李 鵬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院， 北京 100050)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是一種侵襲、轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的惡性腫瘤[1]。該病在診斷、治療方面取得了一定進(jìn)展，但是由于晚期治療預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高的問(wèn)題，患者的存活時(shí)間仍令人不滿意。臨床上仍缺乏有效的精準(zhǔn)高效治療藥物。恩替諾特是一種基于氨基苯甲酰胺的組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑[2,3]，其在乳腺癌中的抗增殖、促凋亡作用得到體內(nèi)外研究的證實(shí)[4]。恩替諾特在OSCC中的抗癌功效得到初步發(fā)展[5]，但是其發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍需繼續(xù)探索。微小RNA(miRNA)是一種保守的內(nèi)源單鏈18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子，可影響靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，進(jìn)而參與人類疾病的發(fā)展過(guò)程[6]。miR-103a-3p在多種癌癥中失調(diào)，參與癌癥的惡化或治療進(jìn)展，其中包括OSCC[7,8]。但是其是否與恩替諾特的抗OSCC有關(guān)仍未可知。機(jī)械敏感離子通道蛋白(Mechanosensitive ion channel protein，PIEZO1)能夠通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮致癌作用[9]。本研究擬以O(shè)SCC細(xì)胞WSU-HN6為研究對(duì)象，觀察恩替諾特、miR-103a-3p、PIEZO1對(duì)WSU-HN6細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，揭示恩替諾特的抗癌作用與miR-103a-3p、PIEZO1之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1材料:恩替諾特(批號(hào)：209783-80-2；純度≥99%)來(lái)自南京恩德薩生物科技有限公司；口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞WSU-HN6(CVCL_5516)來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心；胎牛血清來(lái)自杭州仟諾生物公司；DMEM培養(yǎng)液來(lái)自浙江GENOM；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑來(lái)自美國(guó)Invitrogen；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒來(lái)自日本TAKARA；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)來(lái)自日本同仁；Transwell小室來(lái)自美國(guó)Corning；兔抗E-cadherin、N-cadherin、PIEZO1多抗、HRP標(biāo)記的二抗均來(lái)自上海艾博抗；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒來(lái)自上海碧云天研究所。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):WSU-HN6細(xì)胞使用10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的飽和濕度空氣的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:細(xì)胞培養(yǎng)液將恩替諾特調(diào)至0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmoL/L，與WSU-HN6細(xì)胞分別共培養(yǎng)24、48、72h。篩選2.0μmoL/L處理48h的WSU-HN6細(xì)胞為最適細(xì)胞。3-5倍質(zhì)量的脂質(zhì)體試劑將antagomiRNA、antagomiR-103a-3p、pcDNA、pcDNA-PIEZO1、2.0μmoL/L+antagomiRNA、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1轉(zhuǎn)染W(wǎng)SU-HN6細(xì)胞，設(shè)為antagomiRNA組、antagomiR-103a-3p組、pcDNA組、pcDNA-PIEZO1組、2.0μmoL/L+antagomiRNA組、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p組、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC組、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1組，轉(zhuǎn)染8h后，更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48h，用RT-qPCR或WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的效果。

1.2.3CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖:收集各組培養(yǎng)48h的細(xì)胞，按照CCK8試劑盒要求處理細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度。1000個(gè)細(xì)胞/孔接種96孔板，每孔10μL的CCK8反應(yīng)液，微微震蕩，混勻，避光孵育25min。490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(OD490)。細(xì)胞增殖率(%)=(OD490實(shí)驗(yàn)組-OD490對(duì)照組)/OD490對(duì)照組×100%。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲:收集各組培養(yǎng)48h的細(xì)胞，更換為無(wú)任何營(yíng)養(yǎng)因子、血清的培養(yǎng)基，饑餓處理24h，待用。準(zhǔn)備含有基質(zhì)膠的小室和不含基質(zhì)膠的小室，37℃預(yù)熱。用基質(zhì)膠模擬人體的細(xì)胞外基質(zhì)，檢測(cè)細(xì)胞破壞基質(zhì)發(fā)生侵襲的能力。用不含基質(zhì)膠的小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將細(xì)胞調(diào)至0.5×104個(gè)/mL，取200μL鋪勻在上室，取600μL含有營(yíng)養(yǎng)因子和血清的培養(yǎng)基置下室，37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)12h。小心取出小室，上室下膜朝上，浸入4%對(duì)聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)，拍照。采用五點(diǎn)法計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.5WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、PIEZO1蛋白:收集各組培養(yǎng)48h的細(xì)胞，裂解液充分裂解，提取總蛋白并定量，變性。用變性后的上清做蛋白電泳上樣模板，行SDS-PAGE電泳。結(jié)束后，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。2.5%脫脂奶粉封閉液37℃封閉2h。逐滴加入一抗(兔抗E-cadherin多抗，1∶1000；兔抗N-cadherin多抗，1∶1500；兔抗PIEZO1多抗，1∶1000)，約10mL，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗膜，再滴加二抗(HRP標(biāo)記的二抗，1∶500)，浸沒(méi)膜，37℃孵育1.5h。ECL發(fā)光液顯影，曝光。用Image J分析蛋白條帶的灰度值，目的灰度值/內(nèi)參灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞miR-103a-3p、PIEZO1:收集各組培養(yǎng)48h的細(xì)胞，用RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取總RNA并合成cDNA，-20℃保存。打開RT-qPCR試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求操作，檢測(cè)樣本中miR-103a-3p、PIEZO1的表達(dá)情況。U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算。所用引物：miR-103a-3p，正向引物5′-GCGAGCAGCATTGTACAGG-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；PIEZO1正向引物5′-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3′，反向引物5′-GGGCACAATATGCAG GCAGA-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGT CCGAGGTATTC-3′;GAPDH正向引物5′-GACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，反向引物5′-AG GAGTGGGTG TCGCTGT-3′。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-103a-3p與PIEZO1的結(jié)合力:靶基因在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、targetscan(https://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-103a-3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)PIEZO1為其下游靶點(diǎn)之一。根據(jù)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)序列合成PIEZO1 3′UTR-WT片段(含有互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)的野生序列)和PIEZO1 3′UTR-MUT片段(不含有互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)的突變序列)，并插入熒光載體，構(gòu)建銀光報(bào)告基因。將構(gòu)建的熒光基因與agomiRNA、agomiR-103a-3p、antagomiRNA、antagomiR-103a-3p共轉(zhuǎn)染至WSU-HN6?；謴?fù)室溫的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，按照操作手冊(cè)要求操作，檢測(cè)細(xì)胞的熒光活性。用細(xì)胞的相對(duì)熒光活性強(qiáng)度表示miR-103a-3p與PIEZO1的結(jié)合能力的強(qiáng)弱。

2 結(jié) 果

2.1恩替諾特對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響:結(jié)果如圖1所示，24、48、72h的2.0、4.0μmoL/L恩替諾特處理WSU-HN6細(xì)胞的增殖率顯著低于1.0μmoL/L恩替諾特處理的WSU-HN6細(xì)胞，多因素重復(fù)測(cè)量方差分析呈時(shí)間濃度依賴性(F總=19.45，F(xiàn)時(shí)間=180.100，F(xiàn)處理=69.530，P<0.05)。2.0μmoL/L濃度處理的WSU-HN6細(xì)胞的增殖率的降低幅度最大，故選用該濃度用于后續(xù)研究。

圖1 不同濃度恩替諾特處理的WSU-HN6細(xì)胞的增殖率

2.2恩替諾特對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移侵襲的影響:結(jié)果如圖2和表1所示，與0.0μmoL/L組相比，2.0μmoL/L組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量均顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

表1 恩替諾特處理的WSU-HN6的細(xì)胞遷移侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)

2.3恩替諾特調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞miR-103a-3p、PIEZO1表達(dá):結(jié)果如圖3和表2所示，與0.0μmoL/L組相比，2.0μmoL/L組細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)顯著升高，PIEZO1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

表2 恩替諾特處理的WSU-HN6細(xì)胞miR-103a-3p PIEZO1的表達(dá)

圖3 IEZO1蛋白表達(dá)

2.4抑制miR-103a-3p調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲:結(jié)果如圖4和表3所示，與antagomiRNA組相比，antagomiR-103a-3p組細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量均顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖4 E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

表3 抑制miR-103a-3p的WSU-HN6細(xì)胞增殖遷移侵襲情況

2.5過(guò)表達(dá)PIEZO1調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲:結(jié)果如圖5和表4所示，與pcDNA組相比，pcDNA-PIEZO1組細(xì)胞PIEZO1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量均顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表4 過(guò)表達(dá)PIEZO1的WSU-HN6細(xì)胞增殖遷移侵襲情況

圖5 PIEZO1、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)

2.6miR-103a-3p靶向PIEZO1:Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、targetscan(https://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)到miR-103a-3p與PIEZO1之間的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，如圖6A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-103a-3p可抑制野生型PIEZO1細(xì)胞的熒光活性，而對(duì)其它細(xì)胞的熒光活性無(wú)顯著影響，如圖6B。與agomiRNA組相比，agomiR-103a-3p組細(xì)胞PIEZO1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，與antagomiRNA組相比，antagomiR-103a-3p組細(xì)胞PIEZO1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，如圖6C、D、E。

圖6 miR-103a-3p靶向調(diào)控PIEZO1

2.7敲減PIEZO1逆轉(zhuǎn)抑制miR-103a-3p、恩替諾特對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響:結(jié)果如圖7和表5所示，與2.0μmoL/L+antagomiRNA組相比，2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p組細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量均顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC組相比，2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1組細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量均顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

表5 抑制PIEZO1和miR-103a-3p的WSU-HN6細(xì)胞增殖遷移侵襲情況

圖7 E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)

3 討 論

恩替諾特能夠逆轉(zhuǎn)食管鱗癌的順鉑耐藥、調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的功能[10]，但是其在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的表型調(diào)控中的作用仍為十分清楚。Marques及其團(tuán)隊(duì)[11]的最新研究報(bào)道，恩替諾特可抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期阻滯G0/G1期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，活性氧大量增加，組蛋白H3和組蛋白H4乙?；黾?，揭示恩替諾特的抗癌價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，恩替諾特能夠以濃度依賴性抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，并抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，抑制N-cadherin表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次確定了恩替諾特對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞表型的惡化抑制作用。令人遺憾的是，恩替諾特在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制尚未十分清楚。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，恩替諾特明顯的上調(diào)癌細(xì)胞中miR-103a-3p的水平，且抑制PIEZO1的表達(dá)，也許miR-103a-3p、PIEZO1與恩替諾特的抗癌作用存在一定的聯(lián)系。

有研究報(bào)道，miR-103a-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，抑制miR-103a-3p后，口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖得到控制，凋亡能力得到增強(qiáng)，并且還抑制異種移植裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)[12]。Liu等[13]在舌鱗狀細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-103a-2-5p與LncRNA LTSCCAT直接存在直接靶向關(guān)系，參與上調(diào)的LTSCCAT的促進(jìn)癌細(xì)胞遷移侵襲作用，這暗示miR-103a-2-5p參與舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移侵襲作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中被恩替諾特的上調(diào)，并且抑制miR-103a-3p能夠明顯的增強(qiáng)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且還明顯的削弱了恩替諾特對(duì)癌細(xì)胞的增殖遷移侵襲抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了miR-103a-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌基因的功能，這與Liu[13]在舌鱗癌中的研究結(jié)果相吻合，支持miR-103a-3p的抑癌功能。與Zhang[12]在口腔鱗癌中的研究結(jié)果相悖，認(rèn)為miR-103a-3p可能不具有致癌的潛力。miRNA在癌癥中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，相關(guān)的上下游作用機(jī)制相互交叉，同一個(gè)miRNA在癌癥的不同通路中的功能是不同的。本研究在體外細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-103a-3p的抑癌作用，后續(xù)將在至少3株癌細(xì)胞及裸鼠體內(nèi)為此結(jié)果提供更有說(shuō)服力的理論支持。深入研究還發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p可靶向負(fù)調(diào)控PIEZO1的表達(dá)，于是推測(cè)PIEZO1可能與miR-103a-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的功能有關(guān)。

PIEZO1是一種保守的多功能蛋白，在惡性腫瘤中作為致癌基因發(fā)揮著重要作用，在人類癌癥的診斷、預(yù)后中具有巨大潛在價(jià)值。Hasegawa等[14]發(fā)現(xiàn)，PIEZO1以YES相關(guān)蛋白(YAP)信號(hào)通路的靶點(diǎn)，有利于口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，上調(diào)在癌組織中的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，PIEZO1的表達(dá)水平能夠被恩替諾特抑制，并且過(guò)表達(dá)PIEZO1促進(jìn)了口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制E-cadherin，促進(jìn)N-cadherin，這驗(yàn)證了PIEZO1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的致癌作用，與Hasegawa的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示，PIEZO1作為miR-103a-3p下游靶標(biāo)之一，確實(shí)可能參與miR-103a-3p的抗癌作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲減PIEZO1能夠增強(qiáng)恩替諾特的藥效，減弱下調(diào)miR-103a-3p對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的促進(jìn)作用。

綜上所述，恩替諾特抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與miR-103a-3p/PIEZO1通路有關(guān)，為恩替諾特用于口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療提供實(shí)驗(yàn)支持。