黨如意，葉 超，馮 航，馮 杰，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

腹瀉是犢牛常見的一種胃腸道疾病，通常在其出生后2 d～3 d開始發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為消化不良和腹瀉[1-2]。在大規(guī)模飼養(yǎng)中，犢牛腹瀉發(fā)生率高達(dá)90%～100%，病死率達(dá)50%以上，對(duì)犢牛的生長(zhǎng)、發(fā)育、成活等具有很大影響[3-4]。犢牛腹瀉的發(fā)病原因復(fù)雜，主要有感染性因素和非感染性因素，其中感染性因素包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染等[5]。能夠引起犢牛腹瀉的致病菌主要有致病性大腸埃希氏菌[6]、蠟樣芽孢桿菌[7]、產(chǎn)氣莢膜梭菌[8]等。其中，致病性大腸埃希氏菌是引起1周齡內(nèi)犢牛腹瀉的主要致病菌，其侵入犢牛后可以釋放多種腸毒素引起腹瀉[9]。犢牛從污染的環(huán)境中攝取菌體，或者由于飼養(yǎng)管理等因素引起腸道內(nèi)環(huán)境遭到破壞、腸道菌群失調(diào)、免疫力降低，菌體大量繁殖產(chǎn)生大量毒素引起腹瀉[10]。犢牛發(fā)生腹瀉后，抵抗力下降，腸道菌群紊亂，極易誘發(fā)外源或條件性致病原感染，加劇病情和死亡[11]。

西北地區(qū)某牛場(chǎng)于2020年9月份開始陸續(xù)出現(xiàn)犢牛腹瀉引起的死亡，發(fā)病牛均為7日齡～10日齡，糞便帶血，且在出現(xiàn)腹瀉后3 d～5 d死亡，剖檢可見肝臟輕度腫大、邊緣泛白。2021年1月，該牛場(chǎng)因腹瀉死亡犢牛達(dá)20余頭。采集發(fā)病犢牛的肝臟和脾臟送西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院重大動(dòng)物疫病綜合防控與凈化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)診斷以及動(dòng)物致病性試驗(yàn)，結(jié)合病牛的臨床表現(xiàn)，最終確定為蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌混合感染所致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無菌采集該養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉犢牛肝臟和脾臟2份，其中1份用于總DNA的提取，置-80℃保存?zhèn)溆茫?份用于細(xì)菌分離。昆明小鼠購自中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；PCR Mix，北京市康潤(rùn)生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；部分獸用藥藥敏片為本實(shí)驗(yàn)室按照歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)制備；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌器(YXQ-50SⅡ)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；電子天平感量，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，上海世澤生物科技有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高速低溫離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；PCR儀，安諾倫(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 需氧性致病菌的分離與純化 將采集樣品無菌接種于50 mL/L脫纖維綿羊血瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h，記錄菌落生長(zhǎng)特征，挑取能使血平板溶血的單個(gè)菌落，觀察菌體形態(tài)。將初步分離的可疑菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)狀況，記錄菌落生長(zhǎng)特征，挑取單菌落，革蘭氏染色、鏡檢，觀察記錄菌體形態(tài)。挑取上述分離培養(yǎng)得到的單菌落接種于5%脫纖維綿羊血培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果；再挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢；接種于肉湯中，在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，保菌備用。

1.2.2 厭氧性致病菌的分離與純化 取少量樣品，充分研磨，用1 mL生理鹽水稀釋，吸取100 μL稀釋液加入?yún)捬跞飧螠校?7℃培養(yǎng)18 h，收集1 mL厭氧肉肝湯培養(yǎng)物，6 000 r/min離心30 s，棄上清，用接種環(huán)蘸取少量沉淀于TSC培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境37℃培養(yǎng)24 h，將TSC培養(yǎng)基上的菌落接種至5%脫纖維綿羊血瓊脂上，厭氧環(huán)境37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色鏡檢；接種于厭氧肉肝湯中，在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，保菌備用。

1.2.3 分子生物學(xué)診斷 利用DNA提取試劑盒分別提取需氧和厭氧條件下獲取培養(yǎng)物的DNA，以此為模板用16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)為陽性對(duì)照。

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 取所分離細(xì)菌培養(yǎng)物于無菌離心管中，用生理鹽水調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，隨后以200 μL/只分別腹腔注射6只8周齡雄性昆明小鼠，作為試驗(yàn)組；同時(shí)以200 μL/只生理鹽水腹腔注射6只8周齡雄性昆明小鼠作為對(duì)照組。一定時(shí)間后觀察小鼠狀態(tài)，如有死亡，對(duì)其進(jìn)行剖檢。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[11]分別對(duì)分離的蠟樣芽孢桿菌(10種抗生素)和大腸埃希氏菌(19種抗生素)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

病牛精神沉郁，喜躺臥，吮乳減少或者廢絕，部分犢牛還出現(xiàn)瘤胃鼓氣并呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作，平均體溫在37.5℃左右。病牛排糞量減少，排便次數(shù)增加，初期排不成形、黃或白色軟糞，隨著病癥加重，病牛排青灰色稀糞，內(nèi)含黏液、血液等混雜物。聽診病牛心率增加、心音增強(qiáng)、腸蠕動(dòng)音高朗；眼球凹陷。發(fā)病后期犢牛站立不穩(wěn)，全身戰(zhàn)栗，瀕死期倒地，四肢作劃水狀。

2.2 細(xì)菌學(xué)診斷

需氧條件下獲取培養(yǎng)物鏡檢發(fā)現(xiàn)為大量革蘭氏陽性桿狀菌和少量中等大小的革蘭氏陰性桿狀菌；厭氧條件獲取的培養(yǎng)物在TSC培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一白色菌落，鏡檢發(fā)現(xiàn)為單一中等大小的革蘭氏陰性桿狀菌，形態(tài)與需氧培養(yǎng)物中的革蘭氏陰性桿菌一致。

2.3 分子生物診斷

分別對(duì)需氧和厭氧培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為1 386 bp(圖1)。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)需氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的革蘭氏陽性菌擴(kuò)增產(chǎn)物和NCBI中的1株蠟樣芽孢桿菌的同源性為100%；需氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌和厭氧環(huán)境下培養(yǎng)的革蘭氏陰性擴(kuò)增產(chǎn)物與大腸埃希氏菌ATCC 44102的同源性都為99.89%，判定不同條件下分離的2株革蘭氏陰性菌為相同的克隆株。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；2.陽性對(duì)照；3.陰性對(duì)照；4.需氧型革蘭氏陽性菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；5.需氧型革蘭氏陰性菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；6.厭氧型革蘭氏陰性菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

分離的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物接種小鼠36 h全部死亡，剖檢，取肝臟和腸道樣本涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性桿狀菌；分離的臘樣芽孢桿菌培養(yǎng)物接種小鼠24 h后全部死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟腫大充血，肝臟涂片鏡檢，可觀察到中等大小革蘭氏陽性桿狀菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)

按照EUCAST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，分別對(duì)分離的致病性大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(表1、表2)。

表1 大腸埃希氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在大規(guī)模飼養(yǎng)中，犢牛腹瀉是犢牛常見的胃腸道疾病，具有很高的發(fā)病率[1,12]。該牛場(chǎng)發(fā)病犢牛在發(fā)病初期出現(xiàn)明顯的排便次數(shù)增加，隨后病牛排青灰色惡臭稀糞，內(nèi)含黏液、血液等混雜物，最后發(fā)病犢牛無法站立，瀕死期倒地，整個(gè)發(fā)病過程持續(xù)3 d～5 d左右。采集發(fā)病犢牛的肝脾在需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)得到一株致病菌，后經(jīng)分子生物學(xué)診斷確定為致病性蠟樣芽孢桿菌。該致病菌屬于革蘭氏陽性、β溶血性的桿狀細(xì)菌，犢牛感染會(huì)引起水樣腹瀉和腹痛，很少伴有嘔吐[7]，該癥狀和發(fā)病犢牛癥狀相符。另外，發(fā)病犢牛病情進(jìn)展較快，并出現(xiàn)腹痛，開始懷疑為魏氏梭菌感染，但是對(duì)采集的肝脾進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有單一白色菌落，和產(chǎn)氣莢膜梭菌的黑色伴隨白圈的菌落不符。隨后，對(duì)厭氧條件培養(yǎng)物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，序列比對(duì)確定為大腸埃希氏菌。致病性大腸埃希氏菌感染多發(fā)生在10日齡以內(nèi)的犢牛，特別是產(chǎn)后的1 d～3 d內(nèi)，四季均可發(fā)生。臨床上致病性大腸埃希氏菌分為敗血型、腸毒素型和腸型[13]，其中產(chǎn)腸毒素型大腸埃希氏菌感染犢牛腹瀉最為明顯，病牛排黃色惡臭糞便，繼而出現(xiàn)淺灰色水樣腹瀉，混有血塊、血絲和氣泡[14]。產(chǎn)腸毒素型大腸埃希氏菌的癥狀和該牛場(chǎng)發(fā)病犢牛的癥狀也較為相符。

綜上所述，根據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)、病理剖檢以及實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該牛場(chǎng)犢牛腹瀉是由致病性蠟樣芽孢桿菌和致病性大腸埃希氏菌混合感染。致病性細(xì)菌引起的犢牛腹瀉發(fā)病率較高，本研究對(duì)該病的防治提出以下建議：首先對(duì)有臨床癥狀的犢牛進(jìn)行隔離，以對(duì)癥治療、解毒保肝為原則，結(jié)合藥敏試驗(yàn)，選擇對(duì)致病性大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌分別敏感的抗菌藥物(如頭孢噻呋鈉聯(lián)合恩諾沙星)各一種進(jìn)行，切忌多種抗菌藥物同時(shí)使用。然后配合中藥處方：黃柏、黃芩、豬苓、澤瀉、車前子、茯苓、白芍、神曲、麥芽、山楂、石榴皮、黨參、當(dāng)歸、熟地、甘草各10 g，水煎，口服2次～3次。對(duì)于體溫下降明顯、脫水嚴(yán)重的犢牛，給予抗生素治療的同時(shí)配合50 g/L葡萄糖生理鹽水、復(fù)方氯化鈉、維生素B1、碳酸氫鈉等，每天2次靜脈注射[15]。保持牛舍通風(fēng)保暖和干燥，徹底清理廄舍內(nèi)所有病牛排泄物和被污染的墊料、用具等，進(jìn)行全面消毒。通過采取以上處理措施，該牛場(chǎng)犢牛病情得到有效控制，未再出現(xiàn)新的病例，被隔離病牛經(jīng)過治療也基本康復(fù)。

目前，在我國(guó)的養(yǎng)牛地區(qū)和規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，犢牛腹瀉的發(fā)生很普遍，且一旦發(fā)生，極易引起死亡，使養(yǎng)牛戶或養(yǎng)牛企業(yè)蒙受重大損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，故需引起足夠重視。希望本文所做工作能對(duì)養(yǎng)牛戶或養(yǎng)殖企業(yè)提供參考。