侯思?jí)?，左景茹，?強(qiáng)，劉 俐，彭海飛，劉曉強(qiáng)*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省富平縣畜牧發(fā)展中心，陜西富平 711700)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)是臨床上分離率最高的革蘭氏陰性菌之一，屬于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，也是一種條件性致病菌，一旦產(chǎn)生致病性，可導(dǎo)致腸道內(nèi)或腸道外感染，甚至引起死亡[1-3]。由于畜牧生產(chǎn)和獸醫(yī)臨床實(shí)踐中抗菌藥物的不規(guī)范使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加[4]。細(xì)菌生物被膜的形成是細(xì)菌耐藥機(jī)制之一[5]。生物被膜是指細(xì)菌在物體表面黏附并增殖，并將自身嵌入在由其所分泌的物質(zhì)形成的胞外聚合物所形成的一種高度水合的開(kāi)放結(jié)構(gòu)[6]。生物被膜具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，其耐藥性和環(huán)境適應(yīng)性大大提升。生物被膜一旦形成，不僅難以去除，膜內(nèi)的細(xì)菌在停藥后仍可繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，增加了治療難度[7]。鉤藤是一種傳統(tǒng)中藥，具有降壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜、抗血栓、抗癌等作用[8]。鉤藤堿具有抗菌活性，對(duì)多種腸道致病菌有抑制作用[9]。但目前有關(guān)鉤藤對(duì)動(dòng)物源病原菌的抗菌作用及其生物被膜的作用鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究以肉雞源耐藥性大腸埃希氏菌為研究對(duì)象，探討鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌的抗菌效果及對(duì)其生物被膜的作用，為抗菌中藥的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 12株受試大腸埃希氏菌(1～12)，2018年5月～9月分離自陜西渭南地區(qū)3個(gè)不同規(guī)模的肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)前期鑒別培養(yǎng)基、革蘭氏染色鏡檢、細(xì)菌微量生化管分離鑒定及16S rRNA方法鑒定，且體外藥敏試驗(yàn)證實(shí)12株受試菌均為對(duì)包含頭孢噻呋在內(nèi)的多種藥物耐藥的多重耐藥菌株。大腸埃希氏菌ATCC 25922，由獸醫(yī)藥理學(xué)研究室保存。

1.1.2 主要藥品及試劑 鉤藤，西藏自治區(qū)拉薩市雪域大藥房產(chǎn)品；酵母粉、胰蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；瓊脂粉，北京索來(lái)寶科技有限公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫(分析純)，廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品；頭孢噻呋，大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 液體加熱器，廣東潮安金石鎮(zhèn)柏源五金制品廠產(chǎn)品；臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海天美天平儀器有限公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；微生物培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 采用水煎法制備。稱取粉碎后的鉤藤20 g，加入10倍量純化水，室溫浸泡過(guò)夜，煎煮1 h，用八層折疊的紗布過(guò)濾，收集濾液。再加入適量純化水，按上述方法煎煮過(guò)濾。重復(fù)3次。將3次的濾液合并，加熱濃縮至50 mL，分裝入10 mL離心管，4 000 r/min離心5 min，取上清液加熱濃縮至10 mL，得到濃度為1 g/mL的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。頭孢噻呋配制為1 280 μg/mL的溶液，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定 參照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的微量稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)，將MIC和高于MIC濃度的各個(gè)梯度的培養(yǎng)物0.1 mL，接種于MH瓊脂培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)18 h后觀察有無(wú)菌落形成，無(wú)菌落形成的相應(yīng)孔中的最低藥物濃度即為鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌的最小殺菌濃度(MBC)。以大腸埃希氏菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3 鉤藤和頭孢噻呋聯(lián)合用藥時(shí)部分抑菌濃度的測(cè)定 取無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用棋盤法，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入100 μL稀釋好的106CFU/mL的大腸埃希氏菌菌懸液。根據(jù)2.2中MIC值的測(cè)定結(jié)果，分別取2×MIC濃度的鉤藤和頭孢噻呋溶液50 μL，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的橫列和縱列中倍比稀釋6～8個(gè)稀釋度，形成不同濃度組合的2種藥物混合液?；靹蚝笾糜?7℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。部分抑菌濃度(Fractional inhibitory concentration,FIC)=聯(lián)合用藥時(shí)甲藥的MIC/單獨(dú)應(yīng)用時(shí)甲藥的MIC+聯(lián)合用藥時(shí)乙藥的MIC/單獨(dú)應(yīng)用時(shí)乙藥的MIC，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5時(shí)表示協(xié)同、>0.5～≤1表示相加、>1～≤2表示無(wú)關(guān)、>2時(shí)表示拮抗作用。

1.2.4 鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌生長(zhǎng)曲線的影響 取若干支試管，每管加10 mL LB液體培養(yǎng)基，每組設(shè)1/4×MIC、1/2×MIC、MIC、2×MIC等4個(gè)鉤藤濃度梯度組和未加藥對(duì)照組(鉤藤濃度為0)，再向每支試管加入對(duì)應(yīng)菌液0.1 mL并混勻。立刻測(cè)定OD600nm值，之后每隔2 h 測(cè)定OD600nm值1次，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)繪制大腸埃希氏菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 大腸埃希氏菌生物被膜形成能力的測(cè)定 大腸埃希氏菌生物被膜的培養(yǎng)和測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]。在無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入200 μL經(jīng)1∶100稀釋的菌液，每菌做6個(gè)復(fù)孔，以無(wú)菌LB培養(yǎng)液為空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液并用滅菌生理鹽水輕柔漂洗3次，洗去雜質(zhì)和浮游菌。然后在每孔加入200 μL甲醇，固定15 min后棄去甲醇，晾干。加入200 μL 1%結(jié)晶紫溶液染色5 min，用生理鹽水洗滌3次。洗去未結(jié)合的染液，晾干。每孔加入200 μL濃度為33%的冰醋酸，30 min后測(cè)定OD570nm值，試驗(yàn)重復(fù)3次。依據(jù)ODc值(ODc等于空白孔的平均OD值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)差)對(duì)生物被膜分類：OD≤ODc，無(wú)成膜能力(-)；ODc

1.2.6 鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌生物被膜的影響 將鉤藤用LB培養(yǎng)液稀釋為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 mg/mL的含藥溶液，分別取上述含藥溶液100 μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再加入菌液100 μL，作為試驗(yàn)組，陽(yáng)性對(duì)照孔只加入菌懸液，陰性對(duì)照孔只加入LB培養(yǎng)基，每個(gè)濃度的藥液作6個(gè)復(fù)孔。將頭孢噻呋用滅菌的純化水稀釋為512、256、128、64、32 、16、8 μg/mL的濃度，其余步驟與鉤藤試驗(yàn)組處理方式相同。37℃培養(yǎng)48 h，再按1.2.5中的方法染色處理，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 21.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，大腸埃希氏菌生物被膜定量分析結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。顯著性檢驗(yàn)采用ANOVA分析，P<0.05時(shí)判定差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌MIC和MBC的測(cè)定

12株臨床分離菌株對(duì)頭孢噻呋均具有耐藥性，其MIC≥8 μg/mL。鉤藤對(duì)所有受試菌的MIC范圍7.8 mg/mL～125 mg/mL，MBC范圍15.6 mg/mL～250 mg/mL(表1)。

2.2 鉤藤和頭孢噻呋聯(lián)合用藥時(shí)FIC的測(cè)定

頭孢噻呋與鉤藤聯(lián)用時(shí)對(duì)受試菌的FIC值介于0.5～2，其中對(duì)4(30.8%)株受試菌的FIC≤0.5，呈現(xiàn)協(xié)同作用，8(61.5%)株受試菌的0.5

2.3 鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌生長(zhǎng)曲線的影響

加入不同濃度鉤藤的受試菌，從生長(zhǎng)曲線可看出藥物處理組對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期OD600nm值均小于未加藥對(duì)照組(鉤藤濃度為0)，且濃度越高，OD600nm值越小。受試菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期起始時(shí)間隨著藥物濃度增大而有所推遲(圖1)。

2.4 大腸埃希氏菌產(chǎn)生物被膜能力的測(cè)定

12株大腸埃希氏菌分離株均能生成生物被膜，其中中等產(chǎn)膜能力的4株(33.3%)，產(chǎn)膜能力較強(qiáng)的菌株有8株(66.7%)(表2)。

表1鉤藤和頭孢噻呋對(duì)大腸埃希氏菌的MIC、MBC和FIC值

圖1不同濃度鉤藤下耐藥性大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)曲線

2.5 鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響

不同濃度的鉤藤對(duì)9株(69.2%，9/13)大腸埃希氏菌生物被膜的形成具有不同程度的抑制作用，對(duì)其余菌株生物被膜的抑制作用不明顯(表3)。頭孢噻呋對(duì)照組對(duì)13株大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響結(jié)果見(jiàn)表4。不同濃度頭孢噻呋均可抑制分離菌株生物被膜的形成，頭孢噻呋幾乎不影響大腸埃希氏菌ATCC 25922生物被膜的形成。

3 討論

大腸埃希氏菌在環(huán)境中廣泛存在，能通過(guò)復(fù)雜的生存機(jī)制避免外部因素的影響[11]。生物被膜是是細(xì)菌為了適應(yīng)周圍環(huán)境所形成的與浮游狀態(tài)相對(duì)應(yīng)的存在方式，90%以上的微生物以生物被膜形式生長(zhǎng)[12]。生物被膜形成后，細(xì)菌耐藥性比浮游菌提高10倍～1 000倍，還會(huì)緩慢向周圍環(huán)境釋放浮游菌引發(fā)慢性感染，從而導(dǎo)致持續(xù)性炎癥和組織損傷[13]。因此，尋找抑制細(xì)菌生物被膜形成的藥物迫在眉睫。

表2 12株大腸埃希氏菌生物被膜形成能力

表3鉤藤對(duì)多重耐藥大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響

表4頭孢噻呋對(duì)多重耐藥大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響

鉤藤為茜草科鉤藤屬常綠藤本植物，其主要成分包括生物堿、黃酮類、萜類、酯類等，其中鉤藤堿是鉤藤中含量較多，也是重要的活性成分[14]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鉤藤的研究多涉及其活性成分研究、抗炎及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，缺乏對(duì)細(xì)菌生物被膜的研究。鉤藤對(duì)布魯氏菌、大腸埃希氏菌具有良好的抑菌活性[15-16]。本試驗(yàn)受試分離菌株表現(xiàn)為多重耐藥性，而在本研究的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，鉤藤對(duì)臨床分離的耐藥大腸埃希氏菌具有良好的抗菌活性，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度的依賴性。亞抑菌濃度的鉤藤即可抑制耐藥細(xì)菌的生長(zhǎng)。MIC濃度的鉤藤幾乎可以完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，與已有研究結(jié)論一致[16]。雖然MIC濃度比抗生素大，但使用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性。本鉤藤不僅單用時(shí)對(duì)多重耐藥大腸埃希氏菌具有抗菌活性，與頭孢噻呋聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)30.8%的受試菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用，對(duì)61.5%的受試菌株表現(xiàn)為相加作用。

許多中藥對(duì)細(xì)菌生物被膜的形成有抑制作用[17-19]?？股睾椭兴幝?lián)合應(yīng)用可以有效對(duì)抗細(xì)菌的生物被膜，并可減少抗生素用量和毒性，延緩耐藥性的產(chǎn)生[20]。本試驗(yàn)中的12株受試分離菌株均具有中等強(qiáng)度產(chǎn)膜能力，其中強(qiáng)成膜能力菌株8株，在鉤藤對(duì)大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響試驗(yàn)中，鉤藤對(duì)于69.2%的受試大腸埃希氏菌生物被膜的形成具有抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性。鉤藤對(duì)于強(qiáng)成膜能力的大腸埃希氏菌的生物被膜具有較好的抑制作用，個(gè)別受試菌株的OD570nm值的變化會(huì)隨藥物濃度的提高而出現(xiàn)升高現(xiàn)象，其原因可能是鉤藤所含成分復(fù)雜，如生物堿類、黃酮類、萜類、酯類及多糖等，其中鉤藤堿具有抑菌作用，而其豐富的植物多糖則可能被細(xì)菌利用，進(jìn)而影響其對(duì)生物被膜的抑制作用。

鉤藤對(duì)肉雞源大腸埃希氏菌臨床分離株有一定程度的抗菌活性，且能抑制大腸埃希氏菌生物被膜的形成，與頭孢噻呋聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，具有不同程度的協(xié)同抗菌作用，為解決畜禽養(yǎng)殖業(yè)大腸埃希氏菌的耐藥性提供科學(xué)依據(jù)。