陳平 耿小飛 劉曉莉 喬德才

1 北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院（北京100875）

2 吉首大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院（湖南吉首416000）

3 河北民族師范學(xué)院體育學(xué)院（河北承德067000）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是僅次于老年性癡呆的第二常見老年神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)是中樞性運動控制功能異常[1]。運動療法作為一種簡單易行且無副作用的非藥物療法，對PD 患者病情及癥狀緩解有一定作用，但運動防治PD 的神經(jīng)機制尚不夠明確[2]。本實驗室前期圍繞運動對神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的偏側(cè)PD 模型大鼠皮層-紋狀體突觸可塑性的研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺（dopamine，DA）耗竭導(dǎo)致PD 模型大鼠紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）樹突棘脫落與運動功能障礙出現(xiàn)具有相關(guān)性，運動干預(yù)可使PD 模型大鼠紋狀體MSNs樹突棘密度顯著增加，并伴隨著運動功能障礙顯著改善[3]。隨后又采用逆行神經(jīng)示蹤的方法，分別用熒光標記D1-MSNs 和D2-MSNs，發(fā)現(xiàn)PD 模型大鼠紋狀體D2-MSNs 樹突棘密度選擇性丟失；運動干預(yù)可使PD 模型大鼠紋狀體D2-MSNs 樹突棘丟失顯著逆轉(zhuǎn)[4]。研究表明，代謝型谷氨酸受體2/3（metabotropic glutamate receptor 2/3，mGluR2/3）定位于皮層-紋狀體突觸前末梢，激活或者上調(diào)mGluR2/3能抑制電壓依賴型Ca2+通道的活性，阻止Ca2+內(nèi)流，從而使神經(jīng)元囊泡釋放出的谷氨酸（glutamate，Glu）水平降低，并最終降低Glu 興奮性神經(jīng)毒作用[5]。那么，運動是否通過上調(diào)紋狀體mGluR2/3 表達水平從而介導(dǎo)了PD 模型大鼠紋狀體MSNs功能運動依賴可塑性，目前尚未見到相關(guān)的實驗證據(jù)。因此，本研究擬采用多通道在體電生理記錄系統(tǒng)，對清醒靜止?fàn)顟B(tài)下PD模型大鼠紋狀體神經(jīng)元電活動，如動作電位（spike）、局部場電位（local field potential，LFP）進行觀察，并通過對各相關(guān)指標的綜合分析，從紋狀體神經(jīng)元電生理學(xué)角度驗證mGluR2/3介導(dǎo)了PD模型大鼠紋狀體MSNs功能運動依賴可塑性這一假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年健康雄性清潔級SD 大鼠，體重240 ± 10 g（8周齡），購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可號：SCXK（京）2009-0007]。大鼠分籠飼養(yǎng)，3～4只/籠，12 h/12 h 晝夜循環(huán)，動物房內(nèi)溫度控制在22℃± 2℃。除了自由進食和飲水之外，在動物實驗過程中，按照實驗動物使用的3R 原則，給予人道主義關(guān)懷。正式實驗前進行為期7 天的環(huán)境適應(yīng)及強迫跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除無法完成預(yù)設(shè)跑臺訓(xùn)練方案的大鼠，隨機分為假手術(shù)安靜組（Control組，n=9）和6-OHDA 損毀造模組（6-OHDA 組，n=40）；6-OHDA 組經(jīng)鑒定符合PD 模型的大鼠隨機分為6-OHDA 安靜組（PD 組，n=9）、6-OHDA+運動組（PD+Ex 組，n=9）和6-OHDA+運動+mGluR2/3拮抗劑組（PD+Ex+APICA 組，n=9）。

1.2 PD模型的建立與評價

大鼠禁食24 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠。于可調(diào)節(jié)的大鼠腦立體定位儀上充分暴露前后囟使之保持在同一水平面上。參照Paxionos 和Watson 大鼠腦定位圖譜[6]確定右腦內(nèi)側(cè)前腦束（medial forebrain bundle，MFB）坐標（AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，H：7.6~7.8 mm）作為6-OHDA 注射（2 μg/μL，1 μL/min，4 min）點，注射完畢留針5~10 min，緩慢退針。假手術(shù)組大鼠在相同注射點給予等量含0.02 %抗壞血酸的生理鹽水。手術(shù)完成待大鼠清醒后放置籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)。

在手術(shù)完成后7 d，分別對各組大鼠進行阿撲嗎啡（apomorphine，APO）誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實驗。實驗在安靜的環(huán)境下進行，按照每100 g 體重0.1 mg APO 的劑量將其溶液注射于大鼠的頸部皮下，計數(shù)30 min 時間內(nèi)大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)（大鼠以左側(cè)后肢為軸，進行首尾相接的旋轉(zhuǎn)行為）。本研究篩選凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（逆時針方向旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減去順時針方向旋轉(zhuǎn)圈數(shù)）＞100 r/30 min作為PD大鼠模型制備成功的標準[7]，不符合PD 模型標準的大鼠剔除。

1.3 電極及給藥套管的植入

6-OHDA 或者生理鹽水注射完成之后，參照Paxinos 大鼠腦定位圖譜[6]，確定紋狀體電極（AP：0～1.7 mm，ML：2.5～3.7 mm，DV：4.5～5 mm）及給藥套管（AP：0.0 mm，ML：-0.2 mm，DV：-6.0 mm）坐標后，分別將微電極陣列和給藥套管植入相應(yīng)位置并固定。手術(shù)后將大鼠單籠飼養(yǎng)，并連續(xù)3 d 常規(guī)腹腔注射青霉素10 萬單位，以防術(shù)后感染。在此過程中隨時注意觀察大鼠的狀態(tài)。大鼠自由進食和飲水，并隨時觀察其狀況，必要時適當(dāng)延長注射抗生素的天數(shù)。

1.4 黑質(zhì)、紋狀體TH表達水平檢測

所有實驗結(jié)束后24 h，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，依次經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的生理鹽水（250 mL）和多聚甲醛（4 g/L，300 mL），斷頭取腦組織放入固定液中固定24 h，轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液至沉底，修塊，包埋。參照Paxionos 和Watson[6]大鼠腦立體定位圖譜確定紋狀體和黑質(zhì)位置，連續(xù)冠狀切片，每隔3張選取1張切片在0.01 M 的PBS（pH 7.4）中漂洗后，室溫下置于0.3% Triton X-100 的PBS 中破膜30 min，3% H2O2中孵育10 min，PBS 漂洗；腦片轉(zhuǎn)入5%山羊血清的PBS 中室溫孵育1 h，鼠抗TH 單克隆抗體（1∶3000）（Sigma，USA）孵育過夜；PBS 漂洗3 次后，室溫下生物素化兔抗孵育1 h，親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC-Elitekit，Vector Laboratories，USA）孵育1 h，PBS 漂洗3 次，DAB 溶液中顯色10~20 s。采用Olympus-DP72 型顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計分析酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxxylase，TH）平均光密度，判斷DA能神經(jīng)元的損毀情況。

1.5 mGluR2/3蛋白表達水平檢測

采用免疫印跡技術(shù)檢測紋狀體mGluR2/3 蛋白表達水平。大鼠腦組織于冰面上，快速剝離右側(cè)紋狀體，采用BCA 法測定蛋白量后加入5 倍SDS，沸水煮5 分鐘，冷卻后于-80℃冰箱保存待測。取30 μg蛋白樣品電泳分離后，置于PVDF膜上，再置入保鮮膜中，加入封閉液，室溫條件下緩慢搖動90 min。將膜置于用TBST 溶解的5%脫脂奶粉中封閉。加入兔抗mGluR2/3 于4℃孵育24 h，PBS 洗膜，加入羊抗兔的二抗，置于搖床上，室溫下孵育90 min 后，洗膜。室溫反應(yīng)1 h后加入化學(xué)發(fā)光液于膜上，X 射線曝光顯影，以β-actin 為內(nèi)參照，采用Image J 圖像分析軟件分析圖片，以每個條帶的積分光密度（IOD）值與其相對應(yīng)的β-actin 的IOD值之比表示蛋白的相對量。

1.6 運動干預(yù)方案和mGluR2/3拮抗劑干預(yù)

術(shù)后1 周，采用Tajiri 等[8]建立的運動方案，對PD+Ex 組進行跑臺運動干預(yù)。訓(xùn)練方案為：11 m/min，30 min/day，5 day/week（周六、日休息），持續(xù)4 周。在運動干預(yù)過程中，如果有大鼠不運動的情況，采用手動驅(qū)趕的方法使大鼠繼續(xù)完成運動。運動干預(yù)時間安排在每個訓(xùn)練日下午16：00～18：00 進行。Control 組與PD組在相同時間段內(nèi)同樣置于跑臺內(nèi)，但不進行跑臺運動，使其處于自然安靜狀態(tài)。

PD+Ex+APICA 組每次運動前，采用微量注射泵將mGluR2/3 拮抗劑APICA 注射到紋狀體內(nèi)，注射體積為1 μL，每次運動前20 min注射完畢。Control組與PD組在相同時間段內(nèi)注射等體積的生理鹽水，并同樣置于跑臺內(nèi)，但不進行跑臺運動，使其處于自然安靜狀態(tài)。

1.7 紋狀體腦電信號的采集

參數(shù)的設(shè)置：在體多通道可以同時記錄到spike 和LFP，通過對濾波器的設(shè)置可以將spike 和LFP 的信號區(qū)分開。設(shè)置動作電位的帶通為250～5000 Hz，采樣頻率為2000 Hz；設(shè)置spike 的帶通為250 Hz，采樣頻率為2000 Hz。軟件參數(shù)的設(shè)置：設(shè)置Gain 值為2000；設(shè)置閾值線，使信噪比＞1∶3；勾選目標通道的spike、LFP 和原始信號。腦電信號的采集：將大鼠放置在屏蔽箱之內(nèi)，等大鼠處于清醒靜止?fàn)顟B(tài)的時候，開始對大鼠的腦電信號進行記錄，同時用攝像機全程監(jiān)控大鼠的狀態(tài)。所記錄的視頻和腦電信號儲存在電腦的硬盤中，以便離線分析。腦電信號的記錄時長為30 min。

1.8 組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察主要是紋狀體位置的鑒定。腦組織置于4%的多聚甲醛溶液中，4℃環(huán)境固定1 周左右后，轉(zhuǎn)移至30%的蔗糖溶液中脫水直至沉底。包埋，切片，片后20 μm，按照先后順序貼片。接下來將貼有腦組織切片的載玻片置于焦油紫染色液中進行染色。染色時間為5～10 min（因組織切片厚度而異）。蒸餾水洗，70%、95%和100%酒精分別脫水。二甲苯2 次，每次5 min，封片膠封片后，加蓋玻片，進行顯微鏡觀察，鑒定電極植入紋狀體位置（圖1）。剔除電極植入位置偏離的大鼠的數(shù)據(jù)。

圖1 紋狀體電極位點組織切片定位

1.9 紋狀體電活動信號的分析

用Offline Sorter 軟件對所采集到的spike 信號進行分析。設(shè)置濾波器的類型后，調(diào)整閾值線在＞1∶3處，進行分類處理完畢后，剔除干擾信號。將處理后的spike 信號導(dǎo)入NeuroExplorer 軟件，分析神經(jīng)元放電特征的變化，包括放電頻率，時頻、功率譜密度（power spectral density，PSD）等變化的分析。將采集到的LFP信號導(dǎo)入Matlab，對spike 誘發(fā)的 LFP 波形平均（spike-triggered wave-forms average，STWA）進行分析，同時計算spike-LFP的相位鎖定值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8 軟件作圖。統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)± 標準差（±s）表示。采用獨立樣本t檢驗分析Control組與6-OHDA 偏側(cè)損毀模型組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)的組間差異；采用單因素（one-Way）方差分析（ANOVA）對TH-免疫反應(yīng)性結(jié)果及mGluR2/3蛋白表達水平進行多重比較；采用雙因素（two-Way）方差分析（ANOVA）對紋狀體MSNs 平均放電頻率和STWA 結(jié)果進行多重比較，然后使用Tukey事后檢驗進行組間比較。各組電生理數(shù)據(jù)的功率譜密度值采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗，然后使用Nemenyi 事后檢驗進行組間比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 旋轉(zhuǎn)測試和TH-免疫反應(yīng)性結(jié)果

6-OHDA 注射后第7 天進行APO 誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為測試，結(jié)果表明，6-OHDA 偏側(cè)損毀大鼠共40 只，旋轉(zhuǎn)次數(shù)＞100 轉(zhuǎn)/30 min（174.7 ± 6.82 轉(zhuǎn)/30 min）的大鼠共計27 只，成模率67.5%，將未達到模型評價標準的大鼠剔除（圖2 A）。

紋狀體和黑質(zhì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與Control 組相比，PD 與PD+Ex 組損毀側(cè)黑質(zhì)TH 免疫陽性細胞數(shù)量、紋狀體TH 免疫陽性纖維終末含量均顯著降低（P＜0.01）；與PD 組相比，PD+Ex 組黑質(zhì)TH 免疫陽性細胞數(shù)量、紋狀體TH 免疫陽性纖維終末含量無顯著差異（P＞0.05）（圖2B、C、D）。

圖2 旋轉(zhuǎn)測試和TH免疫反應(yīng)陽性結(jié)果

2.2 運動對紋狀體MSNs神經(jīng)元放電頻率的影響

通過對紋狀體多個單位放電和LFP 的持續(xù)記錄，比較各組大鼠紋狀體神經(jīng)元電活動的變化特征。根據(jù)波形、峰峰間隔、主成分聚類和放電模式，從背景噪聲中分離神經(jīng)元。基于半波寬（half-width）、放電頻率和振幅，區(qū)分MSNs 和快放電中間神經(jīng)元（fast-firing interneurons，F(xiàn)SIs）及大膽堿能中間神經(jīng)元（large cholinergic interneurons，LANs）（圖3）。根據(jù)研究的需要，篩選出MSNs的放電信號進行分析。4組大鼠紋狀體共記錄到177 個神經(jīng)元，其中Control 組43 個，PD 組45 個，PD+Ex 組41 個，PD+Ex+APICA 組48 個。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，與Control 組相比，PD 組、PD+Ex 組和PD+Ex+APICA 組紋狀體MSNs 平均放電頻率均顯著升高（P＜0.01）；與PD 組相比，PD+Ex 組紋狀體MSNs 平均放電頻率顯著降低（P＜0.05）；與PD+Ex 組相比，PD+Ex+APICA 組紋狀體MSNs 平均放電頻率顯著升高（P＜0.01）（圖4）。

圖3 清醒狀態(tài)下紋狀體神經(jīng)元單位放電的分離和分類

圖4 各組大鼠紋狀體MSNs平均放電頻率比較

2.3 運動對紋狀體神經(jīng)元LFPs的影響

與Control 組相比，PD 組紋狀體神經(jīng)元LFP 節(jié)律性振蕩在各頻段整體上放電能量明顯增強；與PD 組相比，PD+Ex 組紋狀體神經(jīng)元LFP 節(jié)律性振蕩各頻段在整體上放電能量有一定程度的降低，但仍然高于對照組；與PD+Ex 組相比，PD+Ex+APICA 組紋狀體神經(jīng)元LFP 節(jié)律性振蕩各頻段在整體上放電能量明顯增強，較PD組無顯著改變（圖5）。

圖5 各組大鼠紋狀體神經(jīng)元LFP比較

與Control 組相比，PD 組紋狀體神經(jīng)元 LFPs 在10~30 Hz 的β頻段節(jié)律性振蕩功率出現(xiàn)異常升高（P＜0.01），PD+Ex 組紋狀體神經(jīng)元LFPs 在10~30 Hz的β 頻段節(jié)律性振蕩功率較PD 組顯著降低（P＜0.05），PD+Ex+APICA 組紋狀體神經(jīng)元LFPs 在10~30 Hz 的β頻段節(jié)律性振蕩功率較PD+Ex 組異常升高（P＜0.01）（圖6）。

圖6 各組大鼠紋狀體神經(jīng)元LFPs β頻段功率譜密度比較

2.4 運動對紋狀體神經(jīng)元STWA變化的影響

對spike 誘發(fā)的LFPs波形平均（STWA）進行分析，以評估不同神經(jīng)元自發(fā)spike 與LFP β振蕩之間的相關(guān)程度。當(dāng)unshuffled STWA 在0 ms 處超過原始spike 序列打亂1000 次后的shuffled STWA 的96% 置信區(qū)間時，spike被認為與LFP β振蕩相關(guān)。典型的STWA 相關(guān)與不相關(guān)圖如圖7A、B 所示。與Control 組相比，PD 組spike 與β振蕩之間的STWA 值顯著升高（P＜0.01）；與PD組相比，4周運動干預(yù)后，PD+Ex組spike與β振蕩之間的STWA 值顯著降低（P＜0.05），但與Control組相比，PD+Ex 組spike 與β振蕩之間的STWA 值仍顯著升高（P＜0.05）；與PD+Ex組相比，PD+Ex+APICA 組spike與β振蕩之間的STWA 值顯著升高（P＜0.01），但與PD 組相比，spike 與β振蕩之間的STWA 值無顯著性改變（P＞0.01）（圖7C）。

spike 與β振蕩的相位鎖定結(jié)果表明，Control 組β振蕩相對于spike 的分布離散，分布范圍廣，呈隨機分布，不具有顯著鎖相性；與Control組相比，PD 組β振蕩相對于spike的分布范圍窄，鎖相明顯；與PD組相比，PD+Ex組相位分布相對離散，分布范圍相對較廣，但與Control組相比仍處于較明顯相位鎖定；與PD+Ex 組相比，PD+Ex+APICA 組β振蕩相對于spike的分布范圍窄，鎖相明顯；與PD 組相比，PD+Ex+APICA 組β振蕩相對于spike的分布范圍無改變，鎖相明顯（圖7D）。

圖7 各組大鼠紋狀體神經(jīng)元STWA比較

2.5 運動對紋狀體mGluR2/3蛋白表達水平的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，與Control 組相比，PD組紋狀體mGluR2/3表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與PD組相比，PD+Ex 組紋狀體mGluR2/3 表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖8 A、B）。

圖8 各組大鼠紋狀體mGluR2/3蛋白表達水平比較

3 討論

神經(jīng)元的主要電活動包括spike 和LFP。spike 是神經(jīng)元的信息傳遞基礎(chǔ)。LFP 是由突觸電位等形成的，反映了記錄部位局部區(qū)域神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電活動。LFP 中包含了各種頻率[δ波（0.5～4 Hz）、θ波（4～8 Hz）、α（8～12 Hz）、β（12～30 Hz）、γ（30～80 Hz）等]的節(jié)律波。其中β和γ頻帶的振蕩與運動和認知等高級神經(jīng)信息的整合及處理過程密切相關(guān)。振蕩是指電流周期性的波動或變化，包括同步性振蕩和異步性振蕩。同步性振蕩是指能夠維持同步且穩(wěn)定運行的振蕩，是大腦神經(jīng)元對神經(jīng)信號（信息）進行編碼、整合和處理的重要潛在機制。而異步振蕩是指神經(jīng)元各自獨立活動，失去同步化且不能夠正常運行的振蕩。

對spike 放電活動的分析能夠反映單個神經(jīng)元在不同狀態(tài)下放電頻率以及放電模式的改變；對LFP 的時頻圖以及功率譜密度（PSD）的分析，能夠反映突觸前終端和突觸后神經(jīng)元集群有節(jié)律的同步化活動；對STWA 的計算能夠反映spike-LFP 的同步化程度；對spike-LFP 相鎖值的計算顯示了spike 發(fā)放的相位偏好，同樣反映spike-LFP的同步化程度。

3.1 PD狀態(tài)下紋狀體MSNs異常電活動

紋狀體幾乎完全由抑制性細胞網(wǎng)絡(luò)組成[大鼠的新紋狀體γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能和膽堿能神經(jīng)元分別占到了99.7%和0.3%][9]，正常清醒大鼠紋狀體MSNs 平均放電頻率為1.1 ± 0.18 Hz[10]。Arbuthnott[11]、Schultz[12]和Nienbaum 等[13]研究表明，在正常生理狀況下，紋狀體的大多數(shù)神經(jīng)元顯示出較低的放電頻率（大多數(shù)處于靜息狀態(tài)）。Liang 等[14]研究表明，PD 動物模型紋狀體MSNs 放電活動顯著增加。陳巍等[15]利用玻璃微電極對麻醉狀態(tài)下PD 大鼠模型紋狀體MSNs 電活動進行記錄發(fā)現(xiàn)，PD 大鼠模型紋狀體MSNs 平均放電頻率、爆發(fā)式放電神經(jīng)元的比例顯著增加。

PD 狀態(tài)下基底神經(jīng)節(jié)各核團神經(jīng)元電活動的特征，一是神經(jīng)元放電頻率增加，二是神經(jīng)元放電模式趨于同步化[16]。據(jù)報道，基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路在正常狀態(tài)下基本不會出現(xiàn)β頻段振蕩放電活動或者具有較低的β頻段振蕩放電活動[17]，然而，PD 狀態(tài)下DA 耗竭可使基底神經(jīng)節(jié)表現(xiàn)出強的β頻段振蕩，并使其同步化程度顯著升高[18]。這種異常的同步化形式可能是PD 的一些癥狀在基底神經(jīng)節(jié)網(wǎng)絡(luò)水平活動上的反應(yīng)，阻止正常的網(wǎng)絡(luò)功能[19]。Engel 等[20]研究表明，LFP 的β頻段（10～30 Hz）的振蕩活動被認為與當(dāng)前的運動狀態(tài)的維持有關(guān)，β頻段活動的異常增加很可能導(dǎo)致當(dāng)前機體狀態(tài)的異常維持及靈活性行為和認知控制的惡化。Costa等[21]采用藥物遺傳學(xué)方法對DA 轉(zhuǎn)運體敲除小鼠的研究表明，急性DA 耗竭能夠直接導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元LFP 的β頻段振蕩活動功率增強；Burkhardtl等[22]研究表明，紋狀體同時注射D1 和D2 受體拮抗劑后，紋狀體LFP 的β頻段振蕩活動的功率及spike 與LFP 振蕩的同步化程度顯著增加。Damodaran 等[23]采用計算機模型對內(nèi)在通道和網(wǎng)絡(luò)相互作用在調(diào)節(jié)紋狀體網(wǎng)絡(luò)活動方面的作用進行了研究，結(jié)果表明，在正常生理狀態(tài)下，皮層spike與LFP振蕩的同步性對紋狀體spike與LFP振蕩的同步性增加幾乎沒有影響，但是在DA 耗竭狀態(tài)紋狀體卻顯示出顯著的同步性增強。Chen 等[24]采用多通道在體記錄系統(tǒng)，對6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型紋狀體MSNs的活動模式進行研究表明，清醒狀態(tài)下PD 小鼠模型紋狀體MSNs 放電頻率、爆發(fā)式放電活動顯著增加，LFP的β頻段的同步性震蕩活動顯著增加。Damodaran 等[25]采用紋狀體網(wǎng)絡(luò)模型研究表明，DA 耗竭會導(dǎo)致紋狀體β頻段振蕩的功率顯著增加。這提示PD 狀態(tài)下LFP 的β頻段振蕩功率增強可能是病理性的，PD 運動功能障礙可能是基底神經(jīng)節(jié)輸出結(jié)構(gòu)中的上述病理性振蕩活動引起的。本研究采用多通道在體記錄系統(tǒng)對清醒靜止?fàn)顟B(tài)下PD 模型大鼠紋狀體MSNs電活動進行觀察發(fā)現(xiàn)，DA 耗竭導(dǎo)致紋狀體MSNs LFP 的β頻段（10～30 Hz）的振蕩活動顯著增加，平均放電頻率顯著增加，spike 與LFP 振蕩之間的同步化程度顯著增加，與之前研究[26]的DA 丟失導(dǎo)致偏側(cè)損毀PD 模型大鼠基底神經(jīng)節(jié)內(nèi)選擇性同步和振蕩活動增加的研究結(jié)果一致，并認為PD 患者基底神經(jīng)節(jié)LFP 的β頻段范圍異常同步和振蕩功率增加與運動拮抗有關(guān)。但是，Chang 等[27]研究顯示，PD 狀態(tài)紋狀體神經(jīng)元的總體活動水平降低。造成這些研究結(jié)果不一致的原因可能與實驗在不同的腦狀態(tài)下（麻醉和清醒狀態(tài)）進行以及實驗的物種不同（不同物種間神經(jīng)投射在比例上可能存在差異）等因素有關(guān)。

3.2 運動對PD模型大鼠紋狀體MSNs異常電活動的影響

研究表明，DA 丟失可能導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)各個核團之間及基底神經(jīng)節(jié)-皮層之間異常的振蕩活動和同步性增加[28]。這種形式的振蕩活動和同步化已被證明與運動功能障礙有關(guān)[29]，且這一活動可能會被DA 替代療法和深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）所抑制[30]。Neumann 等[31]研究表明，PD 患者丘腦底核在未服藥過程中β頻段（13～35 Hz）振蕩功率譜出現(xiàn)峰值，而左旋多巴（levodopa，L-DOPA）治療后可顯著抑制該頻段的振蕩活動，并顯著改善患者的運動功能障礙；Trager 等[32]研究表明，長期高頻神經(jīng)元DBS 可使PD 患者丘腦底核（subthalamic nucleus，STN） LFP 的β 頻段（13～30 Hz）振蕩的功率顯著降低，且在長期高頻神經(jīng)元刺激終止后仍可使STN β 頻段振蕩活動減弱。Tseng 等[33]采用在體胞內(nèi)記錄顯示，系統(tǒng)注射DA 受體激動劑可使6-OHDA 損毀所誘導(dǎo)的紋狀體膜電位改變逆轉(zhuǎn)。Suarez 等[34]研究表明，PD 狀態(tài)紋狀體MSNs 較對照組大鼠更興奮，而L-DOPA 治療后興奮性降低至正常值。Wang等[35]研究表明，6-OHDA 誘導(dǎo)的偏側(cè)DA能神經(jīng)元損傷大鼠紋狀體LFP 震蕩活動顯著增加，表現(xiàn)為大鼠在清醒靜止?fàn)顟B(tài)下24～36 Hz 頻段的振蕩功率顯著增加，低劑量L-DOPA 注射使其LFP 功率顯著降低。Damodaran 等[36]研究認為，去同步化快放電中間神經(jīng)元（fast-spiking interneurons，F(xiàn)SIs）活動的藥物可能為PD 紋狀體LFP 的β頻段振蕩活動增加、放電失衡以及運動功能障礙提供一種新的治療策略。

而有關(guān)運動對PD 紋狀體MSNs異常電活動影響的研究報道較少。本實驗室前期利用玻璃微電極對運動干預(yù)后麻醉狀態(tài)下PD 大鼠模型紋狀體MSNs電活動進行記錄發(fā)現(xiàn)，運動干預(yù)可使PD 大鼠模型紋狀體MSNs放電頻率及爆發(fā)式放電神經(jīng)元的比例顯著降低[37]。本研究采用多通道在體記錄系統(tǒng)對運動干預(yù)后清醒靜止?fàn)顟B(tài)下PD 大鼠模型紋狀體MSNs 電活動進行記錄發(fā)現(xiàn)，4周中等強度跑臺訓(xùn)練后，紋狀體MSNs平均放電頻率、LFP 的 β頻段（10～30 Hz）振蕩活動的功率以及spike 與LFP β頻段振蕩之間的同步化程度均顯著降低。本研究結(jié)果表明運動干預(yù)能夠阻止這種異常振蕩活動及其同步化程度。

3.3 mGluR2/3介導(dǎo)了運動對PPDD 模型大鼠紋狀體MSNs異常電活動的影響

研究表明，PD 皮層-紋狀體Glu 能通路過度激活，突觸前Glu大量釋放[38]。Glu與位于基底神經(jīng)節(jié)不同結(jié)構(gòu)中的Glu 能受體及胞內(nèi)主要的分子元件相互作用，導(dǎo)致紋狀體MSNs樹突棘結(jié)構(gòu)的改變可能是PD 病理生理學(xué)和異常電生理學(xué)活動改變的機制之一。因此，阻止Glu 的過度釋放或者抑制Glu 功能效應(yīng)的發(fā)揮可以抑制PD 紋狀體MSNs 異常電活動改變并最終改善PD相關(guān)行為功能障礙。而Glu 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮是通過與其受體的結(jié)合來實現(xiàn)的。

研究表明，離子型谷氨酸受體（ionotropic glutamate receptors，iGluR）拮抗劑，特別是那些作用于N-甲基-d-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs）（介導(dǎo)Glu 興奮性神經(jīng)毒性的主要受體）的iGluR 拮抗劑，在許多臨床前期研究中顯示出了積極的抗PD 作用和治療潛力，但是利用非選擇性iGlu 受體拮抗劑會產(chǎn)生嚴重的副作用（包括精神錯亂、幻覺、學(xué)習(xí)和記憶障礙），限制了其在臨床上的應(yīng)用[39]。近些年來，研究者將目光轉(zhuǎn)向了代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptors，mGluR），并發(fā)現(xiàn)mGluR 可能是治療PD 的主要靶點[40]。mGluR 主要分為3組、8個亞型：Ⅰ組，包括mGluR 1 和5，與磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3）/Ca2+/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路正偶聯(lián)，它們的激活可使胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+，位于突觸后膜上，分布在離子通道型受體如NMDAR 的邊緣，增強由iGluR所介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性；Ⅱ組，包括mGluR 2 和3，定位于皮層-紋狀體突觸前末梢，與腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）負偶聯(lián)，它們的激活會引起AC 信號傳導(dǎo)的降低，導(dǎo)致下游電壓依賴型鈣通道的抑制，mGluR2/3 作為自身受體負調(diào)控皮層-紋狀體突觸前軸突末梢Glu 的釋放，并阻止NMDARs 的進一步激活；Ⅲ組，包括GluR 4/6/7/8，與mGluR2 和3具有相似的屬性，也與AC 負偶聯(lián)，它們的激活會抑制AC 的信號傳導(dǎo)，從而降低環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的生成，改變蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路的活性，還可抑制電壓依賴性鈣通道的活性，位于突觸前膜上，作為自身受體可減少突觸前Glu 的釋放[41]。由于mGluRs 各亞型存在區(qū)域性分布的特征，因此，盡管mGluR 1 和5 拮抗劑也能夠有助于PD 癥狀的改善或者緩解，但是由于mGluR 1和5 在黑質(zhì)致密部（pars compacta of substantia nigra，SNpc）DA 能神經(jīng)元軸突末梢也有分布，因而非選擇性mGluR 1 和5 拮抗劑會阻斷mGluR 1 和5 所介導(dǎo)的SNc DA 能神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)DA的增加，這對PD的治療可能不利。特異性的激動GluR 4/6/7/8雖然對PD癥狀的改善或者緩解也有利，但是，mGlu 7和8由于缺乏高度的選擇性和有效的配體而限制了它們的使用。目前，mGluR 2和3激動劑的治療已經(jīng)被部分應(yīng)用于臨床且效果顯著，成為迄今治療PD 最有應(yīng)用前景的一組mGluRs。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運動干預(yù)可使PD 模型大鼠紋狀體MSNs 平均放電頻率、LFPs 在β頻段（10～30 Hz）振蕩的功率以及spike 與LFP 的β頻段振蕩之間的同步化程度均顯著降低，而GluR 2/3 拮抗劑（APICA）可使PD+Ex 組大鼠紋狀體MSNs 平均放電頻率、LFP 在β頻段（10～30 Hz）振蕩的功率以及spike 與LFP β頻段振蕩之間的同步化程度顯著增加，且較PD 組無顯著差異。這表明運動抑制PD 模型大鼠紋狀體MSNs異常電活動可能與運動通過激活紋狀體GluR 2/3，降低皮層-紋狀體通路突觸前過量的Glu 釋放，進而抑制Glu 與位于基底神經(jīng)節(jié)不同結(jié)構(gòu)中的Glu 能受體及胞內(nèi)主要分子元件的相互作用，最終逆轉(zhuǎn)紋狀體MSNs樹突棘結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，運動干預(yù)可使PD 模型大鼠紋狀體Cav1.3 蛋白表達水平顯著下調(diào)，紋狀體mGluR 2/3 蛋白表達水平顯著上調(diào)，紋狀體不對稱性突觸中穿通型突觸的比例、紋狀體MSNs平均誘發(fā)放電頻率、爆發(fā)式放電神經(jīng)元的比例顯著降低，刺激皮層時紋狀體神經(jīng)元的閾強度顯著增加，放電頻率增加的潛伏期顯著延長[15，42]，本研究結(jié)果與之一致。

4 小結(jié)與展望

本研究結(jié)果顯示，PD 模型大鼠紋狀體MSNs 興奮性顯著增強，LFP β頻段節(jié)律性振蕩的功率顯著增加，spike 與LFP β頻段節(jié)律性振蕩的同步化程度顯著增加；運動干預(yù)可使PD 模型大鼠紋狀體MSNs 興奮性、LFP β頻段節(jié)律性振蕩的功率以及spike與LFP β頻段節(jié)律性振蕩的同步化程度顯著降低；紋狀體微量注射GluR 2/3 拮抗劑可使運動的積極效應(yīng)消失，進一步證實mGluR 2/3 在PD 模型大鼠紋狀體MSNs 運動依賴可塑性中發(fā)揮了重要作用，并將成為PD 治療藥物研發(fā)的新的靶向分子。

經(jīng)典理論認為，DA 可分別通過激活紋狀體傳出神經(jīng)元上的多巴胺D1 受體（dopamine D1 receptor，D1DR）興奮表達多巴胺D1 受體的中等多棘神經(jīng)元（dopamine D1 receptor medium spiny neurons，D1-MSNs）或激活紋狀體傳出神經(jīng)元上的多巴胺D2 受體（dopamine D2 receptor，D2DR）抑制表達多巴胺D2 受體的中等多棘神經(jīng)元（dopamine D2 receptor medium spiny neurons，D2-MSNs），最終達到實現(xiàn)易化運動的效果。而紋狀體DA 耗竭會導(dǎo)致皮質(zhì)活動抑制并最終導(dǎo)致運動功能障礙的產(chǎn)生。在PD 狀態(tài)，紋狀體DA耗竭分別降低和增強了D1-MSNs 和D2-MSNs 興奮性。推測：D2-MSNs神經(jīng)元集群的興奮性增強了PD狀態(tài)紋狀體MSNs β頻段的振蕩活動，運動干預(yù)對紋狀體MSNs 異常電活動的影響是通過抑制D2-MSNs 神經(jīng)元集群的興奮性水平來實現(xiàn)的。本實驗室在接下來的研究中將利用轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合光遺傳手段和膜片鉗技術(shù)對這一假設(shè)進行驗證。