董寧霞 李新新 滿玉清 高俊玲

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部 山東 濱州 256603

帶狀皰疹是由長期潛伏在脊髓后根神經(jīng)節(jié)或顱神經(jīng)節(jié)內(nèi)的水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)經(jīng)再激活引起的感染性皮膚病，臨床表現(xiàn)為單側(cè)水泡疹并伴有神經(jīng)性疼痛，常發(fā)病于年齡較大、免疫抑制或缺陷的人群，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。

復方雙嘧達莫乳膏是一種復方外用乳膏制劑，可用于治療帶狀皰疹，療效顯著且不良反應較小，其主要成分為雙嘧達莫、消旋山莨菪堿和鹽酸達克羅寧。該軟膏通過對三種主要成分的聯(lián)合應用，發(fā)揮軟膏的抗皰疹病毒、鎮(zhèn)痛消炎等藥理作用。為保證復方雙嘧達莫軟膏質(zhì)量的穩(wěn)定可控，本研究建立了雙嘧達莫、消旋山莨菪堿和鹽酸達克羅寧的含量測定方法，為該軟膏的質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)，同時也為含雙嘧達莫、消旋山莨菪堿或鹽酸達克羅寧等成分的藥品含量測定提供參考。

1 儀器與材料

島津LC-2010C HT(紫外檢測器)；InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，6 μm)；FA2204B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；AUW220D 型分析天平(日本島津)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

復方雙嘧達莫乳膏(自制，含雙嘧達莫5%、鹽酸達克羅寧0.5%、消旋山莨菪堿1%)；雙嘧達莫對照品、鹽酸達克羅寧對照品、消旋山莨菪堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100244-201003、100423-201102、100249-201303)；甲醇為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 復方雙嘧達莫乳膏含量測定的色譜條件見表1。

表1 復方雙嘧達莫乳膏含量測定的色譜條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取雙嘧達莫對照品74.22 mg和鹽酸達克羅寧對照品7.26 mg，置于同一50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得雙嘧達莫和鹽酸達克羅寧混合對照品儲備液。精密稱取消旋山莨菪堿12.50 mg，放置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得消旋山莨菪堿對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取本品約0.4 g，加甲醇25 mL，超聲處理15 min(功率為200 W，頻率為44 kHz)，冰浴冷卻1 h，取出，迅速濾過，加甲醇定容到25 mL容量瓶中，作為供試品溶液，備用[3-4]。

2.2.3 空白樣品溶液 按照復方雙嘧達莫乳膏的處方工藝制備不含雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、消旋山莨菪堿原料藥的空白樣品，稱取約0.4 g，按“2.2.2”項下方法操作，制備空白樣品溶液，備用。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2.1”項下的對照品貯備液，稀釋雙嘧達莫濃度至742.2 μg/mL、鹽酸達克羅寧濃度至72.6 μg/mL、消旋山莨菪堿濃度至120.5 μg/mL，對色譜系統(tǒng)進行適用性考察[5]。實驗結(jié)果表明，理論板數(shù)按雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、左旋山莨菪堿、右旋山莨菪堿計，分別為10 904、12 286、8 104、8 231；雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、左旋山莨菪堿、右旋山莨菪堿的拖尾因子分別是1.09、1.10、1.06、1.06，色譜峰面積的相對標準偏差分別為1.3%、1.6%、1.7%、1.6%，分離度均大于1.5，色譜系統(tǒng)適用性良好。

2.4 方法學驗證

2.4.1 準確度 精密稱取空白基質(zhì)約0.4 g，分別加入適量雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、消旋山莨菪堿對照品儲備液，攪拌均勻，制成含雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、消旋山莨菪堿均為處方量100%的樣品，平行配制6份。按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1”項下色譜條件進樣，分別測定峰面積并計算回收率(表2～4)。

表2 雙嘧達莫含量測定的回收率(n=6)

表3 鹽酸達克羅寧含量測定的回收率(n=6)

表4 消旋山莨菪堿含量測定的回收率(n=6)

2.4.2 精密度 同一份雙嘧達莫乳膏，平行取樣6次，每次0.4 g，精密稱定。按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。按照“2.1”項下的色譜條件進樣測定。結(jié)果表明，雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、消旋山莨菪堿含量測定的RSD(n=6)分別為1.8%、1.5%、1.8%，該測定方法的精密度良好。

2.4.3 線性與范圍 精密吸取“2.2.1”項下的雙嘧達莫和鹽酸達克羅寧的混合對照品貯備液適量，添加流動相稀釋，制備一系列線性關系工作液，使雙嘧達莫和鹽酸達克羅寧的濃度分別為247.4、494.8、989.6、1 237.0、1 484.4和24.2、48.4、96.8、121.0、145.2 μg/mL。按“2.1”項下色譜條件進樣，分別測定峰面積。以峰面積y對進樣濃度x進行回歸處理，回歸方程、線性、范圍見表5。精密吸取“2.2.1”項下的消旋山莨菪堿對照品貯備液適量，添加流動相稀釋，制備一系列線性關系工作液，使消旋山莨菪堿的濃度為50.0、62.5、125.0、187.5、250.0 μg/mL。按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，峰面積按消旋山莨菪堿順、反式異構體峰面積的和計算。以峰面積y對進樣濃度x進行回歸處理，回歸方程、線性、范圍見表5。

表5 復方雙嘧達莫乳膏含量測定的線性回歸方程

2.4.4 專屬性 分別取“2.2”項下的空白樣品溶液、供試品溶液、對照品儲備液各適量，按照“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖(圖1、2)。空白基質(zhì)及雜質(zhì)不干擾雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、消旋山莨菪堿的含量測定。

A.空白樣品溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液。

A.空白樣品溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液。1.鹽酸達克羅寧；2.雙嘧達莫。

2.4.5 耐用性 本研究分別考察流動相比例變化±5%、柱溫變化±5℃、被測溶液放置0～72 h、流速相對值變化±20%時，儀器色譜行為的變化。試驗結(jié)果顯示：主峰與雜質(zhì)峰可達到基線分離，主峰的拖尾因子小于1.5，各條件下的峰面積測量值(n=5)的相對標準差均小于2.0%。這表明，該色譜系統(tǒng)具有良好的耐用性。

2.5 含量測定 精密稱取3個批次的復方雙嘧達莫乳膏，每份約0.4 g，分別按“2.2”項下制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。按照“2.1”項下的色譜條件進樣測定，用外標法計算含量(表6)。

表6 復方雙嘧達莫乳膏含量(n=3)

3 討論

本研究的提取條件考察實驗顯示，選擇超聲提取時間為15 min時，可保證乳膏樣品提取完全。但由于樣品經(jīng)超聲提取時已近乳化狀態(tài)，較難濾過，故將提取液冰浴1 h，可使提取液分層明顯，易于過濾，以便進行下一步操作。

本研究用紫外分光光度計掃描各對照品溶液的全波長吸收光譜，發(fā)現(xiàn)雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧在275～285 nm之間有最大吸收，而消旋山莨菪堿的最大吸收波長在220 nm左右。對275～285 nm波長范圍進行重點考察，結(jié)果表明，在280 nm波長下，雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧的峰高相對較高，且噪聲小，故選擇280 nm作為雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧的檢測波長，220 nm為消旋山莨菪堿的檢測波長。

InterSustain C18色譜柱進行了端基封尾，惰性較高，可改善離子型化合物的峰型，而且，由于是改性硅膠基體，pH使用范圍(1～10)較廣，可用100%水作為流動相，有助于分離極性和親水性化合物，且更適于選擇含無機鹽緩沖溶液的流動相系統(tǒng)。本研究選擇該色譜柱，能較好地滿足實驗需求。

消旋山莨菪堿需在UV短波長下進行高靈敏度分析，為避免干擾，應選擇不含有機酸類的緩沖溶液。參考《中國藥典(2020年版 二部)》和相關文獻[6-10]，選擇甲醇和0.02 M磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH值至3.0)為流動相，雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧、消旋山莨菪堿均能得到較好分離。

在本研究中，試驗過雙波長梯度洗脫法，設置不同時間段流動相的比例，可同時將3種成分進行分離，但是梯度洗脫耗費的時間較長，整個分離過程超過50 min，且四個主要色譜峰的峰形較寬、對稱性差，最終采用本文中的方法，簡單、快速、準確，實際操作性更強。

消旋山莨菪堿是左旋體和右旋體的混合物。建立的含量測定方法使左旋山莨菪堿和右旋山莨菪堿達到了完全分離，分離度大于1.5。兩個同分異構體分別在13、19 min出峰。含量計算參照《中國藥典(2020年版 二部)》消旋山莨菪堿片含量測定項下方法，按外標法以消旋山莨菪堿左旋體和右旋體峰面積的和進行計算，準確度和精密度均良好。

綜上所述，采用HPLC法測定雙嘧達莫乳膏中雙嘧達莫、鹽酸達克羅寧和消旋山莨菪堿的含量，分離度好，準確度高，對其質(zhì)量控制和藥效評價具有重要意義。