劉豪杰，陳雪蕾，包薩如拉

1.鄂州市中心醫(yī)院，湖北 鄂州 436000； 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，雖近些年我國胃癌發(fā)病率呈逐年下降趨勢，但總體發(fā)病率仍高于世界平均水平[1]。中藥作為我國特有的衛(wèi)生資源，具有巨大的發(fā)掘潛力，白花蛇舌草、半枝蓮在臨床中常作為藥對進(jìn)行配伍，增強(qiáng)清熱解毒、消癰散結(jié)的作用。高宏等在重建中氣抗癌湯Ⅰ號中應(yīng)用白花蛇舌草-半枝蓮藥對觀察其對胃癌術(shù)后化療不良反應(yīng)的作用發(fā)現(xiàn)，其可降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率、改善患者腸道菌群[2]。乙酸乙酯可提取中藥中的有效成分，是藥理學(xué)研究中常用的有機(jī)溶劑和萃取劑，研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力有抑制作用，在激發(fā)腫瘤細(xì)胞線粒體自噬的同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體凋亡[3]。腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病，細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)，將導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常、細(xì)胞增殖失控，最終導(dǎo)致腫瘤的形成[4]。雖有研究證實(shí)白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，但其對于細(xì)胞周期的影響鮮有報(bào)道。本研究擬從細(xì)胞周期變化及細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白表達(dá)角度著手，深入挖掘白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的抑制作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞人胃癌SGC-7901細(xì)胞，購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，貨號：BNCC100674。

1.2 藥物與試劑白花蛇舌草(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：河南，貨號：200620)；半枝蓮(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：浙江，貨號：191022)。兔抗細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗體、兔抗c-Myc多克隆抗體及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(英國Abcam公司，貨號：ab134175、ab185656、ab179467)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：A0208)；BCA 蛋白定量檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號：R21250-250T)；結(jié)晶紫染色液(上海紫一試劑廠，貨號：100137)；CCK-8試劑盒(美國AbMole公司，貨號：a953268)；RNase A溶液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1030)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)(北京中科瑞泰生物科技有限公司，貨號：SP4170)。

1.3 儀器WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)；SD Cell型轉(zhuǎn)移電泳槽(美國Thermo Fisher Scientific公司)；VE-180型垂直電泳裝置(上海天能科技有限公司)；muLISKAN-MK3型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；Waters ACQUITY型超高液相色譜儀(美國Waters公司)；FYL-YS-150L型恒溫箱(北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司)；TGL-21M型高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，離心半徑：10 cm)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司)。

2 方法

2.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分制備及檢測白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分制備方法參考文獻(xiàn)[5]，具體如下：將白花蛇舌草、半枝蓮按質(zhì)量比11取材后進(jìn)行3次煎煮，無菌紗布過濾，獲得水提物，減壓濃縮得到浸膏。取適量浸膏用石油醚回流脫脂后，再以乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，濃縮干燥后獲得白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分，并計(jì)算提取率。提取率=目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量/原料物質(zhì)質(zhì)量×100%。白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分檢測：取白花蛇舌草-半枝蓮乙酸乙酯浸膏及對羥基苯乙酮、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 mL甲醇，充分溶解后過濾、離心，采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)進(jìn)行分析。UPLC色譜條件：柱溫 40 ℃，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min，5%～95%乙腈；20～22 min，100%乙腈；22～25 min，100%C～5%乙腈)，該部分實(shí)驗(yàn)由內(nèi)蒙古民族大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

2.2 SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)與分組取對數(shù)生長期胃癌SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對照組及白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組，分別予以0 mg·L-1、10 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分處理，每組設(shè)5個(gè)平行孔。5%CO2、37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，每天換液1次，培養(yǎng)48 h后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8法檢測SGC-7901細(xì)胞增殖能力取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，按“2.2項(xiàng)”所述方法對細(xì)胞進(jìn)行分組及藥物干預(yù)，培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后每孔加入CCK-8試劑 10 μL，孵育2 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白孔3個(gè)。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度值。

細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%

2.4 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)按“2.2項(xiàng)”所述方法對細(xì)胞進(jìn)行分組及藥物干預(yù)，培養(yǎng)48 h后，將各組細(xì)胞分別制備成1.0×103L-1細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔1 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，5%CO2、37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)24 h后，棄除培養(yǎng)液，加入不含藥物的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，直至肉眼可見細(xì)胞集落形成。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗6孔板后加入甲醇溶液，固定20 min，PBS清洗，加入結(jié)晶紫染色液，固定5 min，PBS清洗后用 ImageJ 統(tǒng)計(jì)每孔克隆形成數(shù)，計(jì)算每組細(xì)胞的克隆形成率。

克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC-7901細(xì)胞周期按“2.2項(xiàng)”所述方法對細(xì)胞進(jìn)行分組及藥物干預(yù)，培養(yǎng)24 h后，棄上清，使用胰酶消化細(xì)胞，離心后棄上清，加體積分?jǐn)?shù)75%預(yù)冷乙醇溶液，振蕩，4 ℃固定過夜。加入RNase A溶液，1 500 r·min-1離心 10 min，棄上清，室溫條件下每管加30 μL PI進(jìn)行染色，4 ℃避光孵育30 min，上機(jī)檢測各組細(xì)胞周期的分布情況，數(shù)據(jù)用 MultiFit LT 軟件進(jìn)行分析。

2.6 蛋白免疫印跡檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)按“2.2項(xiàng)”所述方法對細(xì)胞進(jìn)行分組及藥物干預(yù)，培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后棄上清，加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組細(xì)胞樣本的蛋白上樣量為25 ng，采用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)膜后封閉于脫脂牛奶中，分別加入Cyclin D1及 c-Myc 一抗(稀釋比例為11 000)，4 ℃封閉過夜，經(jīng)TBS溶液洗膜3次后加入山羊抗兔二抗(稀釋比例為1500)，TBS洗膜3次后ECL顯像，用凝膠圖像處理系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行處理，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分制備結(jié)果白花蛇舌草-半枝蓮藥對提取物經(jīng)乙酸乙酯萃取后提取率為0.61%。UPLC分析結(jié)果顯示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯提取物中含有對羥基苯乙酮、野黃芩苷、木犀草素和芹菜素4種化合物，符合白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分成分。見圖1。

圖1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分UPLC分析圖譜

3.2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響與對照組比較，培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組 SGC-7901 細(xì)胞的增殖抑制率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

3.3 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞克隆能力的影響與對照組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞集落形成率均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞集落形成率均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組SGC-7901細(xì)胞集落形成率顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖3 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞克隆能力的影響

3.4 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞周期變化的影響與對照組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖4 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞周期分布的影響

3.5 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響與對照組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖5 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達(dá)的影響

4 討論

白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗腫瘤作用是目前的研究熱點(diǎn)，大量研究證實(shí)，白花蛇舌草-半枝蓮藥對提取物對乳腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌及肝癌均有良好的抑制生長作用[6-9]。研究顯示，白花蛇舌草-半枝蓮可能通過調(diào)控胃癌細(xì)胞蛋白聚糖信號通路、磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、抑癌基因蛋白53(protein 53，p53)信號通路等抑制胃癌細(xì)胞生長[10]，但具體的作用機(jī)制和靶點(diǎn)仍需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)甚至臨床研究進(jìn)行深入探討。

本研究首先通過UPLC對所得到的提取物進(jìn)行分析，鑒定后確認(rèn)采用本實(shí)驗(yàn)所述提取方法得到的提取物為白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分。利用不同含量白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不同含量白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分(10 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1)培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞 24 h、48 h及72 h后，細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高，且藥物劑量越高，增殖抑制率隨之增高，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可有效降低SGC-7901細(xì)胞增殖能力，抑制腫瘤細(xì)胞生長，且具劑量依賴性。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞，其克隆能力明顯降低，與CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率趨勢相同，進(jìn)一步從可視角度證實(shí)該藥對乙酸乙酯組分對胃癌細(xì)胞增殖抑制的有效性。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞增殖是目前抑制腫瘤細(xì)胞生長的主要作用機(jī)制[11-14]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期的改變密切相關(guān)，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥單體、單味中藥、中藥復(fù)方可將腫瘤細(xì)胞阻滯于不同細(xì)胞周期，對抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有深入研究意義[4]。細(xì)胞周期包括 G1期 (DNA 合成前期)、S期(DNA 合成期)、M期(分裂期)、G2期(DNA合成期)及G0期(休眠期)。目前研究證實(shí)，G0/G1期、S期、G2/M期是3個(gè)調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞阻滯在上述周期節(jié)點(diǎn)內(nèi)，可明顯抑制細(xì)胞增殖[15-17]。本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分干預(yù)SGC-7901細(xì)胞 24 h 后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例降低，且呈劑量依賴型，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可將胃癌細(xì)胞分裂周期阻滯在G0/G1期，且能抑制DNA的合成與分裂，這可能是該藥對組分降低腫瘤細(xì)胞增殖及克隆能力的原因之一。

Cyclin D1是腫瘤細(xì)胞周期最重要的調(diào)控因子之一，可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)及CDK6形成蛋白復(fù)合物，使蛋白激酶磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，對細(xì)胞增殖具有正調(diào)控作用[18-19]。另有臨床研究顯示，Cyclin D1在胃癌組織中呈高表達(dá)，并且其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。c-Myc基因是Myc癌基因家族的重要成員之一，也是常見的原癌基因之一，其可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移過程，并且對細(xì)胞的異常分化具有促進(jìn)作用[21-22]。此外，c-Myc可與Cysclin啟動(dòng)子相結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而加速細(xì)胞分化[23-24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，降低細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化程度，腫瘤細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)減少，并可將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，降低腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力，說明抑制c-Myc表達(dá)可能是抑制腫瘤細(xì)胞生長的重要途徑[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分干預(yù)胃癌SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平降低，且存在劑量依賴性，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc的表達(dá)具有抑制作用。

綜上所述，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可能通過下調(diào)胃癌SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1及c-Myc表達(dá)水平，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，在合成前期抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。另外本研究也有不足之處，如本研究雖對G0/G1期的關(guān)鍵檢測蛋白Cyclin D1及c-Myc進(jìn)行檢測，但并未對其上下游傳導(dǎo)信號通路進(jìn)行檢測，未能知曉其具體機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究加以證實(shí)。