韋 麗， 張建軍， 吳 鋒， 劉宋芳， 楊世峰

(1.陜西省寶雞市人民醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病科， 陜西 寶雞 721000 2.陜西省西安市第九醫(yī)院內(nèi)分泌科， 陜西 西安 710000 3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科， 陜西 西安 710000)

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，女性約占發(fā)病人數(shù)的75%，近年來(lái)，該病發(fā)病率逐年增加，死亡率趨于穩(wěn)定。中國(guó)為甲狀腺癌高發(fā)地區(qū)，每年甲狀腺癌新增及死亡病例約占全球15%，嚴(yán)重威脅我國(guó)居民生命安全[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，中藥有效成分可抑制甲狀腺癌的疾病進(jìn)展，且治療途徑廣泛、對(duì)患者副作用小[2]。柚皮苷是天然類黃酮化合物，能夠保護(hù)心血管、抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化，且其在食管癌小鼠中具有良好的抗腫瘤活性。研究顯示，柚皮苷可促進(jìn)化療敏感性，柚皮苷聯(lián)合紫杉醇治療能夠增強(qiáng)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的毒性，抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，提示柚皮苷單獨(dú)或聯(lián)合紫杉醇可用于治療前列腺癌[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中營(yíng)養(yǎng)、鈣、氧及能力狀態(tài)被破壞稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[4]，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶/真核生物起始因子2α/活化轉(zhuǎn)錄因子4/CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(protein kinase R-like ER kinase/Eukaryotic translation initiation factor alpha 2/activating transcription factor 4/CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP)軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起重要作用，可通過(guò)上調(diào)CHOP、Bcl-2和其他細(xì)胞凋亡相關(guān)因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。本研究于2019年12月至2021年8月利用柚皮苷處理甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞，探討其通過(guò)PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器：人甲狀腺癌細(xì)胞株B-CPAP由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，柚皮苷(批號(hào)：110722-201815，純度≥98%，規(guī)格：20mg)購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司，胎牛血清(貨號(hào)：12664025)購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)：abs920)購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司，MTT試劑(貨號(hào)：M8180)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：A9210)購(gòu)自德國(guó)默克公司，p-PERK單克隆抗體(貨號(hào)：AP328)、p-eIF2α單克隆抗體(貨號(hào)：AF5803)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PERK單克隆抗體(貨號(hào)：ab229912)、eIF2α單克隆抗體(貨號(hào)：ab169528)、ATF4單克隆抗體(貨號(hào)：ab184909)、CHOP單克隆抗體(貨號(hào)：ab11419)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)單克隆抗體(貨號(hào)ab32503)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)單克隆抗體(貨號(hào)ab32124)、細(xì)胞波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(貨號(hào)ab92547)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(貨號(hào)ab231303)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體(貨號(hào)ab76011)、GAPDH單克隆抗體(貨號(hào)：ab8245)均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。酶標(biāo)儀(型號(hào)：Multiskan FC)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，流式細(xì)胞儀(型號(hào)：CytoFLEX)購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：BPH-9042)購(gòu)自蘇州貝銳儀器科技有限公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組：取出凍存的B-CPAP細(xì)胞，融化后置于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，37℃、5% CO2條件下孵育。于B-CPAP細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入不同濃度的柚皮苷(1、5、10、20μmoL/L)處理，并以不加柚皮苷的B-CPAP細(xì)胞為對(duì)照組，另采用PERK抑制劑GSK2606414(5μmoL/L)+20μmoL/L柚皮苷處理B-CPAP細(xì)胞作為抑制劑組。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：將B-CPAP細(xì)胞接種至96孔板(20000個(gè)/孔)中，收集不同濃度(1、5、10、20μmoL/L)柚皮苷處理48h的B-CPAP細(xì)胞，及20μmoL/L柚皮苷處理12、24、48h的B-CPAP細(xì)胞，PBS沖洗后，向每孔加入MTT 100μL，37℃孵育，并向每孔加入二甲基砜150μL，低速震蕩10min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞570nm處吸光值。B-CPAP細(xì)胞增殖率=柚皮苷處理組細(xì)胞吸光值/對(duì)照組細(xì)胞吸光值。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各濃度B-CPAP細(xì)胞凋亡率。B-CPAP細(xì)胞經(jīng)不同濃度柚皮苷處理48h后，經(jīng)PBS洗滌，加入500μL結(jié)合緩沖液重懸，并加入FITC標(biāo)記的Annexin V 5μL和PI 5μL，孵育30min(室溫、避光)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞凋亡率。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔板中培養(yǎng)各組B-CPAP細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/孔，在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h(37℃、5% CO2)，使用100μL槍頭垂直劃出兩條直線，測(cè)定此時(shí)劃痕面積(0h時(shí)劃痕面積)，藥物作用48h后拍照，倒置顯微鏡觀察各組B-CPAP細(xì)胞遷移情況，并測(cè)量48h劃痕面積。劃痕愈合率(%)=(0h劃痕面積-48h后劃痕面積)/0h劃痕面積×100%。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)：B-CPAP細(xì)胞經(jīng)不同濃度柚皮苷處理48h后，使用Transwell試劑盒觀察各組B-CPAP細(xì)胞侵襲能力。采用胰酶消化細(xì)胞，PBS清洗1-2次，無(wú)BSA培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，向Transwell小室(Matrigel基質(zhì)膠預(yù)先包被)上下室分別加入150μL細(xì)胞懸液、含BSA培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，乙醇固定5min，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察各組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.6Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集不同濃度柚皮苷處理48h后的B-CPAP細(xì)胞，使用RIPA裂解液充分裂解，收集細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取50mg蛋白在12%的SDS-PAGE中分離，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，加入稀釋(1∶1000)后的對(duì)應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，加入稀釋(1∶2000)后的二抗孵育2h，ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖的影響：與對(duì)照組相比，經(jīng)1、5、10、20μmoL/L柚皮苷處理48h后，B-CPAP細(xì)胞增殖率依次下降，呈濃度依賴性(P<0.05)，20μmoL/L柚皮苷的下降效果最明顯；與20μmoL/L相比，抑制劑組B-CPAP細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)；20μmoL/L柚皮苷處理12h、24h、48h，B-CPAP細(xì)胞增殖率依次下降，呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細(xì)胞增殖情況

表2 20μmoL/L柚皮苷處理不同時(shí)間后B-CPAP細(xì)胞增殖情況

2.2柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞凋亡的影響：1、5、10、20μmoL/L柚皮苷處理的B-CPAP細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.05)，隨柚皮苷濃度的遞增，B-CPAP細(xì)胞凋亡率增加，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細(xì)胞凋亡率低于20μmoL/L組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

表3 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細(xì)胞凋亡情況

圖1 柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞凋亡的影響

2.3柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞遷移的影響：B-CPAP細(xì)胞劃痕愈合率隨柚皮苷濃度的遞增而減少，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細(xì)胞劃痕愈合率高于20μmoL/L組(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞遷移的影響(×200)

表4 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細(xì)胞遷移情況

2.4柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞侵襲的影響：B-CPAP穿膜細(xì)胞數(shù)隨柚皮苷濃度的遞增而減少，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP穿膜細(xì)胞數(shù)高于20μmoL/L組(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表5。

表5 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細(xì)胞侵襲情況

圖3 柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×400)

2.5柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響：隨著柚皮苷濃度增加，B-CPAP細(xì)胞E-cadherin、Bax蛋白水平逐漸升高，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平逐漸降低，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細(xì)胞E-cadherin、Bax蛋白水平均低于20μmoL/L組，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平均高于20μmoL/L組(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表6。

表6 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細(xì)胞Vimentin E-cadherin N-cadherin Bax Bcl-2蛋白水平變化

圖4 柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.6柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸的影響：隨著柚皮苷濃度增加，B-CPAP細(xì)胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平逐漸升高，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細(xì)胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平均低于20μmoL/L組(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表7。

表7 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細(xì)胞p-PERK/PERK p-eIF2α/eIF2α ATF4 CHOP蛋白水平變化

圖5 柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸的影響

3 討 論

近年來(lái)，全球范圍內(nèi)甲狀腺癌的發(fā)病率有所增加，甲狀腺癌主要包括三種組織學(xué)類型：分化型(乳頭狀和濾泡狀)、未分化型(間變性)和甲狀腺髓樣癌，其中分化型甲狀腺癌約占90%以上[6]。大多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌患者長(zhǎng)期預(yù)后良好，但復(fù)發(fā)率(約25-35%)較高，因此臨床需對(duì)復(fù)發(fā)性病變和轉(zhuǎn)移進(jìn)行積極治療[7]。

天然植物提取物具有良好的抗腫瘤特性，且不良反應(yīng)少。柚皮苷是從西柚、葡萄柚等果肉、果皮中提取的天然黃酮類物質(zhì)，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死，并呈劑量依賴性[8]。研究顯示，柚皮苷以劑量依賴性方式抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)并下調(diào)Bcl-2蛋白水平，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，還可抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，可能成為治療結(jié)直腸癌的有效藥物[9]。此外，Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷在體外可以顯著抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的增殖和遷移，還可以濃度、時(shí)間依賴性的方式抑制順鉑耐藥的人卵巢癌株SKOV3/CDDP的增殖，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能與NF-κB、E-cadherin通路有關(guān)。本研究亦顯示，隨柚皮苷濃度的遞增，B-CPAP細(xì)胞增殖率依次下降，細(xì)胞凋亡率增加，B-CPAP細(xì)胞劃痕愈合率、穿膜細(xì)胞數(shù)減少，E-cadherin、Bax蛋白水平逐漸升高，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平逐漸降低，均呈濃度依賴性；20μmoL/L柚皮苷處理12h、24h、48h，B-CPAP細(xì)胞增殖率依次下降，呈時(shí)間依賴性，提示柚皮苷可抑制B-CPAP細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，并具有濃度和時(shí)間依賴性，且能夠降低B-CPAP細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的細(xì)胞器，其功能受損可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的早期階段，為保護(hù)正常的細(xì)胞功能，主要的反應(yīng)是阻止未折疊蛋白的合成或促進(jìn)正確的蛋白折疊；當(dāng)適應(yīng)性反應(yīng)不能克服應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的凋亡途徑就會(huì)被激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活UPR保護(hù)細(xì)胞免受損害，而UPR與細(xì)胞暴露于不利條件(例如輻射)的持續(xù)時(shí)間有關(guān)，時(shí)間不同可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，如細(xì)胞適應(yīng)壓力或凋亡[11]。適當(dāng)?shù)腢PR旨在降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量和蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞適應(yīng)壓力，然而，在適應(yīng)性反應(yīng)不足的情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并激活CHOP、JNK、Bcl-2的表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器PERK表達(dá)，從而誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄，即上調(diào)PERK/ATF4/CHOP通路并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。激活的PERK會(huì)引發(fā)UPR相關(guān)的促凋亡信號(hào)，提高磷酸化eIF2α水平，通過(guò)ATF4激活適應(yīng)性信號(hào)通路，抑制全局蛋白質(zhì)合成和選擇性翻譯；而ATF4表達(dá)增加可提高CHOP表達(dá)水平，CHOP過(guò)表達(dá)可下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax水平，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，CHOP還可通過(guò)另一種促凋亡機(jī)制發(fā)揮作用，通過(guò)直接激活生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白GADD34，促進(jìn)eIF2α的去磷酸化并重新啟動(dòng)受壓力細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷模型中，活性氧(ROS)過(guò)量從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，附子靈可通過(guò)PERK/eIF2α/ATF4/Chop通路抑制ROS觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，防止心肌細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，隨著柚皮苷濃度增加，B-CPAP細(xì)胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平逐漸升高，呈濃度依賴性；添加PERK抑制劑可降低B-CPAP細(xì)胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)，抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP途徑，從而逆轉(zhuǎn)柚皮苷對(duì)B-CPAP細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲抑制及凋亡促進(jìn)作用，與Albayrak等[13]研究相似，提示柚皮苷可能通過(guò)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP凋亡途徑，從而影響甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲過(guò)程。

綜上所述，柚皮苷能可能通過(guò)激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸抑制B-CPAP細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，降低B-CPAP細(xì)胞遷移、侵襲能力。