魏雅楠， 劉曉慧， 馬遠(yuǎn)新

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 河北 滄州 061000)

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(Recurrent oral ulcer，ROU)是常見(jiàn)的口腔疾病，其發(fā)病率高，多見(jiàn)于女性[1]。臨床上，該病的主要癥狀是唇、舌、軟腭等黏膜部位反復(fù)出現(xiàn)潰瘍，表現(xiàn)為圓形或者橢圓形，通常伴有局部的紅腫和灼痛[2]。目前，該病的誘因以及發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。ROU的臨床治療通常是采用西藥進(jìn)行消炎、止痛并促進(jìn)潰瘍部位愈合，但效果并不顯著，而傳統(tǒng)的中草藥對(duì)ROU有較好的治療作用[3]。黃芩苷主要取自黃芩的干燥根部，是一種黃酮類生物活性物質(zhì)，具有抗炎、殺菌、鎮(zhèn)痛之療效[4]。既往研究[5]表明甘草瀉心湯對(duì)ROU的治療效果明顯，且復(fù)發(fā)率低。黃芩苷是甘草瀉心湯的主要成分之一，因此本研究推測(cè)單獨(dú)黃芩苷治療可能對(duì)ROU有同樣的作用。相關(guān)文獻(xiàn)[6]顯示黃芩苷通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-33/腫瘤發(fā)生抑制蛋白2(Interleukin-33/suppression of tumorigenicity 2，IL-33/ST2)信號(hào)通路影響炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而改善過(guò)敏性鼻炎。但黃芩苷能否通過(guò)調(diào)控該通路影響ROU進(jìn)展未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)黃芩苷干預(yù)觀察其對(duì)ROU模型大鼠的療效及其與IL-33/ST2信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡健康雄性清潔級(jí)Sprague Dawley大鼠，體重200～220g，均購(gòu)于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心有限公司，SYXK(京)2021-0045為其動(dòng)物許可證號(hào)。所有大鼠自由進(jìn)食、喝水，均飼養(yǎng)在恒溫恒濕、12h光照、12h黑暗的環(huán)境下。

1.2藥物、試劑與儀器:弗氏完全佐劑(CFA)購(gòu)自江蘇科惟生物技術(shù)有限公司；黃芩苷(純度≥98%)購(gòu)自成都儀睿生物科技有限公司；左旋咪唑(純度≥99%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京同生時(shí)代生物技術(shù)有限公司；干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17、IL-2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自江蘇生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物研究所；IL-33、ST2、核因子kB(Nuclear factor-kB，NF-kB)單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。組織勻漿機(jī)購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；垂直電泳儀購(gòu)自常州德杜精密儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥方法:按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分成正常組，模型組，低、中、高劑量黃芩苷組和左旋咪唑組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均按照Xie L等[7]的方法進(jìn)行ROU造模：大鼠麻醉后在口腔黏膜下注入生理鹽水，剝離黏膜并制備成組織勻漿，將其與CFA按照1∶1比例混合均勻。造模前1d將各組大鼠的兩側(cè)脊柱進(jìn)行脫毛，造模時(shí)將0.2mL的抗原乳化液皮下注射至脊柱左右區(qū)域，每周一次，持續(xù)8周，正常組僅注射CFA。模型構(gòu)建成功后，低、中、高劑量黃芩苷組大鼠分別灌胃25、50、100mg/kg黃芩苷，左旋咪唑組大鼠灌胃17.5mg/kg左旋咪唑[8]，正常組和模型組大鼠每天灌胃等量的生理鹽水，每天1次，持續(xù)20d。

1.4大鼠潰瘍癥狀的觀察和記錄:給藥結(jié)束后，肉眼觀察并記錄各組大鼠口腔潰瘍癥狀，包括潰瘍數(shù)目、持續(xù)時(shí)間、間隔時(shí)間。

1.5大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量的測(cè)定:取100μL EDTA抗凝處理后的大鼠外周血，將其放入流式管底部，分別加入20μL APC-CD3、PE-CD4、FITC-CD8抗體，混合均勻，20min后在加入2mL溶血素，繼續(xù)混勻，靜置10min，離心、棄去上清液，并用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.6大鼠血清細(xì)胞因子水平的測(cè)定:各組大鼠給藥結(jié)束后，將其麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血10mL，放在不含抗凝劑的試管中，靜置30min后，離心，取上清液，一部分依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒方法檢測(cè)IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α水平。

1.7大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物含量的測(cè)定:取1.6中剩余血清，檢測(cè)其GSH、SOD、MDA含量，具體操作方法嚴(yán)格根據(jù)對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8大鼠口腔黏膜組織中IL-33/ST2信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白水平的檢測(cè):將各組大鼠安樂(lè)死后，取其口腔黏膜組織，將其研磨成勻漿，提取總蛋白，定量后上SDS-PAGE凝膠電泳儀分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后加入IL-33、ST2、NF-kB一抗，次日加入二抗，孵育結(jié)束后進(jìn)行顯影，并以β-actin為內(nèi)參，分析不同蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1黃芩苷對(duì)ROU大鼠潰瘍狀況的影響:與正常組相比，模型組大鼠潰瘍數(shù)目增多，持續(xù)時(shí)間顯著增加，間隔時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量黃芩苷組大鼠潰瘍數(shù)目和持續(xù)時(shí)間明顯減少，間隔時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，表現(xiàn)為劑量依賴性，而左旋咪唑組與高劑量黃芩苷組間大鼠潰瘍數(shù)目、持續(xù)時(shí)間和間隔時(shí)間無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷對(duì)ROU大鼠潰瘍狀況的影響

2.2黃芩苷對(duì)ROU大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量的影響:與正常組比較，模型組CD4+含量及CD4+/CD8+降低，CD8+含量升高(P<0.05)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，低、中、高劑量黃芩苷組CD4+含量及CD4+/CD8+顯著增加，CD8+含量顯著減少(P<0.05)，而低劑量黃芩苷組CD8+變化較小，沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；與高劑量黃芩苷組相比，左旋咪唑組上述指標(biāo)均無(wú)明顯改變(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 黃芩苷對(duì)ROU大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量的影響

2.3黃芩苷對(duì)ROU大鼠血清細(xì)胞因子的影響:模型組大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量明顯多于正常組(P<0.05)；低、中、高劑量黃芩苷組大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量依次低于模型組(P<0.05)，而左旋咪唑組IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量與高劑量黃芩苷組的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 黃芩苷對(duì)ROU大鼠血清細(xì)胞因子的影響

2.4黃芩苷對(duì)ROU大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響:與正常組相比，模型組GSH、SOD含量明顯下降，MDA含量明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量黃芩苷組GSH、SOD含量顯著增加，MDA含量顯著減少(P<0.05)，呈劑量依賴性；而與高劑量黃芩苷組相比，左旋咪唑組GSH、SOD升高不顯著、MDA下降不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 黃芩苷對(duì)ROU大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響

2.5黃芩苷對(duì)ROU大鼠口腔黏膜組織中IL-33/ST2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:與正常組相比，模型組大鼠口腔黏膜組織中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量黃芩苷組大鼠口腔黏膜組織中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，且低劑量黃芩苷組>中劑量黃芩苷組>高劑量黃芩苷組；而左旋咪唑組與高劑量黃芩苷組IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表5。

表5 黃芩苷對(duì)ROU大鼠口腔黏膜組織中IL-33/ST2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖1 各組大鼠口腔黏膜組織中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達(dá)水平

3 討 論

食物、心情、激素、口腔的局部創(chuàng)傷及菌群失調(diào)均能誘發(fā)ROU。該病一旦發(fā)作就疼痛難忍，且容易反復(fù)，不僅影響飲食，還妨礙語(yǔ)言、情緒，對(duì)人們的生活、工作產(chǎn)生非常不利的影響。中醫(yī)學(xué)將ROU歸類到“口瘡”范疇，認(rèn)為ROU的病癥雖在口腔中，但其發(fā)生發(fā)展與人們的五臟六腑聯(lián)系密切。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，中草藥在ROU的治療方面有著不可替代的作用[3]。黃芩苷是從中藥黃芩根中提取的生物活性物質(zhì)，其功能多樣，例如抗癌[9]、抗炎[4]等。以往研究[5]發(fā)現(xiàn)甘草瀉心湯可減輕ROU患者口腔炎癥反應(yīng)，有助于其黏膜的修復(fù)，在預(yù)防病情反復(fù)發(fā)生效果顯著。黃芩苷作為甘草瀉心湯的主要成分之一，可能對(duì)ROU有類似的治療效果。因此，本研究通過(guò)建立ROU大鼠模型，觀察黃芩苷對(duì)ROU的治療效果并探討其作用機(jī)制。

相關(guān)研究[7]表明ROU的發(fā)生與自身免疫失調(diào)有關(guān)，CD4+和CD8+是T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群，二者作用相反，互相制衡和調(diào)節(jié)，是檢測(cè)機(jī)體免疫反應(yīng)水平的重要指標(biāo)，CD4+/CD8+比值的降低可使口腔黏膜發(fā)生局部潰瘍。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠潰瘍數(shù)目和持續(xù)時(shí)間明顯增加，間隔時(shí)間明顯延長(zhǎng)，CD4+含量及CD4+/CD8+降低，CD8+含量升高，與曲宸等[10]和Xie L等[7]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明ROU大鼠模型構(gòu)建成功，也進(jìn)一步揭示ROU的發(fā)生與細(xì)胞免疫有關(guān)。經(jīng)黃芩苷治療后，ROU大鼠的潰瘍病癥明顯改善，CD4+含量及CD4+/CD8+顯著增加，揭示黃芩苷通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群失衡對(duì)ROU大鼠有明顯的治療作用。

血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子的異常表達(dá)是導(dǎo)致ROU發(fā)生的主要因素之一，IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其水平與潰瘍病情的嚴(yán)重程度呈正比[11]。IL-17是一種促炎因子，由活化的T細(xì)胞分泌而來(lái)，能夠刺激上皮細(xì)胞炎癥因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體炎癥的發(fā)生[12]。TNF-α的增多會(huì)誘導(dǎo)IL-2等炎癥因子的產(chǎn)生，致使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，從而加重潰瘍程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可下調(diào)炎癥因子水平，說(shuō)明黃芩苷可通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群失衡影響炎癥因子的水平，進(jìn)而改善ROU大鼠的炎癥反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)的加劇導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生，進(jìn)而使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。而抗氧化能力的下降也是ROU發(fā)生的原因之一，GSH、SOD和MDA是檢測(cè)機(jī)體氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物。有文獻(xiàn)[14]顯示，在口腔潰瘍發(fā)生時(shí)，GSH、SOD含量升高，MDA含量下降。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷可通過(guò)提高GSH、SOD含量、降低MDA含量降低ROU大鼠的氧化損傷，進(jìn)而對(duì)ROU起治療作用。

上述研究均表明黃芩苷通過(guò)降低炎癥反應(yīng)和氧化損傷對(duì)ROU產(chǎn)生治療作用，但是其具體機(jī)制還不清楚。IL-33通過(guò)與ST2和輔助受體IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)組成的異二聚體受體結(jié)合，進(jìn)而在靶細(xì)胞上發(fā)揮作用。有文獻(xiàn)[15]顯示茯苓多糖通過(guò)抑制IL-33、ST2蛋白表達(dá)減輕潰瘍性結(jié)腸炎的浸潤(rùn)程度。也有研究[6]表明在過(guò)敏性鼻炎模型大鼠中，IL-33、ST2、NF-kB mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。與上述研究一致，ROU大鼠口腔黏膜組織IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達(dá)顯著提高，而黃芩苷處理后上述蛋白水平均明顯下調(diào)，表明黃芩苷可能通過(guò)抑制IL-33/ST2通路調(diào)節(jié)炎癥因子及氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平改善炎癥和氧化損傷，進(jìn)而對(duì)ROU模型大鼠發(fā)揮治療作用。

綜上所述，黃芩苷對(duì)ROU模型大鼠具有明顯的治療作用，其機(jī)制可能是抑制IL-33/ST2通路的激活，降低炎癥反應(yīng)、氧化損傷以及調(diào)控T淋巴細(xì)胞亞群，進(jìn)而加快口腔黏膜的修復(fù)，為ROU的臨床治療提供新的靶向藥物，但是其遠(yuǎn)期療效還需進(jìn)一步研究。