劉玉敏 張 韋 邵曉琳

濱州市中心血站 山東 濱州 256602

ABO血型的表型是由正反定型兩者決定的，正定型檢測紅細(xì)胞抗原，反定型檢測血清或血漿中抗體。正反方向ABO血型抗原和抗體的同時(shí)檢測才能完成ABO血型的定型[1]。對(duì)于正反定型不一致的標(biāo)本應(yīng)當(dāng)查找分析原因，加以解決。導(dǎo)致正反定型不一致的原因有技術(shù)問題和獻(xiàn)血者紅細(xì)胞或血漿本身問題。雖然獻(xiàn)血者均是健康個(gè)體，但部分獻(xiàn)血者因輸血史、妊娠史及其他原因?qū)е卵獫{中產(chǎn)生不規(guī)則抗體，自身紅細(xì)胞抗原或血漿抗體減弱，天然抗體的存在以及冷凝集等而致血型定型困難。對(duì)于正反定型不符的血液標(biāo)本必須進(jìn)一步鑒定，確定血型，分析其能否用于臨床或留做其它用途。本研究對(duì)144例ABO正反定型不符和/或凝集減弱血液標(biāo)本原因及相關(guān)血液的處理進(jìn)行回顧性分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2016年1月至2020年9月在212 261名無償獻(xiàn)血者中共檢出正反定型檢測結(jié)果不一致和/或凝集程度減弱者144例。

1.2 儀器與試劑 抗-A、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗-S、抗-P1、A2細(xì)胞、人ABO 反定型用紅細(xì)胞(A1、B、O)和抗體篩查紅細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及譜細(xì)胞等(試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司提供)。 離心機(jī)(KA-2200 日本久保田)、離心機(jī)(LDZ4-0.8 北京醫(yī)用離心機(jī))、電熱恒溫水箱(37℃ 金壇瑞華)、電熱恒溫水箱 (56℃ 天津泰斯特)、試劑專用冰箱(2～8℃ 日本三洋)。

1.3 檢測方法

1.3.1 鹽水試管法ABO正反定型檢測 首先用生理鹽水對(duì)待檢測標(biāo)本紅細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌，然后用鹽水介質(zhì)試管法作進(jìn)一步確認(rèn)，并做O細(xì)胞及自身細(xì)胞。正定型血型檢測根據(jù)實(shí)際情況加做抗AB和抗H。正常情況下正定型血型檢測標(biāo)本其紅細(xì)胞與抗-A或抗-B凝集強(qiáng)度均不小于4+，反定型血漿與A型細(xì)胞或B型細(xì)胞凝集不小于2+，與O細(xì)胞及自身細(xì)胞均為不凝集。鹽水試管法ABO正反定型檢測方法見文獻(xiàn)[2]。若檢測結(jié)果無法對(duì)應(yīng)時(shí)，將其放入4℃冰箱30 min后離心觀察結(jié)果，放置至室溫再次離心觀察結(jié)果。

1.3.2 吸收放散試驗(yàn)、冷凝集素試驗(yàn)、抗體篩查或抗體鑒定試驗(yàn)(鹽水介質(zhì)抗體鑒定方法) 通過對(duì)照抗體鑒定譜細(xì)胞格局表對(duì)可疑抗體再用相應(yīng)檢測試劑檢測該標(biāo)本紅細(xì)胞上是否有相應(yīng)抗原。具體檢測方法見文獻(xiàn)[2]。

1.3.2.1 吸收放散試驗(yàn) 對(duì)于正定型單克隆抗A、抗B直接凝集試驗(yàn)檢測不到抗原，甚至通過降低反應(yīng)溫度或增加抗體強(qiáng)度仍檢測不到的弱抗原，而反定型檢出相應(yīng)抗體的標(biāo)本需做吸收放散試驗(yàn)。檢測方法：取1 mL壓積紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌至少3遍，最后1遍吸棄所有上清；加入1 mL抗血清(懷疑A亞型者加抗A試劑，懷疑B亞型者加抗B試劑)；混勻紅細(xì)胞和抗體試劑放入4℃冰箱1 h，期間每隔10 min混勻一次，同時(shí)將備用生理鹽水放入4℃冰箱；1 h后離心混合物，徹底移除上清試劑后將紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 mL干凈試管，用4℃鹽水洗滌8遍，將末次洗滌液分裝到新試管中(與放散液做平行試驗(yàn)用)；紅細(xì)胞中加入等容積生理鹽水，置56℃水浴箱中10 min，孵育期間定時(shí)輕輕振搖試管，以便使吸附在紅細(xì)胞上的抗體充分放散；立刻用(900～1 000)×g離心2 min，立即分離上清放散液于一干凈試管；和末次洗滌液做平行試驗(yàn)。分別與3個(gè)O細(xì)胞和3個(gè)A1細(xì)胞或B細(xì)胞反應(yīng)(根據(jù)吸收試驗(yàn)所加抗體試劑選擇合適的A1細(xì)胞或B細(xì)胞)。試管上均用記號(hào)筆做好標(biāo)記，兩組試管中分別加入放散液和末次洗滌液2滴，相應(yīng)紅細(xì)胞試劑1滴，立即離心觀察結(jié)果；若沒觀察到凝集，放4℃冰箱30 min后取出立即離心觀察凝集。結(jié)果有效性判定：末次洗滌液與所有6個(gè)細(xì)胞均不發(fā)生反應(yīng)；放散液與所有3個(gè)O細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)；放散液與相應(yīng)抗原紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。在試驗(yàn)有效的前提下，放散液與相應(yīng)紅細(xì)胞試劑有反應(yīng)則證明放散液中有抗A或抗B,說明待檢測標(biāo)本紅細(xì)胞上有A或B抗原表達(dá)。用A1、B或O平行進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)，作為該試驗(yàn)的陽性或陰性對(duì)照。

1.3.2.2 冷凝集素試驗(yàn) 當(dāng)正定血型為A型、B型或AB型而反定血型與同型紅細(xì)胞試劑有凝集或弱凝集時(shí)均做冷凝集素試驗(yàn)，同時(shí)檢測冷凝集素滴度。取4支試管，用記號(hào)筆做好標(biāo)記(滴加A試劑紅細(xì)胞的標(biāo)為Ac；滴加B試劑細(xì)胞的標(biāo)為Bc；滴加O試劑紅細(xì)胞的標(biāo)為Oc；滴加經(jīng)過生理鹽水三洗后的自身細(xì)胞標(biāo)為自c)。每管中加待檢測血漿2滴，再在做好標(biāo)記的試管中加入相應(yīng)紅細(xì)胞1滴,第一步立即離心觀察凝集情況；第二步放入4℃冰箱30 min,取出立即離心觀察結(jié)果；第三步室溫放置約30 min,觀察凝集現(xiàn)象是否消失；第四步室溫下凝集未消失的再放入37℃水浴箱觀察凝集現(xiàn)象。對(duì)于冷凝集強(qiáng)度較高的標(biāo)本進(jìn)行倍比稀釋，操作如下：取10支試管，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，于每管中加入100 μL生理鹽水；于第1管中加入100 μL待檢測標(biāo)本血漿,徹底混勻；然后從第1管中取100 μL混勻樣本加入第2管，再徹底混勻；依次操作至第10管，第10管徹底混勻后棄去100 μL,每管中加入相應(yīng)的紅細(xì)胞置4℃冰箱30 min后立即離心觀察凝集現(xiàn)象.以肉眼可見的有明顯凝集的最后一管的滴度定為該標(biāo)本的冷凝集滴度。

2 結(jié)果

144例送檢標(biāo)本中，ABO正反定型不符者112例，占比為77.78 %。正反定型相符但凝集程度減弱者32例，占比為 22.22%(表1、2)。

表1 112例正反定型不符原因

表2 32例正反定型相符凝集程度減弱原因

為保證輸血安全有效，檢出不規(guī)則抗體的血液其紅細(xì)胞制備成洗滌紅細(xì)胞(效期同去白懸浮紅細(xì)胞)發(fā)往臨床共計(jì)133.5單位(200 mL全血制備的洗滌紅細(xì)胞為1單位；300 mL全血制備的洗滌紅細(xì)胞為1.5單位；400 mL全血制備的洗滌紅細(xì)胞為2單位)。正常發(fā)往臨床：去白懸浮紅細(xì)胞為107.5單位；新鮮冰凍血漿為4 400 mL；病毒滅活血漿為6 050 mL；冰凍血漿為200 mL。質(zhì)量控制檢測用：去白懸浮紅細(xì)胞為10.5單位；新鮮冰凍血漿為5 600 mL；病毒滅活血漿為7 600 mL；冰凍血漿為800 mL；冷沉淀為3單位。報(bào)廢處理：去白懸浮紅細(xì)胞為5.5單位；新鮮冰凍血漿為400 mL；病毒滅活血漿為160 mL。

3 討論

212 261例無償獻(xiàn)血檢測標(biāo)本中,檢驗(yàn)科不能正確定型者144例，但血型室通過鑒定共有112例ABO正反定型不符，約占0.05%，明顯高于李革飛[3]報(bào)道的0.02%，低于劉二雄[4]報(bào)道的獻(xiàn)血者ABO正反不符陽性率0.131%；其余32例可能因?qū)嶒?yàn)室條件差異，不足以判定為正反定型不符。

112例ABO正反定型不符標(biāo)本中用鹽水介質(zhì)抗體鑒定法共有101例檢出不規(guī)則抗體，占無償獻(xiàn)血檢測標(biāo)本的0.048%，略高于蔡茵報(bào)道的無償獻(xiàn)血者中不規(guī)則抗體鹽水介質(zhì)反應(yīng)性確證陽性數(shù)0.031%[5]，明顯低于相關(guān)報(bào)道在正常人體內(nèi)不規(guī)則抗體檢出率0.2%～2.5%[6]，這與本次研究只采用鹽水介質(zhì)中凝集紅細(xì)胞，以 IgM 類抗體居多，而大多數(shù)IgG類抗體不能檢出有關(guān)。不規(guī)則抗體是導(dǎo)致正反定型不符的主要原因(101/112，占比90.18%)。其中抗-M41例(36.61%)，明顯高于劉二雄[4]報(bào)道的26.1%，這可能與研究區(qū)域有關(guān)。人血清抗-M抗體相對(duì)來說是比較常見的自然發(fā)生的抗體。4例自身冷抗體，室溫有活性，37℃無活性，效價(jià)小于16；22例室溫?zé)o活性未確定特異性冷凝集素抗體，其原因分析為檢測方法及不同實(shí)驗(yàn)室溫度條件有關(guān)。8例抗A或抗B抗體減弱標(biāo)本中以抗-B減弱居多占75%，抗A減弱占25%。

ABO亞型也是導(dǎo)致正反定型不符的其一原因。ABO亞型雖然少見，但它會(huì)嚴(yán)重影響輸血的安全性和有效性[7]。ABO亞型主要是經(jīng)血型血清學(xué)試驗(yàn)以抗原性弱為主要特征的多種表型[1]，其共同特點(diǎn)是紅細(xì)胞上A或B抗原數(shù)量減少,正定型中紅細(xì)胞與抗A,抗B試劑的反應(yīng)與正常A或B型紅細(xì)胞相比顯著減弱,有些甚至不凝集。某些ABO亞型血清中除了ABO天然抗體之外,還會(huì)產(chǎn)生抗A1(或抗B)[2]。對(duì)可疑標(biāo)本進(jìn)行鹽水試管法ABO正反定型檢測，依次在室溫、4℃ 30 min、恢復(fù)室溫后三種條件離心觀察判讀結(jié)果，同時(shí)加做抗A,B、抗H、O細(xì)胞及自身對(duì)照，根據(jù)需要做吸收放散試驗(yàn)。根據(jù)ABO血型血清學(xué)試驗(yàn)特點(diǎn)，按文獻(xiàn)[8]判定為亞型標(biāo)準(zhǔn)：共檢出26例ABO亞型：3例通過吸收放散試驗(yàn)檢出相應(yīng)抗原，但不伴有不規(guī)則抗A、B；23例為凝集減弱或混合視野:6例檢出不規(guī)則抗A、抗B,其中5例為抗-A1抗體5/6(83.33%)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為室溫凝集較弱或不凝集，4℃加強(qiáng)，為冷反應(yīng)抗體，1例抗-B抗體1/6(16.67%)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為室溫凝集較弱。與許志遠(yuǎn)等[7]報(bào)道的ABO亞型中分別檢出不規(guī)則抗-A占84.9%，抗-B占15.1%基本相符。據(jù)研究分析發(fā)現(xiàn)對(duì)于造成正反不符的亞型一般不會(huì)漏檢，但表現(xiàn)為正反定型相符，正定血型凝集程度減弱的容易造成亞型漏檢，這就對(duì)檢驗(yàn)科血型檢測提出更高的要求。

不規(guī)則抗體陽性不僅導(dǎo)致血型鑒定困難，還會(huì)在交叉配血時(shí)致使次側(cè)配血不合。臨床在輸注非紅細(xì)胞制品如新鮮冰凍血漿、病毒滅活血漿、冷沉淀及冰凍血漿時(shí)均為同型輸注而不交叉配血。如將含有不規(guī)則抗體的血液輸注給患者時(shí)就有可能產(chǎn)生輸血反應(yīng)。對(duì)這一類血液制品做如下處理：根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》質(zhì)量控制部分規(guī)定全血及成分血抽樣量為每月制備量的1%或至少4袋。為節(jié)約血液，ABO正反定型不符，血漿中檢出不規(guī)則抗體的非紅細(xì)胞制品用于質(zhì)量控制檢測血液質(zhì)量的其他指標(biāo)，這與劉二雄報(bào)道的非紅細(xì)胞制品應(yīng)廢棄[4]不同；紅細(xì)胞制品制備成洗滌紅細(xì)胞(效期同去白懸浮紅細(xì)胞)發(fā)往臨床，這一做法與劉二雄[4]報(bào)道的紅細(xì)胞三洗后可用于臨床相同。既避免了血液的浪費(fèi)，又保證了血液的安全。ABO亞型血液通過吸收放散試驗(yàn)檢出相應(yīng)抗原的，對(duì)該血液進(jìn)行報(bào)廢處理，并進(jìn)行系統(tǒng)屏蔽停止獻(xiàn)血，有專門人員告知獻(xiàn)血者；對(duì)于僅表現(xiàn)為正定型凝集減弱或混合視野，血漿中未檢出不規(guī)則抗體的，該血液正常發(fā)往臨床；血漿中檢出不規(guī)則抗體的，該血液所有產(chǎn)品均做質(zhì)量控制檢測使用。室溫?zé)o活性的冷凝集素抗體血液正常發(fā)往臨床。為避免誤發(fā)往臨床，對(duì)以上所有不能直接發(fā)往臨床或用于質(zhì)量控制檢測用的血液產(chǎn)品均由專門人員將其詳細(xì)信息填寫《內(nèi)外溝通記錄》一式兩份交于下游科室。專門人員在記錄上簽字留檔，按要求將相關(guān)產(chǎn)品予以特殊標(biāo)識(shí)進(jìn)行洗滌或留做質(zhì)量控制檢測用，并進(jìn)行物理性隔離。對(duì)于發(fā)往臨床的該類洗滌紅細(xì)胞，通過臨床跟蹤無一例發(fā)生輸血不良反應(yīng)，臨床治療效果良好。

綜上所述，造成ABO正反定型不符的原因頗多，工作人員在實(shí)際操作中應(yīng)該細(xì)心審慎，綜合分析研判，根據(jù)實(shí)際情況對(duì)相應(yīng)血液做最佳處理，既確保臨床用血安全有效，又最大程度避免血液浪費(fèi)。