周培華，劉 蘭，鐘文濤，楊 滔，周興旺，袁列江

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室，湖南長沙 410017）

糖蜜是制糖過程中，糖液經(jīng)濃縮析出結(jié)晶糖后殘留的棕褐色黏稠液體。在我國的微生物發(fā)酵工業(yè)尚不成熟前，曾一直被當(dāng)作制糖業(yè)的廢棄物，給環(huán)境造成了較為嚴(yán)重的污染。糖蜜的成分復(fù)雜，其最主要的營養(yǎng)成分是糖，含糖量在40%～80%，多為聚合度不等的多元糖和一定數(shù)量的單糖，此外還含有較豐富的維生素、植物蛋白氨基酸、果膠等[1-2]。

如今，糖蜜的廢物利用已形成較為完善的工業(yè)加工體系，作為一種重要的食品工業(yè)發(fā)酵原料進(jìn)入市場，并被廣泛應(yīng)用于釀酒酵母、面包酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、丁醇、氨基酸多肽、蝦青素和單細(xì)胞蛋白飼料等食品發(fā)酵相關(guān)行業(yè)[3-7]。由于其營養(yǎng)較豐富且價格相對廉價，因此糖蜜作為食品工業(yè)原料常呈現(xiàn)供不應(yīng)求的狀態(tài)。據(jù)統(tǒng)計，2021年國內(nèi)全年糖蜜生產(chǎn)交易量為3863萬t，此外還有進(jìn)口糖蜜1209萬t， 價格從2015年的800元/t左右逐年上升，截止到2021年 9月平均價格為1100元/t[8]。

目前，在糖蜜市場的交易中用以衡量糖蜜品質(zhì)的核心指標(biāo)是其含糖量的多少。由于糖蜜交易極為頻繁，因此要求檢測過程快速、高效。但常規(guī)的含糖量檢測周期太長，且由于糖蜜中的糖分多為混合糖類，聚合單元繁雜，不太適合使用常規(guī)的含糖量檢測方法，因此目前在糖蜜交易過程中依然采用最簡單、粗放的折光儀檢測[9]。折光儀的本質(zhì)是檢測可溶性固形物含量，只適用于成分較為單一的糖液含糖量檢測評判，而糖蜜中的其他多種物質(zhì)對固形物含量都有影響，因此采用折光儀檢測含糖量偏差非常大。一些不規(guī)范的糖廠及中間商在糖蜜中加入非糖類的可溶性固形物，以次充好，極大地擾亂了糖蜜市場，對下游的食品發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域造成較大的經(jīng)濟(jì)損失和工藝負(fù)擔(dān)。此外，食品發(fā)酵企業(yè)為了對發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行工藝設(shè)計和計算，需準(zhǔn)確測量糖蜜的含糖量。目前，在以糖蜜為原料進(jìn)行生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的企業(yè)大都采用生物酶總糖檢測試劑盒，該試劑盒采用進(jìn)口酶制劑將聚合度不同的糖水解為葡萄糖，再用紫外吸光光度法檢測葡萄糖進(jìn)而得到糖蜜的含糖量。該方法檢測成本較高，生產(chǎn)企業(yè)一般無法承受對來源不同、批次不一的糖蜜進(jìn)行頻繁檢測，因此只能進(jìn)行代表性地抽檢，給發(fā)酵工業(yè)和工藝帶來了很多不確定性，給生產(chǎn)和品質(zhì)造成了很大影響。個別實驗室依然采用傳統(tǒng)的硫酸蒽酮法檢測糖蜜含糖量，但是此方法的本質(zhì)是檢測總碳水化合物，在檢測糖蜜這種含有果膠成分的混合物時會出現(xiàn)較大偏差，且使用濃硫酸碳化樣本，全程需要在沸水和冰凍環(huán)境中切換操作，不僅危險而且極為 煩瑣[10]。

針對目前尚沒有一種高效、準(zhǔn)確的糖蜜含糖量檢測方法，本文通過對糖蜜含糖量檢測的分析和研究，采用微生物發(fā)酵和折光儀聯(lián)用的方法檢測糖蜜的含糖量，準(zhǔn)確且高效，以期規(guī)范糖蜜的品質(zhì)衡量指標(biāo)，改變目前糖蜜市場的混亂局面，也為以糖蜜為原料的發(fā)酵生產(chǎn)企業(yè)降低檢測成本提供方法和思路，從而保證相關(guān)工藝優(yōu)化和產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（高糖）（廣西丹寶利酵母有限公司）；嗜滲酵母CICC32788（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；PDA瓊脂培養(yǎng)基、BHI腦心肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖（北京陸橋）；多糖檢測試劑盒（德國拜發(fā)EnzyTECtm）；糖蜜（市購樣品）；VINASE干 粉（市購）。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1/2折光儀（日本ATAGO）；SPS401F電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；MIR-154-PC恒溫培養(yǎng)箱（日本Panasonic）；T9紫外可見光分光光度計（北京普析）；101-3AB干燥箱（天津泰斯特）；5804R臺式高速冷凍離心機(jī)（德國EPPENDORF）；HWS-28水浴鍋（上海一恒）；C-MAGHS7加熱磁力攪拌器（德國IKA）。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取適量葡萄糖，于100 ℃±2 ℃減壓干燥箱內(nèi)烘至恒重。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取烘干后的葡萄糖100.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用純水溶解并稀釋至10 mL，搖勻，制成濃度為10.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃保存。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取10.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、 6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL至10 mL容量瓶并定容至10 mL，濃度依次為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、 4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL和 10.0 mg/mL，臨用新配。

1.3.2 菌株活化菌懸液制作

將釀酒酵母干粉0.0100 g使用無菌水10.0 mL溶解后劃線至PDA平板，挑取較大單菌落接種至BHI肉湯，36 ℃培養(yǎng)24 h，8000 r/min離心5 min去除上清液，加入30%（W/W）滅菌甘油溶液混勻，分裝并凍存。臨用時常溫解凍，8000 r/min離心2 min去除上清液，加入滅菌生理鹽水搖勻備用。

1.3.3 糖蜜前處理

稱取糖蜜原液5 g，加入純水45 mL稀釋搖勻，5000 r/min離心2 min除泥，留取上清液S作為糖蜜待檢樣。

1.3.4 試劑盒檢測糖蜜含糖量

取德國拜發(fā)EnzyTECtm多糖檢測試劑盒，每 5 mL待測樣品加入5 mL酶解液，65 ℃酶解6 h；加入著色試劑0.2 mL，85 ℃著色30 min，于505 nm處檢測吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算糖蜜含糖量。

1.3.5 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測糖蜜含糖量

分別選取市售釀酒酵母干粉和嗜滲酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株，活化后制作成即用型菌懸液；糖蜜10倍稀釋待測液，各取2管等量5 mL分別加入10 mL離心管，分別標(biāo)記為S0和S1，分別加入5 mL菌懸液，其中S0加入菌懸液后立即煮沸滅活，S1加入菌懸液，36 ℃ 培養(yǎng)2 h后，分別離心取上清液，折光儀檢測錘度，分別得到錘度S0、S1，兩者之差可換算得出糖蜜中的含糖量。同時采用德國拜發(fā)含糖量試劑盒檢測糖蜜含量，用以分析比較兩種方法檢測含糖量的準(zhǔn)確度。

1.3.6 對比分析統(tǒng)計計算方法

微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測糖蜜含糖量的計算公式如下：

式中：S0為空白的糖錘度值，Bx；S1為酵母發(fā)酵后的糖錘度值，Bx；V為稀釋倍數(shù)；m為樣品取樣量，g。

多糖檢測試劑盒紫外可見光光度計含糖量的計算公式如下：

式中：axOD為測定曲線斜率；b為測定曲線截距：V為稀釋倍數(shù)；m為取樣量，g。

兩種方法含糖量檢測值偏差的計算公式如下：

1.3.7 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測糖蜜加標(biāo)回收及干擾實驗檢測

（1）葡萄糖加標(biāo)回收。每份糖蜜待測樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入葡萄糖0.5 g、2.0 g，1份作為本底對照實驗組，溶解完全后采用微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測其回收率。

（2）干擾實驗。每份糖蜜待測樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入酵母發(fā)酵廢液干粉（VINASE干粉）0.5 g、2.0 g，1份作為本底對照實驗組，溶解完全后采用微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測含糖量?？疾焯砑臃翘穷惪扇苄怨绦挝飳υ摲椒z測糖蜜含糖量的干擾。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒法檢測葡萄糖標(biāo)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

試劑盒法檢測葡萄糖標(biāo)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 試劑盒法檢測葡萄糖標(biāo)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法與試劑盒檢測糖蜜含糖實驗結(jié)果

通過對12個糖蜜樣品分別采用釀酒酵母發(fā)酵、嗜滲酵母聯(lián)用折光儀和多糖檢測試劑盒法檢測結(jié)果的分析比較，以釀酒酵母作為發(fā)酵菌株實驗組，偏差范圍在-7.70%～2.32%，平均絕對偏差為2.28%。

以嗜滲酵母作為發(fā)酵菌株實驗組，偏差范圍在-1.50%～2.00%，平均絕對偏差為0.46%，嗜滲酵母聯(lián)用折光儀檢測含糖量結(jié)果非常接近多糖檢測試劑盒法的檢測結(jié)果，詳見圖2。

圖2 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法與試劑盒檢測結(jié)果

2.3 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法加標(biāo)回收及抗干擾實驗結(jié)果

2.3.1 葡萄糖加標(biāo)回收實驗結(jié)果

采用嗜滲酵母法作為發(fā)酵菌株，每份糖蜜待測樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入葡萄糖0.5 g、2.0 g，1份作為本底對照實驗組，溶解完全后采用折光儀檢測其回收率，檢測結(jié)果見表1。葡萄糖回收實驗組中，加入量0.5 g實驗組回收率在84.0%～106.0%，平均回收率高達(dá)90.8%；加入量 2.0 g實驗組回收率在94.8%～105.2%，平均回收率高達(dá)100.5%。

表1 葡萄糖加標(biāo)回收實驗結(jié)果

2.3.2 非糖可溶性固形物對新建方法的干擾實驗

采用嗜滲酵母法作為發(fā)酵菌株，每份糖蜜待測樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入酵母發(fā)酵廢液干粉（市售VINASE干粉）0.5 g、2.0 g，1份作為本底對照實驗組，溶解完全后采用折光儀檢測含糖量，考察添加非糖類可溶性固形物對該方法檢測糖蜜含糖量的干擾，結(jié)果見表2。非糖可溶性固形物實驗組中，加入量0.5 g實驗組偏差在-2.4%～1.1%，平均絕對偏差僅為0.4%；加入量2.0 g實驗組偏差在-3.5%～1.7%，平均絕對偏差僅為-1.1%。由實驗數(shù)據(jù)可知，非糖固形物粉狀的加入對于微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測糖蜜的穩(wěn)定性無影響。

表2 非糖可溶性固形物對嗜滲酵母發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測糖蜜含糖量影響的實驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)多糖檢測試劑盒檢測法的核心是使用微生物提取和純化一系列糖苷水解酶，將糖蜜中聚合度復(fù)雜的多聚糖水解成單糖，再利用著色劑顯色，于505 nm處檢測吸光度從而檢測其含糖量。本文研究初期選定酵母系列，正是基于該系列微生物的糖苷酶極為豐富，可水解消耗糖蜜中的多聚合度糖，最終產(chǎn)物是乙醇和二氧化碳，在加熱過程中揮發(fā)，在空白對照折光度扣除消耗組的折光度后即可得到糖蜜中的含糖量。

先以多糖檢測試劑盒檢測結(jié)果為對照值，微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀使用菌株同時考察釀酒酵母和嗜滲酵母，檢測糖蜜含糖量，兩種菌株的檢測結(jié)果均較理想，但嗜滲酵母實驗組偏差范圍更小，平均絕對偏差僅為0.46%，可能是由于嗜滲酵母抗逆性效果更好，在組分較為復(fù)雜的糖蜜樣品中更能穩(wěn)定地發(fā)揮其糖苷酶活性，故最終選定嗜滲酵母CICC32788作為該方法的發(fā)酵菌株。

通過葡萄糖添加實驗考察新建立方法的準(zhǔn)確度，在低糖加標(biāo)實驗中的平均回收高達(dá)90.8%，在高糖加標(biāo)實驗中更是高達(dá)100.5%，充分說明該方法的準(zhǔn)確性較好；通過添加VINASE干粉（市售非糖性可溶性固形物）至糖蜜樣本，采用微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測樣本的含糖量，檢測新建方法的抗干擾能力。結(jié)果顯示，偏差值均小于2.0%，平均絕對偏差均小于0.5%，說明該方法的抗干擾能力較強(qiáng)，能解決目前糖蜜交易市場中普遍存在的不規(guī)范添加固形物的問題，有效杜絕糖蜜交易過程中以次充好的現(xiàn)象。

此外，新建方法的檢測時間大幅縮短，不需要漫長的酶解時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、OD值檢測時間，且只用到折光儀這類簡單儀器。

綜上所述，微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法是一種低成本、低門檻、高效率的糖蜜含糖量檢測方法，具有優(yōu)異的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，可被廣泛應(yīng)用于糖蜜生產(chǎn)、交易、加工行業(yè)。