楊建波，汪祺，程顯隆，王瑩，高慧宇，王雪婷，宋云飛，魏鋒，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

何首烏為蓼科植物何首烏屬多年生草本植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效，可用于瘡癰、風疹瘙癢和潤腸通便等[1]。文獻報道，目前已經(jīng)從何首烏中分離得到200 余個單體化合物，主要包括蒽醌（單核蒽醌和雙核蒽醌）、二苯乙烯、黃酮、磷脂和其他等類成分[2-9]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，何首烏具有抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護和調(diào)血脂等作用[10-12]，但同時也出現(xiàn)了一些肝毒性等不良反應(yīng)[3-4,10-13]。因此，為了進一步闡明何首烏中的藥效和肝毒性成分，本課題組對何首烏進行了系統(tǒng)的化學成分研究，從何首烏70%乙醇提取物中分離得到2個二苯乙烯苷類、2 個二蒽酮類和2 個多酚類化合物，分別鑒定為(E)-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷-6′-棕櫚酸酯（1）、順式-大黃素-大黃素甲醚二蒽酮（2）、反式-大黃素-大黃素甲醚二蒽酮（3）、兒茶素（4）、表兒茶素（5）和(E)-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯苷-2-O-α-L-鼠李糖苷（6）。

1 材料

Avance-500、Avance-600 型核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）；LC-6AD 型半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；Q Exactive Plus型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司）；HP1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；DM-8 型大孔吸收樹脂（津達正源化工有限公司）；Sephadex LH-20（瑞典GE公司）；C18反相填料（日本YMC公司）；QUINTIX313-1CN型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；其他試劑均為分析純。

何首烏樣品于2013年10月采集于廣東省肇慶市德慶縣，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張繼副研究員鑒定為何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，樣品標本（060104）保存于中國食品藥品檢定研究院。

2 提取與分離

取何首烏干燥塊根28 kg，粉碎后用70%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓回收溶劑得浸膏4.0 kg。將浸膏混懸于水1.5 L中，用二氯甲烷萃取3 次。剩余水部分再加水稀釋至10 L，過DM-8 型大孔吸附樹脂，依次用不同體積分數(shù)的乙醇洗脫，得到5個不同組分，分別為水洗脫組分A（2.0 kg）、25%乙醇洗脫組分B（62.0 g）、40%乙醇洗脫組分C（200.0 g）、55%乙醇洗脫組分D（38.0 g）和95%乙醇洗脫組分E（55.0 g）。組分B（60.0 g）經(jīng)十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）中壓柱色譜分離，依次用10%、30%、50%、70%、100%甲醇洗脫，再經(jīng)過反相硅膠薄層色譜檢測，合并相同或相似部分，獲得6 個亞組分，分別為A1～A6。A1（1.5 g）經(jīng)半制備液相色譜分離純化，乙腈-水（25∶75）洗脫，檢測波長為230 nm，流速 為5.0 mL·min-1，得到化合物4（tR=29 min，50.0 mg）和5（tR=36 min，12 mg）。A4（2.0 g）經(jīng)ODS 中壓柱色譜分離，依次用40%、60%、100%甲醇梯度洗脫，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）分析，合并相同或相似部分，得到5 個亞組分，依次為B1～B5。其中B3（0.5 g）經(jīng)半制備液相色譜分離純化，甲醇-水（40∶60）洗脫，檢測波長為230 nm，流速為5.0 mL·min-1，得到化合物6（tR=35 min，4.0 mg）。

組分E（50.0 g）經(jīng)ODS 中壓柱色譜分離，依次用35%、55%、75%、100%甲醇梯度洗脫，再經(jīng)反相硅膠薄層色譜檢測，合并相同或相似部分，共獲得16 個亞組分，分別為C1～C16。C7（5 g）經(jīng)ODS 中壓柱色譜分離，依次用40%、60%、80%、100%甲醇梯度洗脫，經(jīng)HPLC 分析，合并相同或相似部分，得到11 個組分，依次為D1～D11。D6經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，用甲醇洗脫、純化，得到化合物2（5.0 mg）；D7 經(jīng)過Sephadex LH-20 柱色譜分離，用甲醇洗脫、純化，得到化合物3（6.0 mg）。亞組分D9（1.0 g）經(jīng)半制備液相分離純化，甲醇-水（55∶45）洗脫，檢測波長為230 nm，流速為5.0 mL·min-1，得到化合物1（tR=38 min，5.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色無定型粉末。電噴霧離子源-質(zhì)譜（ESI-MS）顯示準分子離子m/z667.2[M+Na]+、683.1 [M+K]+和643.2 [M-H]-；(-)-高分辨率（HR）-ESI-MS顯示準分子離子m/z643.347 9[M-H]-（計算值為643.348 8），提示該化合物分子式為C36H52O10，不飽和度為11。

1H-NMR（表1）和1H-1H COSY 譜（圖1）中顯示，該化合物含有1 組反式烯鍵的氫信號[δH7.66(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.90 (1H,d,J=16.2 Hz,H-8)]；1 組A2B2系統(tǒng)耦合的芳香氫信號[δH7.37 (2H,d,J=8.4 Hz,H-10,14),6.73 (2H,d,J=8.4 Hz,H-11,13)]；1 組AX 系統(tǒng)耦合的芳香氫信號[δH6.24 (1H,d,J=2.4 Hz,H-4),6.60(1H,d,J=2.4 Hz,H-6)]；1個糖基的端基氫信號[δH4.48(1H,d,J=7.8 Hz,H-1?)]，根據(jù)糖基的端基氫的耦合常數(shù)，可判斷該糖基構(gòu)型為β構(gòu)型；1 個甲基氫信號δH0.89 (3H,t,J=7.2 Hz,Me-16″)；14 個亞甲基氫信號[δH2.11(2H,m,H-2″),1.39 (2H,m,H-3″),1.18 (2H,m,H-4″),1.20～1.30(18H,m,H-5″～13″),1.18 (2H,m,H-14″),1.31 (2H,m,H-15″)]。

表1 化合物1的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)（600/150 MHz,CD3OD）

結(jié)合化合物1 的13C-NMR、HSQC、DEPT 及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)共有36個碳信號，其中7個季碳，包括1 個羰基碳信號[δC174.1 (C-1″)]；糖基的6 個碳信號[δC106.8(C-1′)、74.1(C-2′)、76.5(C-3′)、70.2(C-4′)、74.5(C-5′)和63.5(C-6′)]；8 個次甲基信號，包括1 組A2B2系統(tǒng)耦合的芳香環(huán)上的碳信號[δC127.7(C-10/14),115.1(C-11/13)]和1 組AX 氫耦合系統(tǒng)的芳香環(huán)上的碳信號[δC102.1 (C-4),101.1(C-6)]及1組反式雙鍵的碳信號[δC120.5(C-7)和128.4 (C-8)]；1個甲基的碳信號[δC13.0 (C-16″)]。進一步結(jié)合1H-、13C-NMR 及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)化合物1 含有1 個棕櫚?；男盘?，分別包括1 個羰基碳信號[δC174.1(C-1″)]和14 個長鏈脂肪族亞甲基的氫信號[δH2.11(2H,m,H-2″),1.39(2H,m,H-3″),1.18(2H,m,H-4″),1.20～1.30(18H,m,H-5″～13″),1.18(2H,m,H-14″),1.31(2H,m,H-15″),0.89（3H,t,J=7.2 Hz,Me-16″)]。

在HMBC譜中（圖1），δH7.66(H-7)與δC101.1(C-6)、136.7(C-2)、129.4(C-9)相關(guān)；δH6.60(H-6)與δC136.7(C-2)、102.1(C-4)相關(guān)，說明化合物1的C-7 連接在A苯環(huán)上的C-1 位；δH6.90 (H-8) 與δC132.4 (C-1)、127.4 (C-10,14) 相關(guān)；δH7.37 (H-10,14)與δC157.0(C-12)、128.4(C-8)相關(guān)，說明化合物1 的C-8 連接在B 苯環(huán)上的C-1 位。另外，在HMBC 譜中，糖基的端基氫信號δH4.48 (H-1′) 與136.7(C-2)相關(guān)，說明糖基是連接在A 苯環(huán)上的C-2 位。糖基的6′位氫信號δH4.43(H-6a′)和4.19(H-6b′) 均與174.1 (C-1″)相關(guān)；長鏈脂肪族上的δH2.11 (H-2″) 和1.39 (H-3″) 與174.1 (C-1″) 相關(guān)，說明棕櫚?；聂驶腃174.1 (C-1″) 連接在糖基的6′位。

綜合上述信息，確定化合物1為1個新的二苯乙烯苷的衍生物，結(jié)構(gòu)為(E)-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷-6′-棕櫚酸酯，為1個新的化合物，命名為何首烏辛素（polygonimitin H）。

化合物2：淡黃色固體。(-)-HR-ESI-MSm/z523.138 5 [M-H]-；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.35 (1H,s,H-2),6.66 (1H,s,H-4),6.26 (1H,s,H-5),6.16 (1H,s,H-7),6.28 (1H,s,H-2′),6.69 (1H,s,H-4′),6.35 (1H,s,H-5′),6.18 (1H,s,H-7′),4.56(2H,s,H-10,10′),2.28 (3H,s,CH3-3),2.29 (3H,s,CH3-3′)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[14]一致，因此化合物2鑒定為順式-大黃素-大黃素甲醚二蒽酮。

化合物3：淡黃色固體。(-)-HR-ESI-MSm/z523.138 5 [M-H]-；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.39 (1H,s,H-2),6.62 (1H,s,H-4),6.32 (1H,s,H-5),6.10 (1H,s,H-7),6.31 (1H,s,H-2′),6.62 (1H,s,H-4′),6.41 (1H,s,H-5′),6.14 (1H,s,H-7′),4.56(2H,s,H-10,10′),2.23 (3H,s,CH3-3),2.24 (3H,s,CH3-3′)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[14]一致，因此化合物3鑒定為反式-大黃素-大黃素甲醚二蒽酮。

化合物4：白色針狀晶體（甲醇）。(-)-ESI-MSm/z289.4 [M-H]-；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.81 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.73 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3′),6.69 (1H,dd,J=1.8,8.4 Hz,H-6′),5.90 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8),5.83 (1H,d,J=2.4 Hz,H-6),2.83(1H,dd,J=5.4,16.2 Hz,H-4a),2.48 (1H,dd,J=2.4,16.2 Hz,H-4b),4.54 (1H,d,J=7.2 Hz,H-2),3.95(1H,m,H-3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[15]一致，因此化合物4鑒定為兒茶素。

化合物5：白色針狀晶體（甲醇）。(-)-ESI-MSm/z289.2 [M-H]-；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.88 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.77 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3′),6.75 (1H,dd,J=1.8,8.4 Hz,H-6′),6.00 (1H,d,J=1.8 Hz,H-8),5.89 (1H,d,J=1.8 Hz,H-6),2.88(1H,dd,J=5.4,16.2 Hz,H-4a),2.51 (1H,m,H-4b),4.53(1H,d,J=7.8 Hz,H-2),3.98(1H,m,H-3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[15]一致，因此化合物5鑒定為表兒茶素。

化合物6：棕色固體粉末。(-)-HR-ESI-MSm/z389 [M-H]-；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:7.37 (2H,d,J=8.4 Hz,H-10,14),6.75 (2H,d,J=8.4 Hz,H-11,13),6.89(1H,d,J=16.8 Hz,H-8),7.59(2H,d,J=16.8 Hz,H-7),6.55 (1H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.18 (1H,d,J=1.8 Hz,H-4),4.38 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1?),3.36 (1H,m,H-2?),3.23 (1H,m,H-3?),2.95(1H,m,H-4?),3.28 (1H,m,H-5?),1.20 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6?)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:131.9 (C-1),136.8 (C-2),151.0 (C-3),103.0 (C-4),155.1 (C-5),101.3 (C-6),121.0 (C-7),128.6 (C-8),129.0 (C-9),128.3 (C-10,14),115.9 (C-11,13),157.7 (C-12),107.0 (C-1?),74.7 (C-2?),76.3 (C-3?),75.3 (C-4?),72.6 (C-5?),18.2 (C-6?)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[16]一致，因此化合物6 鑒定為(E)-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-α-L-鼠李糖苷。