汪祺，楊建波，文海若，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是一種在體內(nèi)廣泛表達于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，為胰島素的負調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性和能量代謝的過程中起著重要作用，PTP1B 可通過去磷酸化激活胰島素受體或其底物上的酪氨酸殘基，其抑制劑可以改善或延長胰島素的作用，起到降血糖效果。大黃素-大黃素甲醚-二蒽酮（emodin physcion dianthrone，EPD）為有效的PTP1B 抑制劑，反式-EPD（trans-EPD）和順式-EPD（cis-EPD）對PTP1B的半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為（2.77±1.23）、（7.29±2.32）μmol·L-1，是治療2 型糖尿病的潛在有效成分[1]。本課題組前期已從傳統(tǒng)中藥何首烏中分離出trans-EPD 和cis-EPD，同時推測該類成分可能是何首烏發(fā)揮降糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。此外，已有研究表明，EPD 類具有高度共軛二聚體結(jié)構(gòu)的雙炔酮作為次生代謝產(chǎn)物廣泛存在于陸地和海洋植物、動物和真菌中[3]。因此針對這類成分進行研究，可為相關(guān)新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

研究發(fā)現(xiàn)，尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）為人體內(nèi)源性物質(zhì)膽紅素的唯一代謝酶，當(dāng)其被抑制時可引發(fā)膽紅素代謝異常，造成肝內(nèi)堆積引發(fā)肝損傷[4-8]。本課題組前期研究表明，何首烏中的大黃素-大黃素二蒽酮具有抑制UGT1A1的作用[9]。由于trans-EPD和cis-EPD與大黃素-大黃素二蒽酮結(jié)構(gòu)特征極為相似，因此可能同為UGT1A1酶的底物并對其產(chǎn)生影響。

本研究以trans-EPD 和cis-EPD 為研究對象、UGT1A1 為研究切入點，結(jié)合分子對接、體外酶動力學(xué)實驗及UGT1A1 蛋白和基因變化等結(jié)果，探究trans-EPD 和cis-EPD 是否具有潛在肝毒性風(fēng)險，并從化合物構(gòu)效關(guān)系的角度對這類單體成分進行安全性評價。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY?Ultra Performance LC 型超高效液相色譜儀（Waters 公司）；VICTOR X5 型多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer 公司）；FQD-96A 型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（杭州博日科技股份有限公司）；Nano-100 型分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）；17R型高速低溫離心機（Thermo公司）；Vortex-Genie 2 型渦旋振蕩器（Scientific Industries公 司）；懸滴GravityPlus ?板及GravityTRAP ?板（Insphero公司）；SDC-6節(jié)能型智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 肝微粒體、細胞及試藥

人源肝細胞HepaRG（美國菌種保藏中心）；大鼠肝微粒體（RLM，BD Gentest 公司）；trans-EPD及cis-EPD均由中國食品藥品檢定研究院楊建波博士分離，純度均大于98%；膽紅素（批號100077-201206，純度：99.3%，購自中國食品藥品檢定研究院）；磷酸鉀（純度≥98%）、氯化鎂（純度≥98%）、抗壞血酸（純度≥98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥98%）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH，純度≥98%）、氧化型輔酶Ⅱ（NADPNa2，純度≥98%）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH，純度≥98%）及D-葡萄糖-6-磷酸二鈉（G-6-P，純度≥98%）均購自北京百靈威科技有限公司；丙甲菌素（純度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，純度≥98%）、葡萄糖二酸單內(nèi)酯（純度≥98%）、二甲基亞砜（DMSO，純度≥98%）均購自Sigma Aldrich公司；乙腈、甲醇均為色譜純（默克公司）；其他試劑均為分析純（北京化學(xué)試劑廠）；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）及胎牛血清（FBS）均購自Gibco 公司；瓊脂糖（Spain Biowest公司）；10 000×DuRed核酸染料（北京富百科生物技術(shù)有限公司）；總RNA提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、D2000 DNA Marker、Real SYBR Mixture及2×TaqPCR Mastermix均購于北京厚生博泰生物技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

2 方法

2.1 分子對接

本課題組前期研究中采用Discovery Studio 2.5軟件BLAST Search 模塊，通過同源模建的方法成功構(gòu)建了UGT1A1 蛋白結(jié)構(gòu)，并同時識別出UGT1A1上的9 個活性口袋區(qū)（site A～I）[10]。本研究在此基礎(chǔ)上應(yīng)用該軟件From Receptor Cavities 模塊將trans-EPD 和cis-EPD 單體與UGT1A1 蛋白進行分子對接。由于UGT1A1 為膽紅素唯一代謝酶，因此以膽紅素為陽性對照，以膽紅素對接打分值的80%作為最低標(biāo)準(zhǔn)，將打分高于閾值且相互作用模式與原配體相似的化合物定義為UGT1A1底物[11]。

2.2 UGT1A1體外抑制實驗

應(yīng)用本課題組前期已建立的RLM 孵育體系[4-6]，研究trans-EPD 和cis-EPD 對UGT1A1 的作用及作用強度，同時啟動Ⅰ、Ⅱ相代謝反應(yīng)，以表觀抑制常數(shù)（Ki）為最終評價指標(biāo)。取蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的RLM 30 μL，加入系列濃度的膽紅素對照品溶液（0.36～3.35 μmol·L-1）及EPD 單體溶液（trans-EPD 0.05～2.00 μmol·L-1，cis-EPD 0.05～1.50 μmol·L-1），置于37 ℃恒溫水浴預(yù)孵育3 min，同時加入NADPH和UDPGA再生系統(tǒng)（UDPGA終濃度為5 mmol·L-1）。反應(yīng)啟動15 min 后加入含維生素C 200 μmol·L-1的冰乙腈-甲醇（2∶1）600 μL，沉淀蛋白，渦旋1 min 后13 000 r·min-1（離心半徑為5 cm）離心25 min，取上清液1 μL 進行測定，測定方法見文獻[12-13]。每個樣本重復(fù)3次。

以膽紅素及其代謝產(chǎn)物生成總量對應(yīng)其底物濃度作圖，縱坐標(biāo)為加入EPD 后膽紅素代謝速率的倒數(shù)（1/v），橫坐標(biāo)為膽紅素濃度的倒數(shù)（1/S），采用米氏方程雙倒數(shù)法作圖；加入不同濃度EPD 對應(yīng)不同曲線，以不同曲線斜率對膽紅素濃度繪制slop圖，求得Ki[9]。

2.3 HepaRG細胞毒性考察

取對數(shù)生長期的HepaRG 細胞，消化后調(diào)整密度為5×104個/mL接種于96孔板，每孔接種細胞約為5000 個，孵育24 h 后加入trans-EPD 和cis-EPD。設(shè)置空白對照組（不含HepaRG 細胞）、對照組（0.5% DMSO）、trans-EPD（0.1、0.3、1.0、3.0、6.0 nmol·L-1）組和cis-EPD（0.1、0.3、1.0、3.0、6.0 nmol·L-1）組。細胞孵育24 h（5%CO2，37 ℃），每孔加CCK-8 細胞活力檢測試液10 μL，37 ℃避光孵育2 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測各孔吸光度（A），按公式（1）計算細胞存活率[14]，并計算trans-EPD和cis-EPD對細胞的IC50。

2.4 qRT-PCR實驗

細胞培養(yǎng)及給藥同2.3 項下操作，設(shè)對照組、cis-EPD 組和trans-EPD 組，給藥組濃度均為0.1、1.0、10.0 nmol·L-1。細胞經(jīng)EPD 單體處理24 h 后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，離心收集細胞。

以β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，正向引物：5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，反向引物：5′-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3′；UGT1A1 基因正向引物：5′-CTCCCCTGGATTCTCAGACC-3′，反向引物：5′-CCGTGCCACCCACAAAAC-3′；提取RNA后，經(jīng)Nano-100型分光光度計測定濃度和純度。采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，進行qRT-PCR檢測[15]。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 軟件處理分析，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 UGT1A1蛋白分子對接

采用Discovery Studio 2.5 軟件中的LibDock 功能，在確定trans-EPD 和cis-EPD 的對接口袋區(qū)后，對其與UGT1A1 蛋白的對接結(jié)果進行LibDock score值測定，由結(jié)果可知，trans-EPD 和cis-EPD 對接口袋為site F，與膽紅素對接活性區(qū)相同。膽紅素LibDock score 值為108.623（80% 打分閾值為86.898），trans-EPD為101.469，cis-EPD為103.15，均遠高于閾值，因此提示trans-EPD 和cis-EPD 與UGT1A1 的親和能力與膽紅素底物相當(dāng)。此外，由于trans-EPD 和cis-EPD 與膽紅素結(jié)合位點為同一位點site F，存在競爭結(jié)合的可能，因此提示trans-EPD 和cis-EPD 對于UGT1A1 結(jié)合底物膽紅素均可產(chǎn)生影響，使膽紅素代謝受阻，存在引發(fā)肝損傷的風(fēng)險。

trans-EPD 和cis-EPD 分子體積大，剛性強，存在較大的共軛體系（圖1）。分析對接模式發(fā)現(xiàn)，trans-EPD 和cis-EPD 均與UGT1A1 中的氨基酸殘基GLY332 形成了碳氫鍵，與ILE343、VAL345 形成了多個Pi-Alkyl 鍵，同時和PHE283 形成了更為穩(wěn)定的Pi-Pi T shape鍵，增大了化合物與UGT1A1的疏水結(jié)合作用。從相互作用方式看，trans-EPD 和cis-EPD與UGT1A1蛋白對接模式基本一致（圖2）。

圖1 trans-EPD和cis-EPD結(jié)構(gòu)

圖2 trans-EPD和cis-EPD與UGT1A1蛋白對接模式

3.2 UGT1A1體外抑制實驗

trans-EPD 和cis-EPD 在RLM 中對UGT1A1 酶的抑制情況見圖3。由實驗結(jié)果可知，trans-EPD 和cis-EPD 對UGT1A1 均表現(xiàn)出競爭型抑制作用，Ki值分別為5.22、11.45 μmol·L-1，抑制作用較強（Ki＜1 μmol·L-1，強抑制；Ki＞50 μmol·L-1，弱抑制[16]），與分子對接結(jié)果一致。

圖3 trans-EPD和cis-EPD對UGT1A1的影響

3.3 HepaRG細胞毒性結(jié)果

由HepaRG 細胞毒性結(jié)果（圖4）可知，trans-EPD（IC50為3.248 nmol·L-1）和cis-EPD（IC50為3.984 nmol·L-1）IC50值較小，提示具有肝細胞毒性風(fēng)險。體外毒性實驗數(shù)據(jù)與對接篩選結(jié)果相一致。

圖4 trans-EPD和cis-EPD對HepaRG細胞活性的影響（±s, n=3）

3.4 UGT1A1 mRNA表達變化

由結(jié)果可知（圖5），與對照組比較，trans-EPD和cis-EPD 低、中、高濃度下均可下調(diào)UGT1A1 mRNA 表達水平（P＜0.05），且作用存在劑量效應(yīng)相關(guān)性。結(jié)合體外UGT1A 抑制實驗和細胞毒性數(shù)據(jù)，初步推測trans-EPD 和cis-EPD 可通過作用于UGT1A1 對肝細胞中膽紅素代謝循環(huán)產(chǎn)生影響，存在引發(fā)肝損傷的可能。

圖5 trans-EPD和cis-EPD對HepaRG細胞中UGT1A1 mRNA表達的影響（±s, n=3）

4 討論

在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以膽紅素的唯一代謝酶UGT1A1 為切入點，針對二蒽酮類成分trans-EPD 和cis-EPD 開展了安全性研究。通過分子對接實驗，證明trans-EPD 和cis-EPD 均與UGT1A1 結(jié)合于site F，該位點同時也為膽紅素的結(jié)合位點，提示其存在與膽紅素爭奪代謝酶的可能。trans-EPD 和cis-EPD 與UGT1A1結(jié)合的LibDock score 值與膽紅素接近，提示兩者與UGT1A1 的親和能力與膽紅素相當(dāng)。分析對接模式發(fā)現(xiàn)，trans-EPD和cis-EPD共軛體系較大，分子結(jié)構(gòu)增大的同時剛性增強，2 個化合物均與氨基酸殘基形成了較強的疏水結(jié)合作用；此外共軛體系還與酶蛋白形成了更為穩(wěn)定的Pi-Pi T shape 鍵，增強了化合物與UGT1A1的疏水結(jié)合作用。

體外UGT1A1 抑制實驗結(jié)果顯示，trans-EPD 和cis-EPD 均對UGT1A1表現(xiàn)為競爭型抑制，且抑制作用較強。體外細胞毒性實驗結(jié)果表明，trans-EPD 和cis-EPD 均具有肝細胞毒性作用，低、中、高濃度下可對UGT1A1 mRNA 表達產(chǎn)生顯著抑制作用，并且存在明顯的劑量依賴關(guān)系。

綜上所述，初步推測二蒽酮成分trans-EPD 和cis-EPD 可通過作用于UGT1A1影響膽紅素代謝，進而可能產(chǎn)生肝毒性作用，同時提示具有這類母核結(jié)構(gòu)的化合物可能同樣存在毒性風(fēng)險。本研究結(jié)果將為探討二蒽酮類成分的臨床肝毒性提供參考。