高靈犀，張 妍，汪 文，張 騰

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

胃癌是世界上第五大最常見(jiàn)的癌癥[1]。75%以上的新診斷患者處于晚期，約有50%的晚期胃癌患者失去了手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。放療在胃癌治療中具有重要作用，主要運(yùn)用于術(shù)前新輔助化療及術(shù)后輔助化療[3-4]。然而胃癌的放療抵抗性及電離輻射的非特異性毒性限制了放療的應(yīng)用[5]。因此，研究有效、低毒的放療增敏劑十分迫切。植物化學(xué)物質(zhì)的低毒性和良好的抗癌作用使其成為研究放療增敏的新方向[6]。冬凌草甲素是一種天然的抗腫瘤二萜類(lèi)化合物，可抑制癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、侵襲、遷移等[7-8]，且能增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性[9]，但其作為胃癌放療增敏劑及其機(jī)制研究尚不充分。本研究通過(guò)冬凌草甲素聯(lián)合放療處理SGC7901細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響，探究其增強(qiáng)人胃癌放療敏感性的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 SGC7901人胃癌細(xì)胞(上海澳音生物)，冬凌草甲素(美國(guó)MedChemExpress)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，胎牛血清(FBS，上海雙洳生物)，CCK-8檢測(cè)試劑盒(麥客生物)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物)，EdU細(xì)胞增殖試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒(上海碧云天生物)，兔源Bcl-2抗體、兔源Apaf-1抗體、兔源Cytochrome C抗體(武漢ABclonal)、兔源Bax抗體、兔源Cleaved-caspase3抗體、鼠源β-actin抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑(上海翊圣生物)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901細(xì)胞采用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3 冬凌草甲素溶液的制備 冬凌草甲素粉末用二甲基亞砜(DMSO)稀釋制成濃度為10 mmol/L的儲(chǔ)存液，分裝并保存于-80℃冰箱。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，用不同冬凌草甲素濃度(0、2、4、8、16 μmol/L)或不同放療劑量(0、2、4、6 Gy)處理，72 h后用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力。CCK-8試劑加入2 h后用酶標(biāo)儀(Bio Tek Epoch2)在450 nm處測(cè)定各組的吸光度(OD)，將各組孔OD值減去空白孔OD值，各重復(fù)孔OD值取平均數(shù)。細(xì)胞存活率=(加藥細(xì)胞OD-空白OD)/(對(duì)照細(xì)胞OD-空白OD)×100%；抑制率=(對(duì)照細(xì)胞OD-加藥細(xì)胞OD)/(對(duì)照細(xì)胞OD-空白OD)×100%。

1.5 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置空白對(duì)照組、冬凌草甲素組(6 μmol/L)、放療組(4 Gy)、聯(lián)合組。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后將2×EdU工作液等比例加入孔板的培養(yǎng)基中，繼續(xù)孵育2 h，去除培養(yǎng)液，室溫固定、通透，每孔加入50 μL Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，然后染核，用熒光倒置顯微鏡(Nikon Ti-U)觀察并拍攝圖像，Image J 1.51K軟件計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組如“1.5”。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。細(xì)胞以800個(gè)/孔的密度接種于6孔板，孵育10～12 d。固定、染色、漂洗后自然晾干并拍攝圖像，Image J 1.51K軟件計(jì)數(shù)克隆團(tuán)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比值。

1.7 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組如“1.5”。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS重懸并離心。用預(yù)冷70%乙醇吹打混勻，4℃固定30 min后離心，預(yù)冷PBS重懸并離心。每組加入0.5 mL碘化丙啶染色液重懸，37℃避光溫浴30 min，流式細(xì)胞儀(Beckman CytoFLEX)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組如“1.5”。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。72 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次。用400 μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC染色液并混勻，4℃避光孵育15 min，加入5 μL碘化丙啶染色液于4℃避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 qPCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組如前。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后用Trizol試劑提取總RNA，合成cDNA，最后用qPCR儀(ABI QuantStudio 3)分析基因表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)歸一化到GAPDH表達(dá)。使用計(jì)算公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平。相關(guān)引物序列如表1所示。

表1 qPCR所用引物序列

1.10 Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組如前。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后提取細(xì)胞總蛋白并用Bicinchoninic acid(BCA)法檢測(cè)濃度。蛋白(30 μg)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h，一抗在水平搖床上4℃孵育過(guò)夜。次日與二抗室溫孵育2 h。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5500)檢測(cè)蛋白表達(dá)量，Image J 1.51K軟件分析灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素抑制人胃癌細(xì)胞增殖 不同放療劑量處理SGC-7901人胃癌細(xì)胞72 h，與空白對(duì)照組相比，放療組細(xì)胞活力均下降，并隨放療劑量升高而下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1A。放療組的SGC-7901人胃癌細(xì)胞半數(shù)抑制劑量為4.70 Gy。不同濃度冬凌草甲素處理SGC-7901人胃癌細(xì)胞72 h后，與空白對(duì)照組相比，冬凌草甲素組細(xì)胞活力均下降，并隨藥物濃度升高而下降(P<0.01)。見(jiàn)圖1B。冬凌草甲素組的SGC-7901人胃癌細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為8.67 μmol/L。

A.不同放療劑量對(duì)SGC-7901人胃癌細(xì)胞活力的影響。F=84.361，P<0.001；B.不同冬凌草甲素濃度對(duì)SGC-7901人胃癌細(xì)胞活力的影響。F=242.964，P<0.001。*P<0.05，**P<0.01 vs. NC。

2.2 冬凌草甲素增強(qiáng)人胃癌細(xì)胞的放療敏感性 SGC-7901人胃癌細(xì)胞經(jīng)冬凌草甲素(6 μmol/L)和(或)放療(4 Gy)處理后，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：冬凌草甲素組和放療組的細(xì)胞克隆形成能力較空白對(duì)照組下降(P<0.05);而聯(lián)合組的細(xì)胞克隆形成能力較放療組降低更顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖2A。EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組[(54.20±1.20)%]相比，冬凌草甲素組[(41.10±1.10)%]和放療組[(26.40±1.40)%]的細(xì)胞增殖率下降(P<0.05)，而聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率[(18.65±1.35)%]低于放療組(P<0.05)。見(jiàn)圖2B。

A.平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素和(或)放療對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響，F(xiàn)=123.975,P<0.001；B.EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)熒光圖像及統(tǒng)計(jì)結(jié)果,F=154.860,P<0.001。NC為空白對(duì)照組；Ori為冬凌草甲素組；IR為放療組；IR+Ori為聯(lián)合組；*P<0.05 vs. NC；#P<0.05 vs. IR。

2.3 冬凌草甲素誘導(dǎo)SGC-7901人胃癌細(xì)胞的G2/M期阻滯 SGC-7901人胃癌細(xì)胞用冬凌草甲素(6 μmol/L)和(或)放療(4 Gy)處理，48 h后檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組[(5.75±0.03)%]相比，冬凌草甲素組[(10.83±0.59)%]和放療組[(13.25±0.49)%]G2/M期細(xì)胞比例升高(P<0.05)；而聯(lián)合組G2/M期細(xì)胞比例[(21.61±0.21)%]高于放療組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素和(或)放療對(duì)人胃癌細(xì)胞周期的影響，F(xiàn)1=291.035,F2=22.553,F3=408.532,均P<0.01。*P<0.05 vs. NC；#P<0.05 vs. IR。NC為空白對(duì)照組；Ori為冬凌草甲素組；IR為放療組；IR+Ori為聯(lián)合組。

2.4 冬凌草甲素增強(qiáng)SGC-7901人胃癌細(xì)胞凋亡 SGC-7901人胃癌細(xì)胞用冬凌草甲素(6 μmol/L)和/或放療(4 Gy)處理，72 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組[(5.60±0.31)%]相比，冬凌草甲素組[(17.89±1.35)%]和放療組[(30.01±1.51)%]的細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；而聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率[(50.73±2.69)%]高于放療組(P<0.05)。見(jiàn)圖4A。qPCR和Western blot結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，冬凌草甲素組和放療組的凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Bax、Cytochrome C、Cleaved-caspase3表達(dá)升高(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降(P<0.05)。聯(lián)合組的Apaf-1、Bax、Cytochrome C、Cleaved-caspase3表達(dá)升高較放療組更明顯(P<0.05);Bcl-2表達(dá)下降較放療組更顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖4B、C。

A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)人胃癌細(xì)胞凋亡圖像，F(xiàn)=258.505，P<0.001；B.qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)，F(xiàn)1=123.943，F(xiàn)2=40.731，F(xiàn)3=314.877，F(xiàn)4=82.319，F(xiàn)5=151.778，P<0.001；C.Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，F(xiàn)1=109.544，F(xiàn)2=31.830，F(xiàn)3=247.234，F(xiàn)4=61.209，F(xiàn)5=117.249，P<0.001。*P<0.05 vs. NC；#P<0.05vs. IR。NC為空白對(duì)照組；Ori為冬凌草甲素組；IR為放療組；IR+Ori為聯(lián)合組。

3 討論

胃癌一直是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，患者5年生存率低于30%[10]。除了手術(shù)治療以外，放療是胃癌的主要治療方法之一，特別是中晚期胃癌[11]。臨床上常用放療與順鉑、紫杉醇等常規(guī)化療相結(jié)合來(lái)增加癌細(xì)胞死亡，但對(duì)提升放療敏感性收效微弱，且增加了對(duì)正常組織的毒性[12]。因此，研究新型放療增敏劑是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在肺癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥中均可發(fā)揮顯著抗癌作用[13-15]，冬凌草甲素在非小細(xì)胞肺癌中可通過(guò)增強(qiáng)DNA損傷達(dá)到放療增敏的效果[9]。然而，有關(guān)冬凌草甲素作為胃癌放療增敏劑的研究仍不充分，其潛在機(jī)制尚不清楚。本研究以人胃癌細(xì)胞SGC7901作為研究對(duì)象，探討了冬凌草甲素作為胃癌放療增敏劑的可能性及其潛在機(jī)制。

在本研究中，我們首先驗(yàn)證了冬凌草甲素抑制SGC7901細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴(lài)性。隨后我們進(jìn)行了細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制作用高于放療組，提示冬凌草甲素預(yù)處理可以提高SGC7901細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。影響放療敏感性的主要因素有細(xì)胞凋亡、周期分布、缺氧、DNA損傷修復(fù)和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[12]。G2/M期是細(xì)胞周期中輻射最敏感的階段，因此可以誘導(dǎo)G2/M期阻滯的藥物是潛在的放療增敏劑。在本研究中，單獨(dú)使用冬凌草甲素處理使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，與以往報(bào)道相符合[16-17]。值得注意的是，聯(lián)合組的G2/M期較放療組增加，S期和G1期均略微減少。G2/M期的細(xì)胞對(duì)放療更為敏感，而G1、S期的細(xì)胞對(duì)放療相對(duì)耐受，因此冬凌草甲素對(duì)SGC7901細(xì)胞的放療增敏作用可能部分是由于細(xì)胞周期的G2/M期阻滯所致。

細(xì)胞凋亡是放療介導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的主要形式之一[18]。放療增敏劑可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)提高放療的療效[19]。在本研究中，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯高于放療組。研究表明，冬凌草甲素可通過(guò)多種信號(hào)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[20-21]。在細(xì)胞凋亡線粒體途徑中，Cytochrome C的釋放或抑制取決于Bcl-2和Bax之間的平衡。當(dāng)?shù)蛲龃碳ぎa(chǎn)生，線粒體外膜滲透性增加，Cytochrome C釋放至胞質(zhì)，與Apaf-1相結(jié)合并激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。在本研究中，與放療組相比，聯(lián)合組的凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Cytochrome C、Bax、Cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果提示冬凌草甲素增強(qiáng)了放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，線粒體凋亡途徑關(guān)鍵分子Cytochrome C在聯(lián)合組明顯升高，提示存在線粒體損傷。

綜上所述，冬凌草甲素可增強(qiáng)SGC7901人胃癌細(xì)胞的放療敏感性，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)G2/M期阻滯，增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，這為冬凌草甲素在放療增敏中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。未來(lái)仍需要更多的分子機(jī)制研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)冬凌草甲素的放療增敏作用。