劉麗莎， 賈巧靜， 王建星， 張艷茹， 馬利娜， 張海中

(1.河北省石家莊市第六醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 河北 石家莊 050000 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 河北 石家莊 050000)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)好發(fā)于40歲以上男性，原發(fā)灶多位置隱蔽、早期癥狀不明顯[1]，其發(fā)現(xiàn)時多為中晚期。盡管放療、化療、免疫治療及其聯(lián)合治療等治療方法取得了進(jìn)展，但HNSCC的預(yù)后不容樂觀，生存時間并沒有得到很大的改善[2]。因此，探索HNSCC預(yù)后的潛在機(jī)制，尋找導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后的相關(guān)生物標(biāo)志物是當(dāng)務(wù)之急。母體細(xì)胞外囊泡-外泌體(Exosomes，Exos)的雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)可有效保護(hù)內(nèi)部核酸、蛋白質(zhì)等生物信息分子不被外界降解，也是細(xì)胞將遺傳信號傳遞給周圍細(xì)胞的重要方式。而Exos能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信息傳遞，已成為多種疾病的新的潛在診斷分子[3]。遺傳信息分子miRNAs在HNSCC診斷、預(yù)后中更具有代表性、準(zhǔn)確性[4]。miRNAs中的miR-96-5p為新型致癌因子，可通過靶向上調(diào)TP53突變基因，促進(jìn)HNSCC細(xì)胞侵襲、遷移、增殖等惡性生物學(xué)產(chǎn)生，而成為診斷HNSCC的潛在特異性分子[5]。有研究指出HNSCC患者血清miR-96-5p表達(dá)水平較高且與HNSCC患者不良預(yù)后有關(guān)[6]，但Exos中miR-96-5p在HNSCC生物學(xué)行為過程中起到的作用尚無研究。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族(Forkhead box transcription factor O subfamily，F(xiàn)oxO)是重要的癌癥抑制因子[7]。本研究采用基因預(yù)測軟件，其中FoxO1與miR-96-5p之間有結(jié)合位點(diǎn)，這預(yù)示Exos中miR-96-5p參與調(diào)控HNSCC生物學(xué)行為作用，很可能與靶向調(diào)控miR-96-5p有關(guān)。本研究建立動物及細(xì)胞模型對此進(jìn)行驗(yàn)證，以期探究Exos參與HNSCC發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，也為HNSCC靶向治療藥物的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料裸鼠，清潔級，36只，購自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號：吉林大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動物中心)，批號：SYXK(吉)2021-0006，試驗(yàn)符合3R原則，經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意：IACUC-01(2021210361)。PKH67試劑盒(貨號：LM-441112-1，上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；HNSCC細(xì)胞系-AGZY-973(貨號：CE18963，北京科瑞思搏生物科技有限公司)；miR-96-5p抑制物(miR-96-5p inhibitor)及其陰性對照(inhibitor-NC)、FoxO1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-FoxO1)；CCK-8試劑盒均由上海生工公司設(shè)計提供；FoxO1、促凋亡蛋白Bax、死亡調(diào)解子(Bim)、凋亡蛋白p21均購自美國abcam公司。

1.2方 法

1.2.1HNSCC患者及健康人群血清標(biāo)本納入、采集:選取2020年9月至2022年1月在我院耳鼻咽喉頭頸外科進(jìn)行手術(shù)治療的原發(fā)HNSCC患者25例作為HNSCC患者組，其中男性15例，女性10例，年齡30～50歲，中位年齡40歲；TNM分期顯示腫瘤分期Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期3例，Ⅳ期17例；納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理類型為鱗癌；②不伴有除頭部、頸部以外的其他部位惡性腫瘤；③近三個月內(nèi)未接受放化療治療。同期選取體檢健康者40例，作為健康對照組，兩組受試者年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵照赫爾辛基宣言及“涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法(試行)”，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會討論后批準(zhǔn)，所有納入實(shí)驗(yàn)對象均簽署知情同意書。受試者均抽取外周靜脈血5mL，室溫靜置30min后，于4℃、1000×g條件下離心10min取上層血清1mL置于1.5mL EP管中，并在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血清Exos制備、分離、鑒定:參考文獻(xiàn)中的方法[8]，取1mL受試者血清，加入9mL磷酸緩沖溶液(PBS)稀釋、混勻后在4℃、2000×g條件下離心30min，取上清液，在4℃、12000×g條件下離心45min，取上清液，在4℃、110000×g條件下離心120min，棄去上清液，取沉淀物加入9mL的PBS重懸，用0.22μm濾器過濾后，取濾液在4℃、110000×g條件下離心70min，棄去上清液，得到的沉淀物加入500μL PBS重懸后即為Exos懸液。取20μL Exos懸液，加入等體積PBS稀釋后，滴加到100目載樣銅網(wǎng)上，37℃靜置1min，晾干后，用20μL的3%磷鎢酸鈉溶液滴到銅網(wǎng)上染色1min后，濾紙輕輕吸去多余液體，將銅網(wǎng)在透射電鏡下觀察拍照，以鑒定Exos形態(tài)。分別從健康對照者組和HNSCC患者Exos懸濁液樣本中隨機(jī)分選用于外泌體濃度直徑檢測(NTA)，觀察外泌體樣本總體特征差異。取20μL Exos懸液，加入10μL蛋白裂解液裂解30min，13423r/min、4℃離心15min，收集上清液，二喹啉甲酸法檢測樣本蛋白總濃度后上樣，SDS-PAGE電泳及聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)膜后，加入1∶1000的CD9、CD63、白蛋白、鈣連蛋白抗體孵育10h，HRP二抗孵育30min，化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光后，Image-J軟件計算蛋白條帶相對灰度值，以鑒定Exos特異性表面分子表達(dá)。

1.2.3血清Exos的標(biāo)記與攝取:取50μL血清Exos懸液，用PKH67染液(按染液說明書進(jìn)行，胞膜標(biāo)記Diluent C稀釋液250μL，DYE染液1.5μL)染色10min以標(biāo)記Exos，MW3000純化液純化Exos，DMEM完全培養(yǎng)基重懸稀釋后，加入到HNSCC細(xì)胞系-AGZY-973細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，培養(yǎng)24h后，取AGZY-973細(xì)胞，4%多聚甲醛固定40min，曲拉通破膜，DAPI染核后，激光共聚焦顯微鏡觀察Exos攝取情況。

1.2.4RT-PCR法檢測Exos懸液中miR-96-5p的水平:取50μL Exos懸液，用RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，按qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性40min、95℃變性80s、65℃退火80s、72℃延伸30min，40個循環(huán))。miR-96-5p以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miR-96-5p表達(dá)水平。miR-96-5p引物序列(F：5’-TTTCTTGTCGGTATTGA-3’，R：5’-ATTCAGAACGCAGTG-3’)由大連寶生生物公司合成。

1.2.5血清Exos對AGZY-973細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響:取AGZY-973細(xì)胞，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、計數(shù)后，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，設(shè)置為：Control組、HNSCC患者血清Exos組、健康對照者血清Exos組，每組設(shè)置6個復(fù)孔；Control組加入DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，HNSCC患者血清Exos組在Control組基礎(chǔ)上加入50μL的HNSCC患者血清Exos懸液進(jìn)行培養(yǎng)；健康對照者血清Exos組在Control組基礎(chǔ)上加入50μL的健康對照者血清Exos懸液進(jìn)行培養(yǎng)。各組細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48及72h后，取細(xì)胞，向細(xì)胞中加入10μL的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2h，450nm紫外分光光度儀上檢測吸光度(OD)值，并繪制生長曲線，以檢測細(xì)胞增殖。取培養(yǎng)72h后的細(xì)胞，行AnnexinV-EGFP/PI染色后，流式上機(jī)檢測計算細(xì)胞凋亡率。取處理培養(yǎng)72h后的細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基饑餓12h后并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，小室下室加入400μL培養(yǎng)液，24h后取出下室，棉簽擦去室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定、結(jié)晶紫染色后，置于光鏡下觀察及拍照，隨機(jī)取5個視野，計數(shù)細(xì)胞數(shù)目，即為遷移數(shù)目，Transwell小室內(nèi)表面鋪100μL 0.25μg/μL的基質(zhì)膠(Matrige)，其余同上述步驟，檢測侵襲數(shù)目。取處理培養(yǎng)72h后的各組細(xì)胞，粉碎、勻漿液后，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50μg樣品行電泳、電轉(zhuǎn)膜操作，滴加1∶900的兔抗人FoxO1、Bax、Bim、p21一抗抗體，及1∶1000的β-actin內(nèi)參抗體，4℃避光孵育24h，滴加羊抗兔1∶1900的HRP二抗孵育70min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Image-J軟件計算蛋白條帶相對灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告試驗(yàn)驗(yàn)證miR-96-5p與FoxO1的靶向關(guān)系:通過starbase網(wǎng)站預(yù)測miR-96-5p與FoxO1存在互補(bǔ)配對的堿基序列。建立含有miR-96-5p結(jié)合位點(diǎn)的FoxO1-3'UTR野生型(WT)和突變型(MUT)片段，并分別克隆至熒光素酶報告質(zhì)粒中，以合成FoxO1-3'UTR-WT及FoxO1-3'UTR-MUT，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染mimic NC或miR-96-5p mimic，共轉(zhuǎn)染48h后，用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.7裸鼠荷瘤試驗(yàn)驗(yàn)證血清Exos對AGZY-973細(xì)胞生長及FoxO1調(diào)控的影響:取100μL的HNSCC患者血清Exos，重懸后，BCA法測Exos蛋白濃度，將400pmoL Cy3標(biāo)記的miR-96-5p抑制物(miR-96-5p inhibitor)及其陰性對照(inhibitor-NC)、FoxO1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-FoxO1)及其陰性對照(pcDNA-NC)，分別與40μg蛋白在無菌PBS中混合，加入氯化鈣溶液(0.1moL/L)，用PBS調(diào)整體積至400μL，4℃冰上放置5min，120000×g速度離心70min，提取Exos，得到Exos-miR-96-5p inhibitor及Exos-inhibitor-NC、Exos-pcDNA-FoxO1及Exos-pcDNA-NC外泌體，并分別與AGZY-973細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，取細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20min，曲拉通透化10min，5μL的鬼筆環(huán)肽(Alexa Fluor 488)孵育20min標(biāo)記細(xì)胞骨架，DAPI核染，于共聚焦顯微鏡下觀察拍照，以判定Exos對miR-96-5p、FoxO1信號的傳遞作用。取純種裸鼠，設(shè)置為：Control組、Exos組、Exos-miR-96-5p inhibitor組、Exos-inhibitor-NC組、Exos-pcDNA FoxO1組、Exos-pcDNA NC組，每組6只；Control組AGZY-973細(xì)胞加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；Exos組向AGZY-973細(xì)胞培養(yǎng)基中加入50μL的HNSCC患者血清Exos懸液；Exos-miR-96-5p inhibitor組及Exos-inhibitor-NC組向AGZY-973細(xì)胞中加入Exos-miR-96-5p inhibitor及Exos-inhibitor-NC懸液50μL；Exos-pcDNA FoxO1組、Exos-pcDNA NC組分別向AGZY-973細(xì)胞中加入50μL的Exos-pcDNA-FoxO1及Exos-pcDNA-NC培養(yǎng)48h。各組調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個/mL，取0.5mL接種于裸鼠頭頸部(口底部位)，14d后裸鼠口底部位可觸及瘤塊，視為接種成功，28d后，處死裸鼠，剝離瘤體，用游標(biāo)卡尺測瘤體體積(瘤體體積=長徑×短徑2/2)。

2 結(jié) 果

2.1血清Exos鑒定結(jié)果:透射電鏡顯示血清Exos有完整膜，形態(tài)呈杯口狀，直徑為30～120nm，內(nèi)有低電子密度小顆粒，見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，HNSCC患者血清Exos及健康對照者血清Exos中CD9及CD63高表達(dá)，白蛋白低表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的鈣連蛋白不表達(dá)，提示具有膜結(jié)構(gòu)的Exos并非來源于細(xì)胞碎片，證實(shí)Exos提取成功，見圖1B。NTA結(jié)果顯示各組Exos懸液粒度分布曲線重合度較高，各組exosomes樣本表觀均一性無明顯差異，見圖1C。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，PKH67綠色熒光標(biāo)記的Exos可被HNSCC細(xì)胞系(AGZY-973)攝取，見圖1D。RT-PCR結(jié)果顯示，與健康對照者血清Exos組相比，HNSCC患者血清Exos組中miR-96-5p表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 血清Exos鑒定結(jié)果圖

表1 血清Exos中miR-96-5p表達(dá)變化

2.2血清Exos對AGZY-973細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響:與Control組相比，HNSCC患者血清Exos組AGZY-973細(xì)胞在24h～72h后增殖加快，且在72h時增殖率差異最明顯，細(xì)胞凋亡率降低，遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；健康對照者血清Exos組上述指標(biāo)變化與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2～4、表2。

圖2 細(xì)胞增殖曲線圖

表2 各組細(xì)胞凋亡率遷移及侵襲數(shù)目表達(dá)比較

2.3血清Exos對AGZY-973細(xì)胞FoxO1、Bax、Bim、p21蛋白及miR-96-5p表達(dá)的影響:與Control組相比，HNSCC患者血清Exos組細(xì)胞中FoxO1及Bax、Bim、p21蛋白表達(dá)均降低，miR-96-5p表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；健康對照上述指標(biāo)變化與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、表3。

表3 各組細(xì)胞FoxO1及Bax Bim p21蛋白及miR-96-5p表達(dá)比較

圖3 流式細(xì)胞凋亡圖

圖4 細(xì)胞遷移、侵襲圖(×100)

圖5 FoxO1及Bax、Bim、p21蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.4miR-96-5p對FoxO1靶向調(diào)控的影響:Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)FoxO1與miR-96-5p之間有靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報告試驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic和無突變的FoxO1-WT載體，可使293T細(xì)胞中熒光素酶活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而共轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic和發(fā)生突變的FoxO1-MUT載體對熒光素酶活性無顯著作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 雙熒光素酶驗(yàn)證圖

2.5血清Exos對FoxO1的調(diào)控作用研究:免疫熒光雙染結(jié)果顯示，與Exos-inhibitor NC相比，Exos-miR-96-5p inhibitor與AGZY-973細(xì)胞共培養(yǎng)后CY-3紅色熒光表達(dá)增高，提示Exos中miR-96-5p inhibitor可被傳遞至AGZY-973細(xì)胞，見圖7。裸鼠荷瘤試驗(yàn)顯示，與Control組相比，Exos組瘤體體積、瘤體重量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Exos組相比，Exos-miR-96-5p inhibitor組及Exos-pcDNA FoxO1組瘤體體積、瘤體重量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明抑制Exos中miR-96-5p表達(dá)或上調(diào)Exos中FoxO1表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)Exos發(fā)揮的促瘤體增長作用，見表4、圖8。

圖7 免疫熒光雙染圖(×1000)

圖8 裸鼠移植瘤直觀比較

表4 各組裸鼠瘤體體積瘤體重量比較

3 討 論

HNSCC局部復(fù)發(fā)率高，發(fā)病率約占全身腫瘤的1%～5%，是當(dāng)今最普遍發(fā)生的腫瘤之一[9]。迄今為止，臨床上仍缺乏診斷局部復(fù)發(fā)和治療效果的生物標(biāo)志物，這是導(dǎo)致HNSCC五年生存率不高的原因[10]。miRNA被認(rèn)為是癌癥篩查、診斷和預(yù)后最具特異性的生物標(biāo)志物。文獻(xiàn)報導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，致癌基因miR-96-5p可在HNSCC癌組織中高表達(dá)，并能通過攜帶突變基因TP53及P53蛋白而促進(jìn)HNSCC細(xì)胞遷移、產(chǎn)生放化療抗性，在HNSCC診斷及預(yù)后過程中有潛在價值[5]。但HNSCC位置隱蔽，組織活檢也極為不便，HNSCC組織中miR-96-5p診斷限制性較大。

腫瘤自身可釋放Exos進(jìn)入體循環(huán)，鄰近組織或細(xì)胞可通過內(nèi)吞方式攝取Exos，來完成Exos中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA等信號分子的傳遞，且Exos的雙層脂質(zhì)包圍結(jié)構(gòu)，也使得母本遺傳信息miRNAs分子如miR-96-5p、miR-363-3p、miR-17-5p、miR-21等極難被機(jī)體降解，而使診斷穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性較高[11]。血清Exos中miR-96-5p也因其穩(wěn)定性、無創(chuàng)性，已被用作酒精性脂肪肝疾病的診斷[12]。王寧等[13]發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清Exos向胃癌細(xì)胞傳遞miR-223，而導(dǎo)致胃癌增殖、侵襲、遷移等惡性生物生物學(xué)行為進(jìn)一步加重。本研究在HNSCC患者血清中提取到雙層膜結(jié)構(gòu)、直徑約為100nm的Exos，通過基因測序發(fā)現(xiàn)Exos中高表達(dá)miR-96-5p，HNSCC細(xì)胞系-AGZY-973內(nèi)吞血清Exos后其細(xì)胞中miR-96-5p表達(dá)進(jìn)一步升高，細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力也較Control組及健康對照者血清Exos組進(jìn)一步增強(qiáng)，另外，HNSCC患者血清Exos轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的miR-96-5p低表達(dá)質(zhì)粒，與HNSCC細(xì)胞共培養(yǎng)后，可見熒光標(biāo)記的miR-96-5p低表達(dá)質(zhì)粒被Exos包裹并傳遞至HNSCC細(xì)胞，HNSCC細(xì)胞瘤體體積增長也最緩慢，提示HNSCC患者血清Exos可能向HNSCC細(xì)胞傳遞遺傳miR-96-5p信息，而促進(jìn)HNSCC惡性生物學(xué)發(fā)展。

FoxO1在正常組織中表達(dá)量維持在一定水平起到“監(jiān)管”細(xì)胞周期的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1在食管癌、胃癌、肝癌等多種癌組織中低表達(dá)，且已被公認(rèn)為重要的抑癌因子[14]。Zhao等[15]發(fā)現(xiàn)上調(diào)FoxO1表達(dá)可將口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞周期阻滯在G1期而抑制其增殖，并影響促凋亡蛋白Bax、死亡調(diào)解子(Bim)、凋亡蛋白p21表達(dá)，而促進(jìn)其凋亡、抑制其擴(kuò)散。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p與FoxO1之間有靶向調(diào)控作用，HNSCC患者血清Exos促進(jìn)HNSCC細(xì)胞高表達(dá)miR-96-5p、加劇惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生的同時，也降低FoxO1及Bax、Bim、p21等促凋亡因子表達(dá)而抑制凋亡，提示HNSCC患者血清Exos傳遞miR-96-5p，促進(jìn)HNSCC增殖、遷移及侵襲作用，可能與靶向下調(diào)抑癌基因FoxO1有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測，本研究用裸鼠荷瘤試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，HNSCC患者血清Exos轉(zhuǎn)染FoxO1高表達(dá)質(zhì)粒，可明顯減弱其發(fā)揮的促瘤體體積生長作用。

綜上所述，HNSCC患者血清Exos傳遞出的miR-96-5p下調(diào)FoxO1水平，導(dǎo)致HNSCC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、生長等惡性生物學(xué)行為的發(fā)展。研究結(jié)果對HNSCC無創(chuàng)診斷及新型治療策略提供一定借鑒作用。但HNSCC外泌體遺傳信息背景復(fù)雜，miR-96-5p是否與其他調(diào)節(jié)性的非編碼RNA(Lnc、Circ等)發(fā)生交互作用需要更深入的研究。