史英武，吳 勛，屈 延，葛順楠

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)具有高致死率和致殘率的特點[1]，減輕腦外傷后繼發(fā)性腦損傷，促進神經(jīng)功能恢復，是減輕患者家庭和社會負擔、提高患者生活質量的關鍵[2]。20羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)是花生四烯酸在細胞色素酶作用下的代謝產(chǎn)物[3]。腦卒中患者血漿中20-HETE水平升高，并且與不良預后相關，表明20-HETE水平可能是腦卒中患者預后不良的危險因素[4]，但在TBI患者中20-HETE是否發(fā)揮作用仍然不清楚。

自噬是細胞內(nèi)高度保守的自我降解過程，可參與多種生理或病理過程。一方面 ，生理水平的自噬可以清除體內(nèi)多余的蛋白質，另一方面，過度自噬會干擾細胞正常的生理過程，甚至導致細胞死亡[5]。近年來自噬的分子機制和生理功能在各類疾病中逐步得到闡明，但TBI中過度自噬是否與脂質代謝產(chǎn)物相關的研究仍未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性C57BL/6小鼠購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，8～12周齡，體質量20～25 g，在恒溫室內(nèi)進行12 h光照/12 h黑暗循環(huán)飼養(yǎng)1周，自由獲得食物和水。本實驗使用了36只小鼠，隨機分為3組：假手術組(Sham組)、TBI組和TBI+HET0016(20-HETE清除劑)組，每組12只小鼠。所有實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《實驗動物護理和使用指南》進行，并得到空軍軍醫(yī)大學倫理委員會的批準(許可證號：TDLL2017-03-190)。

1.2 方法

1.2.1 TBI造模 通過可控皮質沖擊法液壓裝置進行TBI造模。具體方法如下：采用50 g/L水合氯醛深度麻醉小鼠后，沿正中位置縱向剪開頭頂部皮膚，隨后用顱鉆在前囟向后1.5 mm、中線向右1.5 mm處開一直徑為2 mm的骨窗，然后將液壓沖擊器的沖擊管口小心放置在骨窗內(nèi)，打擊速度3 m/s，深度1.8 mm，停留時間為2 s。打擊結束后用骨蠟封閉骨窗，縫合傷口皮膚并消毒。Sham組小鼠接受開顱術而不接受皮質打擊。TBI模型小鼠隨機分為TBI組和TBI+HET0016組，在模型建立后2 h，TBI+HET0016組小鼠接受1.5 mg/kg的HET0016治療[6]。

1.2.2 ELISA 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 mg/L，每孔加0.1 mL，4 ℃過夜。24 h后加待檢樣品0.1 mL于上述已包被的反應孔中，37 ℃下孵育1 h，洗滌。反應孔中加入新鮮稀釋的酶標二抗抗體0.1 mL，37 ℃下孵育30 min，洗滌。加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃下孵育10～30 min。終止反應：于各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。結果采用酶標儀進行判定，于450 nm處進行讀數(shù)并繪制標準曲線，依照標準曲線測量樣品數(shù)值，從而得出樣品含量。

1.2.3 小鼠神經(jīng)功能缺損評分 TBI模型建立24 h后進行小鼠神經(jīng)功能缺損評分，具體評分項目包括：出圈、偏癱、直線行走、驚嚇反射、探究行為、方桿平衡、圓桿平衡、方桿行走。上述任務完成計0分，失敗計1 分，總分為8分，評分越高，提示神經(jīng)功能損傷越重。

1.2.4 小鼠腦含水量測定 用50 g/L水合氯醛深度麻醉小鼠后采用斷頸法處死，迅速于冰上分離大腦。收集大腦皮層，并用濾紙吸干以除去表面血液和腦脊液。用分析天平測量皮層濕質量。隨后將皮層置于烤箱中，于100 ℃烘烤24 h，以獲得干質量。大腦水腫程度用腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量× 100%計算。

1.2.5 TUNEL染色 小鼠經(jīng)50 g/L水合氯醛腹腔麻醉后，經(jīng)心臟灌注取腦，固定脫水后冰凍切片(厚度35 μm)；切片常規(guī)漂洗3次，每次10 min，滴加新配的蛋白酶K工作液20 mg/L，室溫孵育10 min;按照試劑盒說明配制TUNEL檢測液(Roche公司)，在小鼠腦組織切片上滴加適量檢測液，37 ℃孵育60 min;滴加DAPI染液室溫避光孵育10 min，使用抗淬滅劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。

1.2.6 免疫熒光染色 小鼠經(jīng)50 g/L水合氯醛腹腔麻醉后，灌注取腦，固定脫水后冰凍切片(厚度35 μm)；切片常規(guī)漂洗3次，每次10 min，然后用3 mg/L Triton X-100通透20 min，使用20 g/L BSA常溫孵育切片60 min。將切片置于兔抗LC3抗體(1∶400，CST公司)中4 ℃孵育過夜；常規(guī)漂洗后加入Alexa 488標記的驢抗兔IgG抗體(1∶400，CST公司)，室溫孵育4 h；然后將切片加入DAPI (1∶1 000)中孵育10 min，PBS漂洗后裱片，風干后用熒光封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3在損傷周邊皮質的表達。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。

2 結果

2.1 TBI后腦組織中20-HETE表達上升

小鼠損傷周邊皮質ELISA結果顯示，Sham組、TBI組和TBI+HET0016組20-HETE的表達水平分別為(3.34±2.08)、(20.67±3.78)和(9.30±1.23)μg/g。統(tǒng)計分析顯示相對于Sham組，TBI組中20-HETE的表達水平顯著升高(P<0.01)；相對于TBI組，TBI+HET0016組中20-HETE的表達水平顯著降低(P<0.01)。

2.2 20-HTET清除劑可以減輕TBI小鼠神經(jīng)功能異常和腦水腫

神經(jīng)功能學評分結果顯示，Sham組、TBI組和TBI+HET0016組評分分別為(1.13±0.79)、(6.00±1.23)和(3.21±1.15)分。統(tǒng)計分析顯示，相對于Sham組，TBI組中神經(jīng)功能學評分顯著升高(P<0.01)；相對于TBI組，TBI+HET0016組中神經(jīng)功能學評分顯著降低(P<0.05)，提示TBI小鼠接受20-HETE治療可以顯著減輕神經(jīng)功能障礙。腦含水量測定結果顯示，Sham組、TBI組和TBI+ HET0016組腦含水量分別為(71.64±1.53)%、(87.20±2.33)%和(73.51±1.67)%。統(tǒng)計分析表明，相對于Sham組，TBI組中腦含水量顯著升高(P<0.01)；相對于TBI組，TBI+HET0016組中腦含水量顯著降低(P<0.01)，提示腦水腫減輕。

2.3 20-HETE清除劑可以減輕創(chuàng)傷腦組織周圍的細胞凋亡

TUNEL染色結果顯示Sham組、TBI組和TBI+ HET0016組損傷周邊的凋亡細胞數(shù)目分別為(5±3)、(125±15)和(49±10)個/mm2。統(tǒng)計分析顯示相對于Sham組，TBI組小鼠損傷周邊皮質的凋亡細胞數(shù)目顯著上升(P<0.01)，在接受HET0016治療后，TBI小鼠損傷周邊組織的凋亡細胞數(shù)目顯著降低(P<0.01)，提示抑制20-HETE的表達可以減輕損傷周邊的凋亡水平(圖1)。

A：Sham組；B：TBI組；C：TBI +HET0016組。Sham：假手術；TBI：創(chuàng)傷性顱腦損傷。TUNEL ×50。圖1 小鼠損傷周邊皮質的TUNEL染色

2.4 20-HETE清除劑可以減輕創(chuàng)傷腦組織周圍LC3的表達

免疫熒光結果顯示Sham組、TBI組和TBI+HET0016組損傷周邊的LC3陽性細胞數(shù)目分別為(2.67±1.82)、(72.33±12.5)和(16.67±3.05)個/mm2。統(tǒng)計分析顯示，相對于Sham組，TBI組小鼠LC3陽性細胞數(shù)目顯著上升(P<0.01)，在接受HET0016治療后，TBI小鼠損傷周邊組織LC3陽性細胞數(shù)目顯著降低(P<0.01)，提示抑制20-HETE的表達可以減輕損傷周邊自噬水平(圖2)。

LC3：微管相關蛋白輕鏈3；Sham：假手術；TBI：創(chuàng)傷性顱腦損傷。×200。圖 2 小鼠損傷周邊皮質的LC3(綠色)與細胞核(藍色)的免疫熒光染色

3 討論

TBI是一種嚴重的全球性疾病，具有高致死率和高致殘率的特點，在損傷急性期會引起損傷周邊皮質廣泛的神經(jīng)元凋亡，在損傷慢性期會導致全腦的病理變化從而引起繼發(fā)性腦損傷。目前針對TBI急性期患者的治療主要是通過手術治療來減輕血腫和降低顱內(nèi)壓，但是手術治療只能挽救患者的生命，對于損傷周邊皮質神經(jīng)元死亡造成的長期神經(jīng)功能損傷，目前仍沒有較好的治療辦法。

腦組織在人體各系統(tǒng)代謝中最為旺盛，需要大量的能量供給以維持正常的代謝和電生理活動[7]。20-HETE是花生四烯酸重要的代謝產(chǎn)物之一，在缺血性腦卒中中被證明與炎癥反應有關[8]。在TBI中的研究主要集中在損傷線粒體功能和破壞血腦屏障功能等方面[6,9]，其是否與自噬有關還未見報道。本實驗結果首先使用ELISA法檢測損傷周邊皮質20-HETE表達含量的變化，結果證明在TBI后損傷周邊皮質20-HETE顯著上升，提示20-HETE可能參與了TBI后的病理變化；HET0016與細胞色素酶結合后特異性地抑制20-HETE的合成。在本實驗中腹腔注射HET0016也降低了TBI損傷周邊皮質20-HETE水平，與預期結果一致。

腦組織水腫是TBI過程中重要的繼發(fā)性病理變化，是導致長期神經(jīng)功能缺損的重要原因[10]。在本實驗結果中，TBI組小鼠腦組織含水量相對于Sham組顯著上升，而TBI小鼠在腹腔注射HET0016后含水量顯著降低，提示20-HETE上升可能與TBI導致的腦組織水腫有關，抑制20-HETE可以減輕腦水腫，進而降低神經(jīng)功能缺損評分，改善TBI導致的神經(jīng)功能障礙。

在生理條件下，生物體通過細胞凋亡清除體內(nèi)多余、受損或危險的細胞，并維持基本的細胞功能[11]，TBI后會發(fā)生復雜的病理生理變化，損傷周圍組織廣泛性的細胞死亡是其主要特征[4]，細胞凋亡是這一過程的主要形式。在本實驗中，我們采用TUNEL法觀察TBI小鼠損傷周圍皮質的凋亡細胞數(shù)目，結果顯示TBI后凋亡細胞的數(shù)量顯著上升，在TBI小鼠中使用HET0016抑制20-HETE的表達后，可以減輕TBI后損傷周邊組織凋亡細胞的數(shù)目，提示HET0016具有抑制細胞凋亡的作用。這與之前的一項缺血性細胞模型中的研究結果一致[12]。

自噬是溶酶體降解體內(nèi)非必需維持的方式[13]，在生理狀態(tài)下表達水平很低，然而關于TBI后自噬的過程和作用仍缺乏直接證據(jù)，有報道稱TBI后自噬被過度激活[14]，也有人認為TBI之后自噬通路可能被抑制[15]。目前已有超過30種自噬相關基因被發(fā)現(xiàn)，LC3作為自噬檢測的標志被廣泛應用。細胞凋亡和細胞自噬是哺乳動物清除自身物質的兩個重要生理過程，然而過度自噬不能產(chǎn)生細胞保護作用，還會降解細胞核[16]，并引起自噬性細胞凋亡，使細胞損傷加重[17]。本研究首先發(fā)現(xiàn)了TBI后損傷周圍皮質過度自噬的現(xiàn)象，并首次報道了HET0016具有減輕過度自噬的作用，這為減輕TBI后的細胞凋亡提供了新的思路和靶點。

綜上所述，在本實驗條件下，HET0016處理可以減低TBI后損傷周邊皮質的20-HETE表達水平，緩解腦組織水腫以及神經(jīng)功能障礙，機制研究表明，降低20-HETE表達可緩解TBI導致的過度自噬，并減輕損傷周圍皮質的細胞凋亡。