王淼東， 陳澤山， 彭佩純， 鄧 鑫

廣西中醫(yī)藥大學(xué) a.研究生院， b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 南寧 530000

在眾多癌癥相關(guān)死亡原因中肝癌位列前三，也是唯一每年發(fā)病率遞增的惡性腫瘤[1]。肝癌在國(guó)內(nèi)所有癌癥中的5年生存率僅為10.1%[2]。肝癌的危險(xiǎn)因素很多，包括肝炎病毒、酗酒、吸煙、肥胖、肝硬化、長(zhǎng)期接觸黃曲霉毒素等[3]。由于肝癌的預(yù)后差，早期診斷困難，中晚期患者大多依賴手術(shù)與放化療的綜合治療模式。肝癌患者往往需要長(zhǎng)期應(yīng)用阿霉素、順鉑等一線化療藥物，隨之而來(lái)的耐藥性及藥物毒性使得肝癌治療的有效性受到極大的限制。近年來(lái)，隨著納米醫(yī)學(xué)在癌癥領(lǐng)域的不斷應(yīng)用和拓展，納米技術(shù)可以對(duì)癌癥的診斷及治療產(chǎn)生十分積極的影響?；诖税l(fā)展起來(lái)的納米載藥系統(tǒng)具備低毒、生物利用度廣、控釋藥物、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)，可以協(xié)助傳輸藥物通過(guò)生物屏障，增強(qiáng)傳輸藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和特異性[4]，從而在肝癌治療中發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力[5]。因此，本文重點(diǎn)介紹納米載藥系統(tǒng)在肝癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 納米載藥系統(tǒng)的肝癌靶向釋放策略

納米載藥系統(tǒng)是以納米顆粒(nanoparticles，NP)為基礎(chǔ)的藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery system，DDS)，而NP通常以5～200 nm的尺寸適用于各種藥物的傳輸，因NP具備獨(dú)特的理化性質(zhì)，絕大多數(shù)的NP進(jìn)入人體后主要在肝臟積累[6]，從而被廣泛應(yīng)用于肝癌治療。納米載藥系統(tǒng)不僅可以將疏水藥物溶解在疏水腔中以此改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，還可以延長(zhǎng)藥物的血漿半衰期和生物分布特征[7]。另外，化療藥因缺乏對(duì)癌組織的特異性以及靶向性，給藥時(shí)導(dǎo)致正常組織、細(xì)胞遭到損害從而產(chǎn)生明顯的副作用，而納米載藥系統(tǒng)可以在兩種機(jī)制下克服這些弊端。

1.1 被動(dòng)靶向 納米載藥系統(tǒng)在癌癥治療中作用的發(fā)揮與本身的理化性質(zhì)有關(guān)。某些載藥系統(tǒng)在腫瘤組織中的積累要遠(yuǎn)多于健康組織，即“被動(dòng)靶向”。它們必須在足夠短的半衰期內(nèi)進(jìn)入腫瘤組織，避免被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(mononuclear phygocyte system，MPS)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system，RES)識(shí)別，以此增強(qiáng)通透性和滯留性(EPR)效應(yīng)[8]。但這種效應(yīng)是腫瘤的異常生理病理特征，要求納米載體尺寸不能超過(guò)400 nm，當(dāng)小于200 nm時(shí)EPR效應(yīng)更為有效[9]。血管的不規(guī)則和淋巴引流的減少都會(huì)引起NP從血液循環(huán)中滲出到腫瘤組織，而沒(méi)有進(jìn)入到健康組織中，這就阻礙了NP的清除，導(dǎo)致NP在腫瘤中積累[10]。為了達(dá)到增強(qiáng)腫瘤部位的被動(dòng)靶向作用，通常采用改變NP的尺寸或者形狀的方式，然而，被動(dòng)靶向給藥的效率很低，當(dāng)前在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的僅有不到1%的納米治療藥物[11]。

1.2 主動(dòng)靶向 NP與靶向配體(例如肽類或抗體)結(jié)合的形式，或者通過(guò)外部刺激到達(dá)預(yù)期部位，以此實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向[12]。NP與靶向配體的結(jié)合不僅增加了腫瘤間隙的積累，而且受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用也會(huì)引起NP向腫瘤細(xì)胞內(nèi)聚集，這也是細(xì)胞攝取的關(guān)鍵途徑，從而促進(jìn)了靶向藥物的釋放。主動(dòng)靶向相較于被動(dòng)靶向潛力巨大，可以對(duì)原發(fā)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷[13]，因此，主動(dòng)靶向作為EPR的補(bǔ)充策略，可以進(jìn)一步提高納米載藥的效率。刺激響應(yīng)釋放NP的靶向系統(tǒng)旨在響應(yīng)不同類型的刺激，在內(nèi)部或外部刺激下納米載體的結(jié)構(gòu)變化或者斷裂，從而引起活性藥物成分的釋放，最終在靶向細(xì)胞上釋放藥物[14]。

2 納米載藥系統(tǒng)在肝癌治療中的種類

當(dāng)前，搭載藥物靶向肝癌治療的NP大多歸為有機(jī)、無(wú)機(jī)以及雜化三類，其中雜化NP是有機(jī)和無(wú)機(jī)成分通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)形式連接產(chǎn)生。但人工合成的NP較容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，因此仿生NP應(yīng)運(yùn)而生，它可以顯著改善肝癌的靶向治療。

2.1 有機(jī)納米載藥系統(tǒng)

有機(jī)納米載藥系統(tǒng)主要由聚合物、脂質(zhì)體、納米乳液等有機(jī)NP組成，有機(jī)NP因其良好的生物相容性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及免受消化酶降解的功能而在肝癌治療中得到廣泛的應(yīng)用。

2.1.1 脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng) 脂質(zhì)體是由磷酯類分子組成的人工球形雙層膜囊泡，它可以將親脂和親水性的藥物包封在囊泡內(nèi)，其中親脂性藥物可以被包封在雙層膜中，親水性藥物則被包封在水相中[15]。另外，脂質(zhì)體還具有低毒、藥物保護(hù)、藥物半衰期延長(zhǎng)等作用，而基于脂質(zhì)體的納米載藥系統(tǒng)包括固體脂質(zhì)納米顆粒(solid lipid nanoparticles，SLN)以及納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers，NLC)。

Ye等[16]利用逆相蒸發(fā)法制備出負(fù)載索拉非尼(sorafenib，SOR)的聚乙二醇(PEG)修飾的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體(命名為L(zhǎng)C-PEG-SOR-NP)，再將抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(anti-VEGFR)靶向脂質(zhì)體后形成anti-VEGFR-LC-PEG-SOR-NP。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將anti-VEGFR-LC-PEG-SOR-NP與Huh-7細(xì)胞共同培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)到72 h時(shí)細(xì)胞存活率僅為18%，流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting, FACS)進(jìn)一步證實(shí)Huh-7細(xì)胞中43.22%的膜聯(lián)蛋白V-FITC染色陽(yáng)性，表明制備的載藥脂質(zhì)體可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，anti-VEGFR-LC-PEG-SOR-NP靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，14 d后發(fā)現(xiàn)載藥脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10 h且明顯長(zhǎng)于其他組，該組腫瘤體積低于其他組，期間小鼠無(wú)死亡，表明該載藥脂質(zhì)體安全有效并且可以有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，LC-NP也有望成為靶向肝癌的新型納米藥物載體。

脂質(zhì)體雖然優(yōu)點(diǎn)眾多且在臨床上應(yīng)用廣泛，但也存在一些局限性。NLC作為第二代脂質(zhì)體，雖然在載藥量、低藥物泄露和增強(qiáng)EPR效應(yīng)上較第一代優(yōu)勢(shì)顯著，但最主要的問(wèn)題還是無(wú)法在脂質(zhì)基質(zhì)中高負(fù)載治療藥物。

2.1.2 聚合物納米載藥系統(tǒng) 聚合物NP通常是以納米囊或納米球的形式由天然或人工合成聚合物制備出的有機(jī)化合物[17]?；诰酆衔颪P的載藥系統(tǒng)具備生物相容性好、可控的藥物釋放、表面易功能化等優(yōu)勢(shì)從而將藥物輸送到腫瘤部位。

其中殼聚糖(CTS)因良好的生物降解性以及低毒性被廣泛應(yīng)用，基于CTS合成的殼聚糖NP(CN)在進(jìn)入人體后大多會(huì)聚集在巨噬細(xì)胞(macrophages，M?)中。Jiang等[18]將合成的CN與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)共同培養(yǎng)24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CN將TAM極化為M?1，隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CN處理后的TAM極化可以減少癌細(xì)胞在體外的增殖及遷移。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在肝癌轉(zhuǎn)移小鼠體內(nèi)注射CN，觀察8 d后處死小鼠，發(fā)現(xiàn)CN組小鼠的腫瘤體積和重量均減少且未見(jiàn)腫瘤浸潤(rùn)，說(shuō)明CN可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲，隨后對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫熒光測(cè)定，發(fā)現(xiàn)CN組的CD86表達(dá)要明顯高于CD163，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)CN表面電荷等理化組成的改變會(huì)引起不同物質(zhì)與細(xì)胞間的相互作用進(jìn)而影響免疫調(diào)節(jié)作用，因?yàn)镃N表面直接與TLR4等控制極化的膜受體接觸，也證實(shí)了CN可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用改善M?的表型穩(wěn)態(tài)從而抑制肝癌的生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移。

聚合物納米載藥系統(tǒng)雖擁有較好的生物降解性以及腫瘤靶向性，但在制備中易殘留有機(jī)溶劑，封裝的分子藥物無(wú)法延長(zhǎng)釋放時(shí)間以及聚合物的生物降解所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性而較少投入到臨床試驗(yàn)。

2.1.3 納米乳液(nanoemulsion，NE)載藥系統(tǒng) NE是粒徑1～100 nm的乳狀液，主要由水、油、乳化劑等制成。NE因極佳的生物相容性、可降解性以及控釋特性，再加上易于制備而在親脂類抗癌藥的載藥系統(tǒng)中得到廣泛利用[19]。

長(zhǎng)期以來(lái)，法尼醇X受體(farnesoid x receptor，F(xiàn)XR)不僅在肝臟代謝中調(diào)節(jié)膽汁酸、葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，還被認(rèn)為是肝癌的新型治療靶點(diǎn)，其中，奧貝膽酸(obeticholic acid，OCA)作為一種有效的FXR激動(dòng)劑在肝癌治療中發(fā)揮潛在的抗癌作用。Ji等[20]制備了搭載OCA的NE(OCA-NE)，實(shí)驗(yàn)先將OCA-NE同H22細(xì)胞共同培養(yǎng)24～48 h，MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OCA-NE可以減少H22細(xì)胞的細(xì)胞增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，肝癌小鼠經(jīng)數(shù)天后切除腫瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OCA-NE組小鼠的腫瘤抑制率明顯高于OCA組(68% vs 30%)，表明OCA-NE具有明顯的抗腫瘤能力。另外，ELISA法證實(shí)了OCA-NE治療后小鼠腫瘤中的細(xì)胞因子CXCL16以及自然殺傷T淋巴細(xì)胞(natural killer T，NKT)水平均明顯增加。說(shuō)明OCA-NE在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞大量積累后，極大促進(jìn)了CXCL16的分泌，由于CXCL16與NKT細(xì)胞上的CXCR6相互作用，從而調(diào)節(jié)NKT的肝臟聚集效應(yīng)以此發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng)，也反映了NE是一個(gè)有潛力的肝癌治療靶向載藥系統(tǒng)。該研究雖然使用靜注作為小鼠給藥的主要途徑，但NE以油脂的緩釋特性使其經(jīng)口服給藥時(shí)在體內(nèi)停留時(shí)間增加，在生物利用度、避免生理屏障影響方面要優(yōu)于靜脈給藥，但NE在腸外給藥時(shí)容易被MPS快速清除。

2.2 無(wú)機(jī)納米載藥系統(tǒng)

無(wú)機(jī)納米載藥系統(tǒng)因其易于合成、修飾簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高以及組織成像可以作為有機(jī)納米載藥系統(tǒng)的有力替代品[21]。無(wú)機(jī)納米載藥系統(tǒng)主要由金屬或半金屬等材料合成，例如金NP(AuNP)、二氧化硅NP(SiNP)、納米金剛石(nanodiamonds，ND)因其特殊的理化特性在肝癌治療中研究廣泛。

2.2.1 金納米載藥系統(tǒng) AuNP具有獨(dú)特的光學(xué)和表面等離子共振特性而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛研究，特別是具備靶向性好、負(fù)載率高、生物相容性佳等特性而作為癌癥診斷和治療的合適載藥系統(tǒng)[22]。

當(dāng)前，SOR在肝癌治療中出現(xiàn)的耐藥性和不良反應(yīng)導(dǎo)致其在臨床使用中受限。由于miR-221在肝癌中過(guò)度表達(dá)，因此，miR-221作為新基因治療策略在肝癌中的研究顯得格外重要，但單獨(dú)應(yīng)用miR-221抑制劑會(huì)導(dǎo)致miRNA降解，AuNP則可以減少這種降解的發(fā)生以此提高藥物穩(wěn)定性。Cai等[23]在體外實(shí)驗(yàn)中將SOR與負(fù)載miR-221抑制劑的AuNP(AuNP-anti-miR221)分別對(duì)HepG2和正常細(xì)胞進(jìn)行處理，CCK-8法證實(shí)納米載體對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性小，而對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性隨濃度增加而增加，表明AuNP-anti-miR221可以抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而Chou-talalay法顯示二者聯(lián)合治療時(shí)抑制肝癌細(xì)胞的協(xié)同作用要強(qiáng)于獨(dú)立組，再經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)了二者聯(lián)合治療后miR-221下游靶點(diǎn)p27表達(dá)上調(diào)，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)下調(diào)，結(jié)果表明AuNP-anti-miR221可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR221/p27/DNMT1信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)SOR對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，也說(shuō)明了AuNP-anti-miR221可能增加SOR對(duì)肝癌細(xì)胞的化學(xué)治療敏感性。

2.2.2 二氧化硅納米載藥系統(tǒng) SiNP納米載藥系統(tǒng)的明顯優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在口服給藥，SiNP不僅可以避免疏水性藥物在消化道被影響，還可以耐受較低的pH值。除此之外，還具有孔徑可調(diào)、比表面積大等優(yōu)勢(shì)而成為載藥系統(tǒng)的理想材料[24]。其中，介孔SiNP(mesoporous SiNP，MSN)作為孔徑2～100 nm的載藥系統(tǒng)，具有高載藥量、高細(xì)胞滲透性、低細(xì)胞毒性等優(yōu)勢(shì)[25]而在癌癥治療中應(yīng)用廣泛。

MSN也存在生物降解性差和藥物釋放不完全的問(wèn)題，從而導(dǎo)致了有毒物質(zhì)的累積以及抗癌作用減弱。Yue等[26]設(shè)計(jì)了一種含二硫鍵(S-S)的介孔有機(jī)硅納米顆粒(ss-MON)。通過(guò)與MSN比較生物降解性，發(fā)現(xiàn)72 h后ss-MON已全部降解成碎片而MSN仍形態(tài)良好，說(shuō)明ss-MON有著相對(duì)不錯(cuò)的生物降解性。MTT法也驗(yàn)證了48 h后ss-MON降解后碎片的細(xì)胞毒性最低。阿霉素(doxorubicin, DOX)釋放實(shí)驗(yàn)中，ss-MON-DOX在96 h的累積釋放達(dá)到80%，進(jìn)一步說(shuō)明這種高效的藥物釋放率更助于癌細(xì)胞內(nèi)的濃度積累。體外實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)48 h觀察發(fā)現(xiàn)ss-MON-DOX對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，而對(duì)正常肝細(xì)胞的抑制作用卻最弱，表明ss-MON-DOX可以選擇性殺滅肝癌細(xì)胞。提示ss-MON可能是肝癌治療安全且有效的載藥系統(tǒng)。

2.2.3 納米金剛石載藥系統(tǒng) ND作為生物相容性最好的碳基NP，不僅在多種類型細(xì)胞中表現(xiàn)低細(xì)胞毒性，還以優(yōu)良的光學(xué)/生物特性在生物標(biāo)記以及醫(yī)學(xué)成像[27]中嶄露頭角。除此之外，ND因表面可功能化的物理特性，可以與基因、藥物等結(jié)合進(jìn)行載藥治療。

目前，siRNA通過(guò)靶向特定的互補(bǔ)mRNA鏈，誘導(dǎo)mRNA降解從而達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的目的[28]，因此，siRNA被認(rèn)為是有潛力的肝癌免疫治療方法。但siRNA進(jìn)入人體后易受生理屏障阻擋，因而需要一種靶向肝癌的載藥系統(tǒng)，最大限度減少siRNA被清除/激活的概率。Xu等[29]合成了ND-siRNA復(fù)合物，藥物釋放實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)siRNA僅在中性環(huán)境下釋放10%左右，而在10%蛋白濃度的培養(yǎng)基中釋放率約38%，表明ND-siRNA在生理?xiàng)l件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在腫瘤穿透實(shí)驗(yàn)中，筆者先構(gòu)建了3D肝癌球體模型，再通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)和FACS顯示Cy3染料處理的ND-siRNA在48 h后穿透整個(gè)模型內(nèi)部，說(shuō)明ND-siRNA在穿透腫瘤球體上表現(xiàn)優(yōu)異。腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)中，考慮到人類婆羅雙樹(shù)樣基因4(spalt-like transcription factor 4，SALL4)常被作為肝癌的潛在生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[30]。因此，該研究團(tuán)隊(duì)篩選了一個(gè)特定靶向SALL4的siRNA序列，通過(guò)qRT-PCR分析顯示SALL4 mRNA水平被ND-siRNA SALL4明顯抑制，利用CLSM對(duì)腫瘤球體進(jìn)行三維成像后使用Imaris軟件分析，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的增殖明顯下降，說(shuō)明ND-siRNA可通過(guò)抑制SALL4基因從而抑制肝癌，也使ND負(fù)載siRNA進(jìn)行肝癌基因治療成為可能。

本文中闡述的無(wú)機(jī)納米載藥系統(tǒng)雖在穩(wěn)定性、藥物控釋、成像診斷方面具有顯著能力，但由于溶解度低和毒性問(wèn)題，導(dǎo)致其臨床轉(zhuǎn)化并不廣泛。

2.3 雜化納米載藥系統(tǒng)

雜化納米載藥系統(tǒng)由兩種或更多的納米載體組成，常具備組成載體的不同理化特性而展示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2.3.1 脂質(zhì)-聚合物雜化納米載藥系統(tǒng) 當(dāng)前，研究最廣泛的是脂質(zhì)-聚合物雜化NP，此種DDS具備極高的生物相容性、更易控制的藥物釋放、更優(yōu)越的體內(nèi)循環(huán)功效，不僅打破了單純脂質(zhì)載藥的不穩(wěn)定性及表面修飾的有限性，還解決了聚合物毒性等問(wèn)題[31]。

Zhang等[32]合成了iRGD修飾的脂質(zhì)-聚合物雜化NP(iRGD-LPN)，在負(fù)載DOX和SOR后與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)4 h，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)是非iRGD修飾的LPN的2.3倍左右，表明iRGD可以幫助NP蓄積在腫瘤部位。凋亡實(shí)驗(yàn)中，將DOX+SOR/iRGD-LPN與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，在相同藥物濃度下其細(xì)胞凋亡率要高于其他組，表明DOX+SOR/iRGD-LPN抑癌能力最強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在肝癌大鼠體內(nèi)注射DOX+SOR/iRGD-LPN，15 d結(jié)束后該組腫瘤體積與重量均低于其他兩組，說(shuō)明注射DOX+SOR/iRGD-LPN后明顯增強(qiáng)了抗腫瘤療效，究其原因是由于LPN使得DOX和SOR在體內(nèi)獲得持續(xù)的藥物釋放以及更久的血液循環(huán)時(shí)間，而在iRGD修飾下的LPN顯著提高了癌細(xì)胞攝取能力以及癌細(xì)胞增殖抑制作用。

2.3.2 納米金屬有機(jī)骨架(nanosized metal organic frameworks，NMOF)載藥系統(tǒng) NMOF是由無(wú)機(jī)金屬離子和有機(jī)配體連接而成的框架結(jié)構(gòu)，以高孔腺率、大比表面積等優(yōu)勢(shì)[33]而成為癌癥治療的優(yōu)良DDS。

為了提高DDS的靶向效率，往往將乳糖酸(LA)、甘草次酸(GA)等配體作為靶向劑。Fytory等[34]首次制備了LA-GA-NMOF，并與NMOF進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)首先將NMOF與人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)共同培養(yǎng)，72 h后經(jīng)測(cè)定HSF細(xì)胞活力仍有77%左右，表明NMOF具有較安全的生物相容性。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，LA-GA-NMOF負(fù)載DOX后與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞活力與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，表明LA-GA-NMOF抑癌能力突出。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到LA-GA-NMOF-DOX處理后的HepG2細(xì)胞在48 h時(shí)檢測(cè)到強(qiáng)熒光信號(hào)，表明雙配體NMOF的細(xì)胞攝取能力顯著，另外，F(xiàn)ACS也證實(shí)了LA-GA-NMOF-DOX具有不錯(cuò)的癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)。說(shuō)明雙配體NMOF在肝癌治療方面所展現(xiàn)的選擇性靶向作用以及安全載藥性能要優(yōu)于單配體NMOF。

雜化納米載藥系統(tǒng)雖可以克服二者單獨(dú)應(yīng)用的局限性，但不足在于表面生理特性易影響體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，另外，雜化載體的臨床應(yīng)用仍處于起步階段，且研究的費(fèi)用極高，使得轉(zhuǎn)化受限。

2.4 仿生納米載藥系統(tǒng)

仿生納米顆粒(biomimetic nanoparticles，BNP)在NP基礎(chǔ)上增加生物成分，這些生物載體[35]可以是細(xì)胞膜、細(xì)胞外囊泡和病毒，這不僅保留了NP的理化性質(zhì)，還可以模仿機(jī)體生物學(xué)特點(diǎn)，因而具有不錯(cuò)的免疫逃逸和精準(zhǔn)靶向能力。

2.4.1 紅細(xì)胞膜仿生納米載藥系統(tǒng) 紅細(xì)胞作為機(jī)體血液中數(shù)量最多的細(xì)胞，再加上與免疫細(xì)胞同源，因此在將近120 d的循環(huán)壽命內(nèi)不會(huì)輕易被免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到，這些也使涂覆紅細(xì)胞膜(red cell membrane，RBCM)的NP具備穩(wěn)定性好、低免疫原性、循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等[36]優(yōu)勢(shì)。

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)雖是急性早幼粒細(xì)胞白血病的一線藥物，但也有研究[37]證實(shí)ATO在較低濃度時(shí)可以明顯誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，抑制HCC血管生成，通過(guò)靶向多種信號(hào)通路而在HCC治療中作用顯著。Lian等[38]設(shè)計(jì)了一種RBCM包被的負(fù)載ATO的海藻酸鈉NP(RSAN)，RSAN與血清培養(yǎng)3 d后未發(fā)現(xiàn)任何絮凝現(xiàn)象，表明RSAN能在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定。藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ICP-AES分析發(fā)現(xiàn)RSAN組在84 h后才釋放至95%，而SAN在36 h就釋放完全，表明RSAN可以控制抗腫瘤藥效發(fā)揮更持久。另外，熒光素標(biāo)記的RSAN、SAN分別與RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)2 h，CLSM觀察到RSAN組的熒光信號(hào)最弱，F(xiàn)ACS驗(yàn)證了SAN的MFI是RSAN的2倍左右，推測(cè)RSAN有望避免藥物在體內(nèi)被過(guò)早清除。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，RSAN組荷瘤小鼠的整體體質(zhì)量增加，而腫瘤體積、重量均最低。研究整體證實(shí)了RSAN的穩(wěn)定性好，同時(shí)在持續(xù)的藥物釋放下不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，可顯著降低ATO的毒性，明顯提高抗肝癌作用。

2.4.2 中性粒細(xì)胞膜仿生納米載藥系統(tǒng) 長(zhǎng)期以來(lái)，中性粒細(xì)胞一直被認(rèn)為是機(jī)體炎癥反應(yīng)的第一條防線，在中性粒細(xì)胞激活后可以發(fā)揮趨化、吞噬以及調(diào)節(jié)免疫作用。在腫瘤微環(huán)境(TME)中中性粒細(xì)胞常具有雙重功能[39]，在促腫瘤炎癥形成方面，中性粒細(xì)胞可以推動(dòng)血管新生、重塑細(xì)胞外基質(zhì)和抑制適應(yīng)性免疫，在介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)過(guò)程中，中性粒細(xì)胞可以直接殺滅腫瘤細(xì)胞或者與其他免疫細(xì)胞相互作用。

光動(dòng)力療法(PDT)可誘導(dǎo)光敏劑產(chǎn)生大量活性氧以此抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Zhang等[40]構(gòu)建了一種負(fù)載竹紅菌素(hypocrellins，HB)的中性粒細(xì)胞膜(neutrophilic membrane，NM)包被的NP(NM-HB NP)，攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NM-HB NP可以靶向HepG2細(xì)胞，隨后的實(shí)驗(yàn)中使用PDT聯(lián)合NM-HB NP處理HepG2細(xì)胞，24 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡率明顯高于NM-HB NP組，說(shuō)明激光照射后的NM-HB NP可以明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖。另外，研究也證實(shí)了PDT聯(lián)合NM-HB NP可以通過(guò)抑制JUNB表達(dá)水平，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和線粒體功能障礙，進(jìn)而引起肝癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在肝癌小鼠體內(nèi)注射NM-HB NP，觀察12 h后再予激光照射10 min，28 d后該組小鼠的腫瘤體積最小。表明二者聯(lián)合后抑制肝癌的療效顯著，這種抑癌作用也歸結(jié)于中性粒細(xì)胞和HB的抗腫瘤效應(yīng)以及潛在靶點(diǎn)JUNB的表達(dá)抑制。

生物載體偽裝的納米載藥系統(tǒng)雖具有高特異性、低免疫原性等優(yōu)勢(shì)，但也面臨著不同載體的穩(wěn)定性不同、制備工藝繁瑣難以量產(chǎn)以及用于人體的生物安全性不清晰等問(wèn)題。

3 納米載藥系統(tǒng)在肝癌免疫治療中應(yīng)用

先天免疫系統(tǒng)可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞入侵并在激活狀態(tài)下會(huì)刺激T淋巴細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)觸發(fā)免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑來(lái)干擾T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，以此逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，從而引起機(jī)體免疫反應(yīng)的失調(diào)。

以程序性死亡受體1(PD-1)及程序性死亡配體(PD-L1)為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑被大量開(kāi)發(fā)。PD-1與PD-L1相互作用可以導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞衰竭從而抑制抗腫瘤免疫。當(dāng)前抗PD-1療法在晚期肝癌的反應(yīng)率較低，一個(gè)關(guān)鍵原因是CD8+T淋巴細(xì)胞與腫瘤負(fù)荷之間的不平衡[41]。考慮到肝癌的多血管結(jié)構(gòu)，負(fù)載康普瑞汀A4的NP(combretastatin A4-NP，CA4-NP)顯示出較強(qiáng)的腫瘤血管靶向和腫瘤抑制作用[42]，而CA4-NP在腫瘤中的低滲透性，也使其可以更有效地降低腫瘤負(fù)擔(dān)。有研究[43]顯示，阻斷VEGF/VEGFR2信號(hào)可以幫助腫瘤血管短暫性恢復(fù)，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量也會(huì)隨之增加。Bao等[44]研究出了VEGF/VEGFR2抑制劑DC101聯(lián)合CA4-NP(命名為CA4-NP+DC101)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在肝癌小鼠體內(nèi)注射CA4-NP+DC101，培養(yǎng)10 d后發(fā)現(xiàn)CA4-NP+DC101的聯(lián)合治療減少了腫瘤負(fù)荷，也增加了腫瘤內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量。在評(píng)估抗PD-1療法與CA4-NP+DC101的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)中，10 d時(shí)該聯(lián)合組的肝癌抑制率達(dá)到86.4%，期間該組小鼠的存活天數(shù)是抗PD-1療法組的1.9倍，表明二者在抗腫瘤治療中的強(qiáng)協(xié)同作用。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CA4-NP+DC101可以增強(qiáng)抗PD-1療法在肝癌中的療效。

4 納米載藥系統(tǒng)的診療一體化

納米載藥系統(tǒng)的肝癌診療一體化是利用NP將診斷和治療劑整合到肝癌的診斷及治療領(lǐng)域。協(xié)助肝癌診斷的技術(shù)主要包括AFP非標(biāo)記檢測(cè)及超聲、光聲、MRI等成像技術(shù)等。

納米材料與光聲成像(PA)相結(jié)合，可深入到腫瘤進(jìn)行探查實(shí)現(xiàn)肝癌的靶向治療。Li等[45]合成了一種iRGD肽修飾的負(fù)載10-羥基喜樹(shù)堿(HCPT)共軛吲哚菁綠(ICG)且表面涂有液態(tài)全氟戊烷(PFP)的相變脂質(zhì)體NP(iRGD-ICG-10-HCPT-PFP-NP)，運(yùn)用ICG作為吸光劑可以被PA儀器激發(fā)實(shí)現(xiàn)深50 mm的體內(nèi)組織成像原理，達(dá)到實(shí)時(shí)示蹤藥物在腫瘤中的濃度，同時(shí)利用低強(qiáng)度聚焦超聲(LIFU)對(duì)NP進(jìn)行照射，促使液態(tài)碳氟化合物發(fā)生液-氣相變，引發(fā)載體破裂，促進(jìn)藥物釋放。體外實(shí)驗(yàn)中，NP隨著ICG濃度增加，釋放的PA信號(hào)隨之增加，表明NP可以吸收光并轉(zhuǎn)換為PA信號(hào)。NP在LIFU體外照射下，隨時(shí)間推移表現(xiàn)出不同程度的相變和破裂，表明NP增強(qiáng)了超聲成像。另外，NP聯(lián)合LIFU照射可促進(jìn)人肝癌細(xì)胞凋亡和抗增殖作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NP的腫瘤靶向能力并在LIFU照射下增強(qiáng)了PA/超聲成像能力，同時(shí)聯(lián)合組的荷瘤小鼠腫瘤體積明顯更小，表明聯(lián)合治療的抑瘤率最高，療效最好。利用具備超聲/PA雙模態(tài)成像的多功能分子探針，可以靶向腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)肝癌可視化，并在LIFU照射下釋放藥物，從而實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的靶向治療，為肝癌的一體化診療提供了新思路。

目前尚缺少肝癌診療一體化的臨床試驗(yàn)研究，這種既能進(jìn)行成像診斷，又能結(jié)合藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療的模式符合未來(lái)分子影像學(xué)的研究方向。

5 納米載藥系統(tǒng)的臨床轉(zhuǎn)化

納米載藥系統(tǒng)從臨床前研究轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的成果面臨著系統(tǒng)穩(wěn)定性差、毒理學(xué)、效益評(píng)估等障礙，使得只有極少數(shù)的載藥系統(tǒng)投入到臨床試驗(yàn)當(dāng)中。而脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)是目前第一個(gè)從概念過(guò)渡到臨床應(yīng)用的DDS，在所有納米載藥系統(tǒng)中展現(xiàn)最寬廣的應(yīng)用前景。

5.1 化療藥聯(lián)合治療 臨床前研究[46]證實(shí)，在實(shí)體瘤的治療中應(yīng)用負(fù)載化療藥的熱敏脂質(zhì)體可以在高溫下釋放，極大提高腫瘤內(nèi)藥物濃度。在一項(xiàng)單中心、小樣本的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，Lyon等[47]研發(fā)了一種溶血熱敏脂質(zhì)體阿霉素(lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin，LTLD)，通過(guò)對(duì)10例患者靜脈注射LTLD并聯(lián)合聚焦超聲照射，試驗(yàn)結(jié)束后有7例患者腫瘤內(nèi)的阿霉素濃度增加2倍以上，僅有5例患者出現(xiàn)預(yù)期的短暫性中性粒細(xì)胞減少，并未發(fā)生死亡事件，作為第1例用于人體臨床試驗(yàn)的脂質(zhì)體載藥熱活化制劑，采用無(wú)創(chuàng)聚焦超聲誘導(dǎo)的溫和熱療觸發(fā)LTLD在肝轉(zhuǎn)移瘤中的給藥安全性和可行性得到驗(yàn)證。作為Ⅰ期臨床研究，不可避免存在一定的局限性，比如聚焦超聲強(qiáng)度受到周圍肋骨影響，其次是腫瘤的異質(zhì)性使得血管分布和壞死的數(shù)量出現(xiàn)差異，另外就是缺少僅注射LTLD的肝癌患者與時(shí)間相對(duì)應(yīng)的活檢。

5.2 核酸/基因聯(lián)合治療 轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha，CEBPA)在肝臟穩(wěn)態(tài)和骨髓細(xì)胞分化中發(fā)揮主要調(diào)控作用，而CEBPA也被證實(shí)[48]在多種致癌疾病中下調(diào)。MTL-CEBPA是一種可以上調(diào)CEBPA的小激活RNA(small activating RNA，saRNA)藥物，具有改善肝功能并且抑制肝癌生長(zhǎng)的潛力。在首例靶向CEBPA的saRNA藥物進(jìn)入到多中心、非對(duì)照的Ⅰ期人體試驗(yàn)中，Sarker等[49]研究人員對(duì)38例晚期HCC合并肝硬化或其他轉(zhuǎn)移疾病的患者每周進(jìn)行1次負(fù)載MTL-CEBPA的脂質(zhì)體靜脈注射，實(shí)行28～160 mg/m2的劑量遞增治療，治療結(jié)束后未出現(xiàn)死亡，患者均未達(dá)到最大耐受劑量，與該群體患者使用的其他靶向藥相比，MTL-CEBPA脂質(zhì)體具有有限的毒性，同時(shí)在晚期HCC患者中證實(shí)了CEBPA的靶向作用，推動(dòng)MTL-CEBPA脂質(zhì)體聯(lián)合SOR在晚期HCC患者中的進(jìn)一步試驗(yàn)。

6 結(jié)語(yǔ)

隨著材料學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人類對(duì)肝臟疾病的發(fā)病和分子機(jī)制有了更為深入的了解，這也促進(jìn)了納米載體靶向肝癌治療的研究發(fā)展。鑒于肝癌機(jī)制的復(fù)雜性更需對(duì)納米載藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)提出標(biāo)準(zhǔn)化要求，盡管不同的納米載藥系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成具備不同的功能，但目的都是在提高抗癌療效和降低毒副作用。另外，納米載藥系統(tǒng)的抗肝癌研究開(kāi)展要遵循以下幾點(diǎn)：一是EPR效應(yīng)是否存在；二是能否增加藥物在腫瘤中的積累；三是能否減少在正常組織中的蓄積；四是理化性質(zhì)是否影響臨床療效。其中第四點(diǎn)也是載藥及發(fā)揮功效最關(guān)鍵的一點(diǎn)。由于納米載體的理化參數(shù)存在差異，且缺乏對(duì)NP在體內(nèi)器官和細(xì)胞水平的生物學(xué)行為研究，可以采用層次聚類分析等手段對(duì)二者聯(lián)系進(jìn)行分析，隨后采用科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，以此評(píng)估預(yù)期的療效和毒性。

當(dāng)前，獲批應(yīng)用于肝癌臨床試驗(yàn)的納米載藥系統(tǒng)較少，未來(lái)還需將更多的臨床前研究進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從藥物研發(fā)開(kāi)始的各個(gè)階段建立起完整的產(chǎn)學(xué)研合作模式，從而開(kāi)發(fā)出更合理的納米載藥系統(tǒng)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王淼東負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)并撰寫(xiě)論文；陳澤山、彭佩純參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；鄧鑫負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫(xiě)論文并最后定稿。