姚黎潔 張茜

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性多因素血管疾病，是引起卒中、心肌梗死、外周動脈疾病和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心腦血管疾病的重要原因[1]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是AS進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，其可增加氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展[2]。因此，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是防治AS的潛在策略。仙茅苷是從仙茅科仙茅屬植物仙茅干燥根莖中提取的酚苷類抗氧化劑，具有抗骨質(zhì)疏松、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[3,4]。已經(jīng)證實(shí)仙茅苷通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放來降低線粒體介導(dǎo)的凋亡水平，從而保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[5]。仙茅苷在體內(nèi)和體外均能減輕實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷[6,7]。然而，仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并不清楚。環(huán)狀RNA(circRNA)是由前體mRNA反向剪切形成的閉環(huán)結(jié)構(gòu)RNA分子，其通過翻譯蛋白、吸附miRNA、與RNA結(jié)合蛋白相互作用等途徑參與細(xì)胞基本過程，circRNA異常表達(dá)與AS進(jìn)展有關(guān)[8]。研究顯示冠心病患者中circ_0004104顯著上調(diào)[9]。circ_0004104可能參與ox-LDL介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)構(gòu)建AS細(xì)胞損傷模型[11]，探討仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并以circ_0004104為切入點(diǎn)探討其可能機(jī)制，以期為AS治療提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC、Ham’s F-12K培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自武漢普諾賽生物公司；ox-LDL購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；仙茅苷(純度98%，貨號C3504)購自南京春秋生物工程有限公司；si-NC、si-circ_0004104、pcDNA-circ_0004104購自上海生工生物公司；膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔多抗(ab9485)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)兔多抗(ab196495)、山羊抗兔IgG二抗(ab205718)、Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)兔多抗(ab104156)購自美國Abcam公司；Trizol試劑、Lipofectamine 2000、RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒購自美國Invitrogen公司；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組:HUVEC采用Ham’s F-12K培養(yǎng)液(添加0.1 mg/ml肝素、0.03 mg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)在含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育，胰蛋白酶消化80%匯合的細(xì)胞，1∶2傳代。將第3代HUVEC接種24孔板，細(xì)胞密度為2×104個(gè)/孔，用Lipofectamine 2000將si-NC、si-circ_0004104、pcDNA-circ_0004104分別轉(zhuǎn)染50%匯合的HUVEC，轉(zhuǎn)染48 h收集HUVEC。正常培養(yǎng)的HUVEC標(biāo)記為對照(con)組；用含 200 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)液孵育HUVEC 24 h[11]，標(biāo)記為ox-LDL組；分別用含0.5 μmol/L、5 μmol/L、50 μmol/L仙茅苷的培養(yǎng)液預(yù)處理HUVEC 24 h[12]，然后給予和ox-LDL組相同的處理，分別標(biāo)記為ox-LDL+仙茅苷0.5 μmol/L組、ox-LDL+仙茅苷5 μmol/L組、ox-LDL+仙茅苷50 μmol/L組；用含 200 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-circ_0004104的細(xì)胞，分別標(biāo)記為ox-LDL+si-NC組、ox-LDL+ si-circ_0004104組；用含50 μmol/L仙茅苷的培養(yǎng)液預(yù)處理轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0004104細(xì)胞24 h，然后給予和ox-LDL組相同的處理，標(biāo)記為ox-LDL+仙茅苷50 μmol/L+ pcDNA-circ_0004104組。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率:向各組細(xì)胞沉淀中加入1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度。分別取5 μl Annexin-V-FITC、5 μl碘化丙啶添加到約含1×105個(gè)細(xì)胞的500 μl細(xì)胞懸液中。避光孵育20 min。上流式細(xì)胞儀檢測各組HUVEC凋亡率。

1.2.3 Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá):預(yù)冷的PBS沖洗各組HUVEC，加入RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，提取的蛋白質(zhì)樣品用BCA試劑盒定量。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離各組HUVEC蛋白樣品，然后利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置轉(zhuǎn)移分離的蛋白至聚偏氟乙烯膜上。膜在5%脫脂牛奶緩沖液中封閉2 h，隨后與抗GAPDH、Bax、Bcl-2的一抗在4℃孵育12 h，漂洗膜后，將膜與二抗室溫孵育2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。Image J軟件分析目的條帶相對于內(nèi)參的灰度值以表示其表達(dá)水平。

1.2.4 試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA水平以及LDH釋放量:HUVEC處理完畢后，分析收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞沉淀至新的離心管內(nèi)。參照LDH活性檢測試劑盒分析細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活性以表示LDH釋放量。預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀后，按照每5×106個(gè)細(xì)胞用1 ml提取液比例加入提取液，超聲破碎細(xì)胞，收集上清置于冰上。參照SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒分析HUVEC內(nèi)SOD活性、MDA水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測circ_0004104表達(dá):采用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA樣品，用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ擴(kuò)增cDNA進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系包括2×TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ?yàn)?0 μl，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl，20×ROX Reference Dye 0.4 μl，cDNA模板2 μl，滅菌水6 μl。circ_0004104的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，GAPDH為內(nèi)參。circ_0004104上游引物5’-AGACCTGTGACCTGGAC AATG-3’，下游引物5’-GTGCA CTTTGTGGCAAAGAA-3’；GAPDH上游引物5’-AAGAAGG TGGTGAAGCAGG C-3’，下游引物5’-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3’。

2 結(jié)果

2.1 仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響 與con組比較，ox-LDL組HUVEC凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，ox-LDL+仙茅苷(0.5、5、50 μmol/L)組HUVEC凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響;A 仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響；B 仙茅苷抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡

表1 仙茅苷對HUVEC凋亡的檢測

2.2 仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中SOD、MDA水平以及LDH釋放的影響 與con組比較，ox-LDL組HUVEC中SOD活性低(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，ox-LDL+仙茅苷(0.5、5、50 μmol/L)組HUVEC中SOD活性升高(P<0.05)，MDA和LDH降低(P<0.05)。見表2。

表2 仙茅苷對HUVEC中SOD活性、MDA水平以及LDH釋放的影響

2.3 下調(diào)circ_0004104對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡及SOD、MDA、LDH的影響 與ox-LDL+si-NC組比較，ox-LDL+si-circ_0004104組HUVEC凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)、SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 下調(diào)circ_0004104對HUVEC凋亡及SOD、MDA、LDH的檢測

圖2 下調(diào)circ_0004104對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響;A 下調(diào)circ_0004104抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡；B 下調(diào)circ_0004104對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.4 仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中circ_0004104表達(dá)的影響 與con組比較，ox-LDL組HUVEC中circ_0004104相對水平顯著升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，ox-LDL+仙茅苷(0.5、5、50 μmol/L)組HUVEC中circ_0004104相對水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 仙茅苷對HUVEC中circ_0004104表達(dá)的檢測

2.5 上調(diào)circ_0004104逆轉(zhuǎn)仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡及SOD、MDA、LDH的影響 與ox-LDL組比較，ox-LDL+仙茅苷 50組HUVEC凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)、SOD活性顯著升高(P<0.05)；與ox-LDL+仙茅苷 50組比較，ox-LDL+仙茅苷 50+pcDNA-circ_0004104組HUVEC凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA水平、LDH釋放量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)、SOD活性顯著降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 上調(diào)circ_0004104可減弱仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的作用;A 上調(diào)circ_0004104可減弱仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用；B 上調(diào)circ_0004104可減弱仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡抑制作用

表5 上調(diào)circ_0004104逆轉(zhuǎn)仙茅苷對HUVEC凋亡及SOD、MDA、LDH的作用

3 討論

本研究探討仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明ox-LDL處理使HUVEC凋亡率、MDA水平、LDH釋放量升高，SOD活性降低，這與井汶等[13]報(bào)道結(jié)果吻合。Bax和Bcl-2是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，Bax可促進(jìn)MPTP形成和細(xì)胞色素c釋放發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用，而Bcl-2具有抗凋亡作用，研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷通過上調(diào)海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善老年癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能[14]。本研究中仙茅苷預(yù)處理顯著降低ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC中Bax表達(dá)水平，增加Bcl-2表達(dá)水平，與仙茅苷的抗凋亡作用吻合。氧化應(yīng)激是AS的一個(gè)關(guān)鍵特征，其可破壞內(nèi)皮功能，進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。研究指出仙茅苷通過抑制過度氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡來改善H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。仙茅苷還可增加抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化，減少細(xì)胞凋亡，抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVEC損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷可降低ox-LDL誘導(dǎo)的MDA水平，抑制LDH釋放，提高SOD活性，表明仙茅苷可改善抗氧化防御系統(tǒng)，抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC氧化應(yīng)激損傷。

研究發(fā)現(xiàn)circRNA表達(dá)參與AS發(fā)展的病理生理過程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變，例如circRNA INK4位點(diǎn)反義非編碼RNA(circANRIL)可減輕AS大鼠血管內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[16]；circ_0003204靶向miR-370-3p抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管狀形成[17]。因此，circRNA具有作為AS治療靶點(diǎn)的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理后HUVEC中circ_0004104水平顯著增加，這與前人報(bào)道結(jié)果[10]一致。目前，關(guān)于circ_0004104的報(bào)道較少，Yue等[18]指出胃癌中circ_0004104表達(dá)上調(diào)，抑制circ_0004104表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞體外增殖和轉(zhuǎn)移能力，抑制谷氨酰胺代謝，抑制胃癌進(jìn)展。circ_0004104通過TGF-β途徑促進(jìn)心肌纖維化在持續(xù)性房顫中發(fā)揮潛在調(diào)控作用[19]。仙茅苷預(yù)處理顯著降低ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC中circ_0004104水平，提示仙茅苷可能通過抑制circ_0004104表達(dá)發(fā)揮作用。與Zhang等[10]報(bào)道一致，本研究顯示抑制circ_0004104表達(dá)可降低ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡和MDA水平，抑制LDH釋放，提高SOD活性。為證實(shí)仙茅苷的抗凋亡、抗氧化應(yīng)激損傷依賴于circ_0004104表達(dá)下調(diào)，本研究將pcDNA-circ_0004104轉(zhuǎn)染HUVEC，結(jié)果表明，過表達(dá)circ_0004104明顯減弱仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡和氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，這進(jìn)一步證實(shí)仙茅苷對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷的保護(hù)作用是通過下調(diào)circ_0004104表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

總之，本研究證實(shí)仙茅苷通過下調(diào)circ_0004104表達(dá)可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡和氧化應(yīng)激損傷，這為仙茅苷在防治AS中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。