

1.4.1 核心體溫測試

采用北京搏貝科技有限公司JNT-200 型鼠肛溫計(jì)測量大鼠直腸溫度作為核心體溫。測量方法為：將溫度計(jì)探頭插入大鼠直腸6.5 cm，固定探頭，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值[9]。

1.4.2 血液紅細(xì)胞比容

采用全自動血細(xì)胞分析儀測試大鼠血常規(guī)，單管測定，選取Hct 指標(biāo)進(jìn)行研究，儀器為日本光電工業(yè)株式會社MEK-7222K 血細(xì)胞分析儀，試劑由上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司提供，批內(nèi)差：CV≤1.5%，批間差：CV≤2%。

1.4.3 血清抗利尿激素

采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測試大鼠血清抗利尿激素，單管測定，儀器為美國ThermoMK3 酶標(biāo)儀，ELISA 試劑盒來自美國Enzolife 公司，批內(nèi)差：CV≤10%，批間差：≤15%。

1.4.4 腎臟V2mmRRNNAA表達(dá)

采用熒光定量qRT-PCR 檢測系統(tǒng)測試腎臟V2 mRNA 表達(dá)。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫查找的目的基因V2及內(nèi)參GAPDH 的基因序列設(shè)計(jì)引物，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（見表2）。取適量組織放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末并轉(zhuǎn)移到EP 管中，用美國Invitrogen 公司提供的Trizol試劑抽提總RNA，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入特異性引物，采用EvaGreen 飽和染料Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 檢測，每個(gè)樣本重復(fù)三次。獲取CT 值、平均CT 值、△CT 值和△△CT 值，采用2-△△CT相對定量公式計(jì)算V2基因的相對表達(dá)量。

表2 熒光定量qRT-PCR引物

1.4.5 腎臟V2蛋白表達(dá)

1）蛋白抽提：預(yù)冷RIPA 蛋白抽提試劑，加入cocktail 蛋白酶抑制劑；12000 rpm 離心15 min。取上清，進(jìn)行蛋白定量。2）BCA 法蛋白定量：按照BCA 蛋白定量試劑盒使用說明測定蛋白濃度。3）Western Blot 檢測：根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。將樣本分別加入凝膠孔中，30 μg/孔。電泳條件為：濃縮膠恒壓90 V，20 min；分離膠恒壓150 V，根據(jù)預(yù)染蛋白marker 確定電泳時(shí)間。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜條件為：100 V 恒壓；0.22 μm 孔徑PVDF 膜，60 min。5%BSA-TBST 室溫封閉，水平搖床孵育1 h。一抗孵育：5%BSA-TBST稀釋一抗（抗利尿激素，1∶2000；GAPDH，1∶1000，Abcam公司），一抗來源為兔，4℃水平搖床孵育過夜。第2 日，TBST 洗膜：3×10 min。二抗孵育：5%BSA-TBST 稀釋二抗[山羊抗兔IgG（H+L），HRP，1∶10000，Abcam 公司]，室溫孵育1 h。將ECL 發(fā)光液滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3~5 min。膠片曝光：10 s~5 min，顯影2 min，定影。4）計(jì)算結(jié)果：采用Image J 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，Western Blot 結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。組間比較應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)K 個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，有顯著性后再進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)；后續(xù)檢驗(yàn)采用非參數(shù)檢驗(yàn)2 個(gè)獨(dú)立樣本Mann-Whitney U 檢驗(yàn)方法。采用非參數(shù)檢驗(yàn)2 個(gè)相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 符號秩檢驗(yàn)方法對同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠核心體溫及冷卻速率

高溫運(yùn)動前，各組大鼠核心體溫在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.01）。后續(xù)U 檢驗(yàn)和Wilcoxon 檢驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。高溫運(yùn)動前，與NC 組比較，HSO 組大鼠核心體溫顯著升高（P＜0.01）；而參加高溫運(yùn)動實(shí)驗(yàn)的5組（HSO 組、HSR1 組、HSC1 組、HSR2 組和HSC2 組）大鼠核心體溫相互間均無顯著性差異（P＞0.05）。同一組大鼠運(yùn)動后核心體溫與運(yùn)動前比較，HSC1 組和HSC2組顯著升高（均P＜0.05）；HSO組、HSR1組與HSR2組顯著升高（均P＜0.01）。高溫運(yùn)動后各組大鼠核心體溫?zé)o顯著性差異（P＞0.05）。與HSR1 組比較，冷浸5 min 后的HSC1 組大鼠核心體溫顯著降低（P＜0.01）。與HSR2組比較，冷浸5 min 后的HSC2 組大鼠核心體溫顯著降低（P＜0.01）。與HSR2 組比較，冷浸5 min+休息60 min后的HSC2 組大鼠核心體溫顯著降低（P＜0.05）。參加冷浸的HSC1組和HSC2組大鼠在冷浸期間的冷卻速率分別為1.18 ± 0.25℃/min 和1.10 ± 0.26℃/min，二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠運(yùn)動前、后各時(shí)間點(diǎn)核心體溫及冷卻速率比較

2.2 大鼠血液紅細(xì)胞比容

各組大鼠紅細(xì)胞比容在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.05）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，與NC 組比較，HSO 組大鼠紅細(xì)胞比容顯著升高（P＜0.05）。其余組間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠紅細(xì)胞比容比較

2.3 大鼠血清抗利尿激素

各組大鼠血清抗利尿激素在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.05）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表5 所示，與NC 組比較，HSO 組大鼠血清抗利尿激素顯著升高（P＜0.01）。其余組間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 各組大鼠抗利尿激素比較

2.4 大鼠腎臟V2mRNA表達(dá)

各組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.01）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表6 所示，與NC組比較，HSO 組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與HSO 組比較，常溫休息HSR1 組和HSR2 組腎臟V2 mRNA 表達(dá)無顯著性差異（均為P＞0.05），經(jīng)過冷浸的HSC1 組和HSC2 組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)均顯著降低（均為P＜0.01）；與休息HSR1組比較，冷浸HSC1組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與休息HSR2 組比較，冷浸HSC2 組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

表6 各組大鼠腎臟V2 mRNA表達(dá)比較

2.5 大鼠腎臟V2蛋白表達(dá)

各組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.01）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表7 所示，與NC 組比較，HSO 組大鼠腎臟蛋白表達(dá)顯著性升高（P＜0.01）；與HSO 組比較，常溫休息HSR1 組和HSR2 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)無顯著性差異（均為P＞0.05），經(jīng)過冷浸的HSC1 組和HSC2 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)顯著降低（均為P＜0.05）；與休息HSR1 組比較，冷浸HSC1 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）；與休息HSR2組比較，冷浸HSC2 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。

表7 各組大鼠腎臟V2蛋白表達(dá)比較

3 討論

3.1 冷療對EHS大鼠核心體溫的影響

本研究中常溫對照組未經(jīng)過適應(yīng)性訓(xùn)練，而5 個(gè)勞力性熱射病模型組均參加了適應(yīng)性訓(xùn)練。建模前，經(jīng)過適應(yīng)訓(xùn)練的熱射病發(fā)作HSO組大鼠核心體溫顯著高于未經(jīng)過適應(yīng)訓(xùn)練的常溫對照組，但是經(jīng)過適應(yīng)訓(xùn)練的5 組大鼠相互之間核心體溫并無顯著性差異。張婷等[19]建立了經(jīng)典型與勞力性熱射病動物模型，用于研究兩種模型大鼠各主要器官病理改變的異同，大鼠未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。Zhang 等[20]建立了勞力性熱射病大鼠模型，用于研究紅景天苷對線粒體的保護(hù)作用，大鼠在建模前未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。與張婷及Zhang 的研究有所不同的是，本研究在勞力性熱射病大鼠建模前均進(jìn)行了適應(yīng)性訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過適應(yīng)訓(xùn)練的大鼠核心體溫明顯高于未經(jīng)過適應(yīng)訓(xùn)練的大鼠，說明適應(yīng)性訓(xùn)練會引起大鼠核心體溫上升。

勞力性熱射病動物模型包括大鼠模型和小鼠模型。Chang 等[18]的研究表明，大鼠在36℃高溫下運(yùn)動至力竭時(shí)出現(xiàn)了核心體溫過高、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、血壓較低等熱射病癥狀。King 等[21]分別在37.5℃、38.5℃和39.5℃高溫下利用轉(zhuǎn)輪建立了熱射病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙（失去意識）時(shí)的最高核心體溫為42.1℃～42.5℃。與Chang 及King 的研究相類似，本研究中，高溫運(yùn)動至力竭的5 組大鼠均出現(xiàn)了勞力性熱射病癥狀，包括運(yùn)動后核心體溫上升到42.0℃左右和出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙（意識喪失），符合勞力性熱射病建模標(biāo)準(zhǔn)，表明勞力性熱射病建模成功。

冷水浸泡（cold water immersion，CWI）多用于既往體健的運(yùn)動員或士兵在勞力性熱射病發(fā)作最初幾分鐘時(shí)的快速降溫急救。Wohlfert 等[22]的研究表明，冷水浸泡由于降溫速率最快從而成為勞力性熱射病冷卻急救公認(rèn)最有效的方法，患者急救后幾乎全部存活。本研究中，HSC1 組大鼠在19℃冷浸5 min 后核心體溫由42.00℃降到36.10℃，且顯著低于HSR1 組大鼠在20℃環(huán)境中休息5 min 后的核心體溫（39.68℃）；HSC2 組大鼠在19℃冷浸5 min 后核心體溫由41.76℃降到36.36℃，且顯著低于HSR2 組大鼠在20℃環(huán)境中休息5 min 后的核心體溫（39.13℃），說明19℃冷浸5 min 對勞力性熱射病大鼠核心體溫已產(chǎn)生顯著影響。Wohlfert等[23]對運(yùn)動員10℃冷水浸泡時(shí)的冷卻速率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)冷組和對照組在核心體溫從39.5℃降溫到38℃期間的冷卻速率分別為0.18℃/min 和0.19℃/min。Godek 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)：對39℃下熱運(yùn)動至力竭或核心體溫上升到39.5℃的運(yùn)動員進(jìn)行10℃冷水浸泡時(shí)，越野賽運(yùn)動員的冷卻速率（0.26℃/min）高于足球運(yùn)動員（0.16℃/min），但二者均被認(rèn)為是理想的冷卻速率（dT/dt＞0.155℃/min）；其中越野賽運(yùn)動員核心體溫下降2℃至正常所需的時(shí)間僅為8 min。與前人的研究有所不同，本研究中兩組熱射病大鼠冷水浸泡5 min 期間冷卻速率分別為1.18℃/min 和1.10℃/min，比人體冷卻速率更快，時(shí)間更短，提示不同物種在體溫調(diào)節(jié)方面可能存在較大的差異性。本研究中在20℃環(huán)境中休息60 min后，HSR2 組和HSC2 組大鼠核心體溫均有所下降；且HSC2 組大鼠核心體溫顯著低于HSR2 組大鼠，說明20℃環(huán)境休息不僅可以降溫，而且有助于延續(xù)冷卻治療效果。

3.2 冷療對EHS大鼠血液濃縮程度的影響

血常規(guī)指標(biāo)紅細(xì)胞比容是反映血液濃縮/稀釋程度的重要指標(biāo)，在臨床上常用于識別病人的脫水情況。全軍重癥醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會和全軍熱射病防治專家組[25，26]在中國熱射病診斷與治療專家共識中指出，勞力性熱射病發(fā)作時(shí)，因機(jī)體大量脫水引起血液濃縮及炎癥變化，導(dǎo)致血常規(guī)檢測異常，表現(xiàn)為紅細(xì)胞比容異常升高，血紅蛋白升高，血小板初期正常，繼而迅速下降，白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常升高、中性粒細(xì)胞百分比偏高等癥狀。本研究中HSO組大鼠在高溫力竭運(yùn)動誘導(dǎo)勞力性熱射病發(fā)作時(shí)出現(xiàn)紅細(xì)胞比容顯著性升高，表明紅細(xì)胞比容是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)。

Riana 等[7]的研究提出：冷水浸泡是確保馬拉松等耐力運(yùn)動所致勞力性熱射病患者存活的冷卻急救方案，隨后應(yīng)該立刻檢測血液指標(biāo)，包括血常規(guī)、電解質(zhì)、血糖、腎功能等，治療脫水、電解質(zhì)異常和急性腎功能衰竭等。Erkus 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，冷暴露會引起人體紅細(xì)胞比容下降。本研究中冷浸后即刻及其后60 min時(shí)，紅細(xì)胞比容有下降趨勢，但未見顯著性差異。這提示紅細(xì)胞比容對冷卻治療期間的溫度變化不敏感。脫水是引起紅細(xì)胞比容改變的根本原因。冷卻治療對紅細(xì)胞比容沒有明顯影響，提示冷卻治療未能明顯改善熱射病機(jī)體脫水狀況。

3.3 冷療對EHS大鼠血清抗利尿激素的影響

Casa 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動時(shí)機(jī)體過度脫水會引起體溫升高，并增加罹患熱射病風(fēng)險(xiǎn)?？估蚣に厥菣C(jī)體調(diào)節(jié)水代謝的關(guān)鍵性激素，能促進(jìn)腎臟對水的重吸收，起到抗利尿（抗脫水）效果。Saissy 等[29]的研究表明，勞力性熱射病會引起急性肝衰竭，這不僅與高熱會直接損傷肝實(shí)質(zhì)有關(guān)，也與抗利尿激素分泌過多使血液再分配引起急性肝缺血病情加重有關(guān)。在研究24小時(shí)超級耐力賽中相關(guān)低鈉血癥的發(fā)生率時(shí)，Chlibkova 等[30]研究表明，運(yùn)動性低鈉血癥與運(yùn)動過程中抗利尿激素過度釋放有關(guān)。本研究中，勞力性熱射病發(fā)作時(shí)，血清抗利尿激素明顯升高。上述研究結(jié)果表明，機(jī)體在通過抗利尿（抗脫水）途徑調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡的過程中會出現(xiàn)抗利尿激素過度釋放情況，使得機(jī)體水代謝發(fā)生障礙，不僅會引起運(yùn)動性低鈉血癥和急性肝損傷，也會導(dǎo)致勞力性熱射病。這提示血液抗利尿激素是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)。Jasnic 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，4℃冷暴露60 min 對大鼠血清抗利尿激素含量沒有明顯影響。本研究中，在冷浸后即刻及其后60 min 時(shí)，血清抗利尿激素均未出現(xiàn)顯著性變化，也說明冷浸并不能明顯改善抗利尿激素過度釋放情況。由于抗利尿激素的合成部位（下丘腦）與釋放部位（垂體后葉）并不一致，導(dǎo)致抗利尿激素釋放入血的過程滯后于抗利尿激素的合成過程。冷浸對熱射病大鼠血清抗利尿激素沒有明顯影響，其機(jī)制可能與抗利尿激素釋放入血的過程滯后于下丘腦抗利尿激素的合成有關(guān)，因此，冷卻治療與抗利尿激素的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

3.4 勞力性熱射病大鼠冷卻治療期間抗利尿激素及受體調(diào)節(jié)機(jī)制探討

抗利尿激素受體為G 蛋白耦聯(lián)受體（G proteincoupled receptors，GPCRs），包括V1、V2 和V3 三種類型。其中V2 受體位于腎臟集合管細(xì)胞的基底側(cè)膜，介導(dǎo)抗利尿激素在腎臟對水的重吸收，起到抗利尿（抗脫水）效果。Milander 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，鐵人三項(xiàng)運(yùn)動中V2 受體基因的高度表達(dá)與機(jī)體嚴(yán)重脫水導(dǎo)致的體重丟失存在顯著相關(guān)。Bes 等[33]的研究進(jìn)一步證實(shí)，腎臟過度抗利尿會誘導(dǎo)V2 基因發(fā)生致病性突變，導(dǎo)致腎病綜合征患者出現(xiàn)低鈉血癥。本研究中，勞力性熱射病發(fā)作時(shí)，除了嚴(yán)重脫水外，腎臟抗利尿激素受體V2 mRNA 及V2 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明機(jī)體在通過抗利尿（抗脫水）途徑調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡的過程中出現(xiàn)了抗利尿激素受體過度分泌情況，表明抗利尿激素受體V2 過度分泌與機(jī)體致病有關(guān)，提示血液抗利尿激素受體V2是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)。

包括人類在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動物在冷暴露時(shí)會發(fā)生利尿現(xiàn)象，但是利尿的機(jī)制并不完全一致。Sun 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，長期冷暴露（5℃）引起大鼠腎水排泄增多，血漿抗利尿激素水平無明顯變化，腎臟抗利尿激素受體V2 mRNA 表達(dá)顯著降低，說明長期冷暴露引起大鼠利尿是由于腎臟V2 受體的抑制，而不是抗利尿激素的抑制。Broman 等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，冷誘導(dǎo)低體溫大鼠（核心體溫為28℃）出現(xiàn)明顯的利尿利鈉，并伴有腎小球?yàn)V過率、尿滲透壓和血漿抗利尿激素顯著下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，滲透壓不受低體溫或去氨加壓素（選擇性V2 受體激動劑）影響，說明低體溫所致的利尿是由于抗利尿激素和腎髓質(zhì)高滲減少所致，而不是V2 受到了抑制。本研究重點(diǎn)探討冷卻治療對勞力性熱射病大鼠抗利尿激素及V2 受體的影響，結(jié)果顯示，在冷浸后即刻及60 min 時(shí)，調(diào)節(jié)水代謝的V2 mRNA 表達(dá)均顯著性下調(diào)、V2 蛋白表達(dá)均顯著減少，抗利尿激素均未出現(xiàn)顯著性變化。這些結(jié)果說明，冷卻治療后，抗利尿激素過度釋放情況未見明顯好轉(zhuǎn)，但是抗利尿激素受體V2過度分泌情況得到改善。這提示冷浸可以在一定程度上改善水代謝的調(diào)節(jié)，其機(jī)制可能是通過抑制V2 受體的分泌，減弱機(jī)體的過度抗利尿反應(yīng)。本研究中60 min 的20℃環(huán)境休息延續(xù)了冷浸5 min（或休息5 min）對抗利尿激素、V2 mRNA 和V2 蛋白表達(dá)的影響，提示60 min 的20℃環(huán)境休息有助于維持冷卻治療（或常溫休息）效果。

4 結(jié)論

冷浸可以快速有效地降低熱射病大鼠核心體溫，對血液Hct及抗利尿激素沒有明顯影響，但能夠顯著抑制腎臟抗利尿激素受體V2 mRNA 及蛋白表達(dá)，改善水代謝的調(diào)節(jié)。