何 林，彭 偉，張學(xué)建，陶飛燕*，吳純潔*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都 610066

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引發(fā)血管疾病的主要原因，其病變以動脈部分脂質(zhì)沉積為特征，伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)增殖，逐漸發(fā)展為動脈粥樣硬化斑塊[1]。AS的臨床表現(xiàn)包括缺血性心臟病、缺血性中風(fēng)和外周血管病等[2]。AS的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，具有多種信號傳導(dǎo)途徑，實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明其可能與炎癥、氧化應(yīng)激、先天和適應(yīng)性免疫、感染等有關(guān)。目前傾向于“損傷反應(yīng)-炎癥學(xué)說”，性質(zhì)與炎癥相似，但尚無定論[3,4]。

西洋參(Panacis Quinquefolii Radix)是五加科人參屬植物的干燥根，含有豐富的人參皂苷[5]。研究表明，多種人參皂苷具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理活性[6]。西洋參傳統(tǒng)干燥方式為烘干，但干燥后的成品表皮皺縮，顏色焦黃，質(zhì)地堅(jiān)硬，切片或粉碎困難。冷凍干燥(凍干)可在低溫和真空下將物料脫水干燥。采用冷凍干燥制備的西洋參(freeze-drying Panacis Quinquefolii Radix，F(xiàn)DPQ)表皮平整，顏色鮮亮，質(zhì)地疏松，復(fù)水性好，服用方便，脫水徹底，易于貯藏和運(yùn)輸。此外，F(xiàn)DPQ中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量總和亦顯著高于烘干西洋參[7]。綜上，F(xiàn)DPQ在外觀品相和內(nèi)在成分上較烘干西洋參均有優(yōu)勢，具有廣闊的市場前景。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DPQ可改善動脈粥樣硬化小鼠氧化應(yīng)激損傷，減少主動脈弓部位粥樣斑塊以及脂質(zhì)沉積，但機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從系統(tǒng)層面揭示藥物對機(jī)體的調(diào)控作用，為研究中藥成分與疾病之間的相互關(guān)系提供新的思路[8]。本文擬采用UPLC-QE-Orbitrap-MS/MS技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探索FDPQ治療AS的藥效物質(zhì)、作用靶點(diǎn)和潛在通路，并輔以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為進(jìn)一步開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，研究作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 研究設(shè)計(jì)的詳細(xì)流程圖

1 材料和方法

1.1 FDPQ的制備

鮮西洋參從中國吉林省靖宇縣購買，由成都中醫(yī)藥大學(xué)吳純潔教授鑒定為五加科人參屬植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的根。將鮮西洋參冷凍干燥，粉碎后過50目分析篩(孔徑為0.355 mm)。冷凍干燥工藝：-80 ℃預(yù)凍2 h后入倉，真空度抽至10 Pa，溫度由-50 ℃升至20 ℃，維持32 h。

1.2 皂苷類成分鑒定

1.2.1 試劑試藥

色譜純甲醇和乙腈購自美國Thermo Fisher Scientific；甲醇、甲酸等分析純試劑購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2.2 供試品溶液制備

精密稱取FDPQ粉末1.0 g置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇30 mL，超聲提取60 min，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

1.2.3 UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS分析

色譜條件：色譜柱為Thermo ScientificTMAccucoreTMC18(3 mm×100 mm，2.6 μm)；流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A為0.1%甲酸-乙腈，流動相B為0.1%甲酸-水；梯度洗脫程序?yàn)椋?～3 min，10% A→20% A；3～25 min，20% A→38% A；25～30 min，38% A→85% A；30～30.1 min，85% A→100% A。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀為Thermo Scientific Q Exactive-MS高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher)。電噴霧離子源，選擇正負(fù)離子模式(HESI+/ESI-)，在100～1 500m/z范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描分析；離子源溫度：120 ℃，噴霧電壓：3.0 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；最大噴射電流：100 A；探針加熱器溫度：350 ℃；洗脫溶劑溫度：400 ℃；鞘氣和輔助氣體均為氮?dú)猓魉俜謩e為35.00 L/min和10.00 L/min。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.1 候選靶點(diǎn)庫和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

利用SwissTargetPrediction平臺預(yù)測在FDPQ中鑒定出的皂苷類成分的潛在靶點(diǎn)。以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞，從GeneCards數(shù)據(jù)庫中收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)。對成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)求交集，建立候選靶點(diǎn)庫。將候選靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，選擇high confidence(0.700)，將生成的文件導(dǎo)入Cytoscape軟件(3.8.2)，篩選出MCC下的top 50樞紐基因(hub genes)，并可視化獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖；同時(shí)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，?jì)算出“degree”“betweenness centrality”“closeness centrality”值，進(jìn)而得到核心靶點(diǎn)。使用的數(shù)據(jù)庫和在線分析平臺見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫和在線分析平臺

1.3.2 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Metascape平臺[9]對篩選出的50個(gè)樞紐基因進(jìn)行基因本體論富集(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書通路分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)。均選取P<0.01的結(jié)果，并使用微生信云平臺對重要結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 分子對接

利用Discovery Studio(4.5 Client)軟件將篩選出的活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。首先，使用“Prepare Ligands”模塊生成活性成分的三維結(jié)構(gòu)并加氫。從RCB PDB數(shù)據(jù)庫下載靶點(diǎn)的大分子蛋白質(zhì)(具有原配體)，篩選條件為：Homo sapiens、X-Ray Diffraction，分辨率在0.25～0.40 nm之間。刪掉水分后，使用“Prepare Protein”模塊去除蛋白多構(gòu)象，補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基，為蛋白加氫。拆分蛋白和原配體，利用LibDock方法將原配體和活性成分一同與蛋白進(jìn)行對接，以LibDockScore評估活性成分和目標(biāo)蛋白的親和力。LibDock方法相關(guān)參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.1 試劑與材料

胎牛血清(FBS)(批號：O30629)、RPMI1640培養(yǎng)基(批號：8121592)購自美國紐約GIBCO；H2O2(批號：BCCG3062)購自美國sigma；抗生素(青霉素-鏈霉素溶液)(批號：16D28C16)、PBS緩沖液(批號：16GO2A30)、胰蛋白酶(含EDTA)(批號：17A20167)、CCK-8試劑盒(批號：16H19B60)購自武漢博士德生物；RAPI lysis buffer裂解液(批號：90013B)、超氧化物歧化酶(SOD)(批號：032219190614)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號：030819190614)、BCA蛋白測定試劑盒(批號：070919919113)購自上海碧云天；JC-1探針(批號：2019042)購自江蘇凱基生物；過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(批號：20201218)購自南京建成生物工程研究所；Trizol(批號：213409)購自美國Thermo Fisher；DEPC水(批號：681165)購自上海吉至公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：S2028)、SYBR Green q-PCR Master Mix試劑盒(批號：S2014)購自蘇州宇恒生物。

1.5.2 FDPQ提取物凍干粉制備

精密稱取FDPQ粉末適量，按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備提取液，將濾液減壓濃縮至無醇味后，冷凍干燥36 h得到提取物凍干粉，凍干工藝同“1.1”項(xiàng)下。

1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。用含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基在環(huán)境為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每三天傳代一次，取3到5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 細(xì)胞活力測定

采用CCK-8法檢測PC12細(xì)胞的活力，確定H2O2處理PC12細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間，以及FDPQ提取物的最佳干預(yù)濃度。將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種到96孔板中(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)。細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的FDPQ提取物(5～120 μg/mL)培養(yǎng)24 h，或加入不同濃度的H2O2培養(yǎng)12、24、48 h。干預(yù)后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃暗箱培養(yǎng)1 h。最后，使用iMARK酶標(biāo)儀(美國伯樂)在450 nm波長下檢測各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。在測定FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的影響時(shí)，先用FDPQ提取物預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h，再用確定的最佳H2O2濃度和處理時(shí)間干預(yù)細(xì)胞，最后檢測干預(yù)后的細(xì)胞活力。

1.5.5 線粒體膜電位測定

將PC12細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，用不同濃度的FDPQ提取物和最佳濃度的H2O2干預(yù)后，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入200 μL的JC-1染色工作液(10 μg/mL)，使其能夠完全覆蓋住細(xì)胞表面，避光孵育20 min，吸除殘余染液，吸取適量的1×Assay Buffer清洗細(xì)胞三次，加入含有DAPI的封閉劑孵育，最后在Olympus IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)下觀察，記錄圖像。

1.5.6 抗氧化酶活性的測定

將PC12細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板(每孔1×106個(gè)細(xì)胞)，然后用不同濃度的FDPQ提取物和最佳濃度H2O2處理。干預(yù)結(jié)束后棄去上清液，用預(yù)冷的PBS溶液沖洗細(xì)胞3次，用RAPI裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，收集細(xì)胞總蛋白。按試劑盒說明書測定細(xì)胞的SOD、CAT活性和MDA水平；同時(shí)用BCA試劑盒測定細(xì)胞總蛋白含量。

1.5.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測mRNA表達(dá)

通過qRT-PCR法測定PI3K和Akt的mRNA表達(dá)。將PC12細(xì)胞接種在6孔板中(每孔1×106個(gè)細(xì)胞)，用不同濃度的FDPQ提取物和最佳濃度的H2O2處理。隨后收集細(xì)胞，使用Trizol Plus RNA純化試劑盒分離總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，SYBR Green q-PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。qRT-PCR分析所用引物見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-ΔΔCT的相對定量分析表示。

表2 qRT-PCR分析所用基因引物序列

1.5.8 統(tǒng)計(jì)和分析

所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism(9.3.1)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n= 3)表示。組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P< 0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS/MS鑒定結(jié)果

本文使用高分辨質(zhì)譜對FDPQ皂苷類成分進(jìn)行分析鑒別。將化合物的相對分子質(zhì)量、保留時(shí)間和二級質(zhì)譜裂解碎片信息等與Thermo Scientific建立的化合物庫(mz Cloud和mz Vault)以及相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]中的進(jìn)行比對，在FDPQ中鑒定出28種皂苷類化合物?？傠x子流圖見圖2，化合物的詳細(xì)信息見表3。

圖2 總離子流圖

表3 FDPQ中的人參皂苷

2.2 候選靶點(diǎn)庫和PPI分析

通過SwissTargetPrediction和GeneCards數(shù)據(jù)庫的篩選，刪除重復(fù)值后，獲得了27個(gè)皂苷類化合物的相關(guān)靶點(diǎn)157個(gè)，疾病相關(guān)靶點(diǎn)4 719個(gè)。構(gòu)建韋恩(Venny)圖(見圖3)，得到二者交集靶點(diǎn)117個(gè)，作為候選靶點(diǎn)。按“1.3.1”項(xiàng)下的方法，使用Cytoscape軟件從候選靶點(diǎn)中篩選出top 50樞紐基因，并可視化獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。如圖所示，該網(wǎng)絡(luò)有50個(gè)靶點(diǎn)和329條邊。以“degree”“betweenness centrality”“closeness centrality”值大于中位數(shù)為閾值進(jìn)行篩選，將獲得的21個(gè)交集靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，結(jié)果見表4?！癲egree”值越高，表明其關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)越多，重要程度越高，其中，SRC、STAT3、HSP90AA1、EGFR、MAPK1、JUN、GRB2、AKT1、PIK3CA、VEGFA排名靠前(degree > 21)，表明這些靶點(diǎn)可能發(fā)揮著重要作用。

圖3 藥物和疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖4 樞紐基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表4 FDPQ治療動脈粥樣硬化的核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

為了研究靶基因的生物學(xué)功能，對50個(gè)樞紐基因進(jìn)行了三種GO功能分析，包括生物過程(biological processes，BP)、細(xì)胞組分(cellular components，CC)和分子功能(molecular functions，MF)，將富集顯著的結(jié)果可視化(P< 0.01)，見圖5A。BP主要包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、酶聯(lián)受體蛋白信號通路(enzyme linked receptor protein signaling pathway)、細(xì)胞遷移正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)等。CC主要有受體復(fù)合物(receptor complex)、黏著斑(focal adhesion)、細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)(receptor complex)等。MF主要涉及蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(phosphotransferase activity)等。KEGG通路富集分析可說明FDPQ在治療AS時(shí)，作用于何種通路。50個(gè)樞紐基因篩選出了15條(P< 0.01)富集顯著且與疾病相關(guān)性大的信號通路，結(jié)果如圖5B和表5所示。主要信號通路包括PI3K-Akt信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化相關(guān)通路(lipid and atherosclerosis)、MAPK信號通路、VEGF信號通路等。

圖5 樞紐基因GO(A)和KEGG(B)通路分析

表5 樞紐基因KEGG通路分析

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖

為了進(jìn)一步篩選FDPQ皂苷類成分治療AS的作用機(jī)制，利用Cytoscape軟件構(gòu)建了藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖(見圖6)，直觀地展示了各部分間的關(guān)系。此網(wǎng)絡(luò)由90個(gè)節(jié)點(diǎn)和470條邊構(gòu)成，其中包括動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)(粉色圓角方形節(jié)點(diǎn))，西洋參(Panacis Quinquefolii Radix，PQ)(藍(lán)色方形節(jié)點(diǎn))，23個(gè)皂苷類化合物(紫色圓角方形節(jié)點(diǎn))，50個(gè)靶點(diǎn)(紅色長方形節(jié)點(diǎn))和15條作用通路(綠色V形節(jié)點(diǎn))。以degree值篩選關(guān)聯(lián)緊密的節(jié)點(diǎn)。G20、G22、G19、G5、G3、G6度值大，表明人參皂苷Rk3(G-Rk3)、人參皂苷Rh4(G-Rh4)、人參皂苷Rg4(G-Rg4)、20(R)-人參皂苷Rh1(20(R)-G-Rh1)、擬人參皂苷F11(P-F11)、20(S)-人參皂苷Rh1(20(S)-G-Rh1)可能是FDPQ治療AS的重要成分；STAT3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、VEGFA排名靠前，提示他們是治療疾病的重要靶點(diǎn)；PI3K-Akt信號通路、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化相關(guān)通路(lipid and atherosclerosis)、MAPK信號通路、VEGF信號通路則是治療疾病的重要信號通路。

圖6 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對接結(jié)果和分析

依據(jù)前文結(jié)果，選擇STAT3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、VEGFA等靶點(diǎn)與G-Rk3、G-Rh4、G-Rg4、20(R)-G-Rh1、P-F11、20(S)-G-Rh1進(jìn)行對接，預(yù)測靶點(diǎn)和成分間的結(jié)合能力，通過與原配體的對接分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較，來評估化合物和靶點(diǎn)蛋白的親和力。對接分?jǐn)?shù)如表6所示，與原配體相比，6個(gè)化合物均與靶點(diǎn)VEGFA(原配體PDB ID：MES)有強(qiáng)烈的親和力，與靶點(diǎn)PIK3CA(原配體PDB ID：VY4)有較好的或與原配體相似的親和力；G-Rg4與靶點(diǎn)STAT3(原配體PDB ID：KQV)、MAPK1(原配體PDB ID：KE8)展現(xiàn)出較好的親和力；20(R)-G-Rh1、P-F11和靶點(diǎn)AKT1(原配體PDB ID：G4K)的親和力與原配體的相似。因此，推測G-Rk3、G-Rh4、G-Rg4、20(R)-G-Rh1、P-F11可能是FDPQ治療AS的主要活性成分，PIK3CA、VEGFA是主要的潛在靶點(diǎn)。靶點(diǎn)和活性成分的典型對接結(jié)果如圖7所示。其中，20(R)-G-Rh1相較于原配體和靶點(diǎn)VEGFA有著最高的對接得分。20(R)-G-Rh1以良好的姿態(tài)鑲嵌于靶點(diǎn)VEGFA的結(jié)合區(qū)域中，殘基CYS68、ILE46、ASP63、TYP45在對接過程中發(fā)揮了重要作用。殘基ASP63的羧基與配體的C12羥基氫形成了弱氫鍵，氫鍵距離為4.45 nm；TYR45的酚羥基與配體的羥基氫形成了弱氫鍵，氫鍵距離為5.48 nm。殘基CYS68和ILE46分別在配體的兩端發(fā)生了疏水相互作用，見圖7(E-3)。

表6 活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

圖7 6個(gè)活性化合物與5個(gè)靶點(diǎn)蛋白的分子對接作用模式

2.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.6.1 FDPQ對H2O2處理的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用

如圖8A所示，F(xiàn)DPQ提取物的濃度在5、10、20、40、60、80、100、120 μg/mL時(shí)，對PC12細(xì)胞無明顯的抑制作用，各組的細(xì)胞活力是近似的，說明提取物在該濃度范圍內(nèi)對PC12細(xì)胞基本無毒性。因此，我們選擇40 μg/mL(低劑量組)、60 μg/mL(中劑量組)、80 μg/mL(高劑量組)作為本研究的干預(yù)濃度。圖8B顯示了不同濃度的H2O2在不同處理時(shí)間對PC12細(xì)胞活力的影響。40 μmol/L H2O2刺激24 h后，PC12細(xì)胞活性下降約40%，因此確定本研究的最佳干預(yù)濃度為40 μmol/L，最佳干預(yù)時(shí)間為24 h。如圖8C所示，與模型組相比，F(xiàn)DPQ提取物能增加H2O2處理的PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性。表明FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有改善作用。

圖8 FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用

2.6.2 FDPQ可升高PC12細(xì)胞線粒體膜電位

線粒體膜電位(MMP，ΔΨm)下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的早期特征。同時(shí)，MMP在維持線粒體正常生理功能方面亦具有重要意義，MMP的降低常被作為線粒體功能障礙的重要指標(biāo)[13]。JC-1探針是一種理想的熒光探針，廣泛用于檢測細(xì)胞MMP的變化。在正常的生理?xiàng)l件下，JC-1聚集在細(xì)胞線粒體的基質(zhì)中，形成一種能發(fā)出紅色熒光的聚合物。當(dāng)MMP被還原時(shí)，JC-1不能聚集到線粒體基質(zhì)上，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。通過比較熒光強(qiáng)度的變化可以檢測MMP的變化(見圖9)。在H2O2作用24 h后，PC12細(xì)胞的紅色熒光顯著減弱，對應(yīng)的綠色熒光顯著增強(qiáng)，表明細(xì)胞發(fā)生了MMP損失。但與模型組相比，不同濃度的FDPQ提取物(40、60、80 μg/mL)預(yù)處理后，細(xì)胞的紅色熒光逐漸增強(qiáng)，提示FDPQ可以降低H2O2誘導(dǎo)的MMP損失。

圖9 FDPQ對PC12細(xì)胞的膜電位的影響

2.6.3 FDPQ可降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)會被激活，抑制活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生，SOD、CAT是重要的活性氧清除酶。MDA是氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過氧化形成的脂質(zhì)過氧化物，具有細(xì)胞毒性，會攻擊并破壞細(xì)胞膜[14]。MDA水平檢測亦可評估細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[13]。因此，為了評價(jià)FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，我們檢測了FDPQ提取物(40、60、80 μg/mL)干預(yù)后H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的MDA的生成以及SOD、CAT的活性。如圖10所示，與正常組比較，PC12細(xì)胞在H2O2刺激24 h后，細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高，F(xiàn)DPQ預(yù)處理可抑制MDA的產(chǎn)生，并具有濃度依賴性(見圖10A)。此外，H2O2刺激可降低細(xì)胞中抗氧化酶CAT、SOD的活性，F(xiàn)DPQ預(yù)處理可以提高這些酶的活性(見圖10B、10C)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)DPQ可通過提高活性氧清除酶的活性來降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖10 FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的MDA水平(A)、抗氧化酶CAT(B)、SOD(C)的活性的影響

2.6.4 FDPQ可上調(diào)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

為了闡明FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用的分子機(jī)制，采用qRT-PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。如圖11所示，與正常組相比，H2O2誘導(dǎo)后，PI3K、Akt的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。不同濃度的FDPQ提取物(40、60、80 μg/mL)預(yù)處理PC12細(xì)胞后，這些基因的mRNA表達(dá)較模型組上調(diào)，且具有濃度依賴性。提示FDPQ可能通過調(diào)控PI3K/Akt的表達(dá)來改善H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的氧化損傷。

圖11 FDPQ對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中PI3K(A)和Akt(B)的mRNA表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

目前，每年死于缺血性心腦血管疾病的人數(shù)居全球首位，以AS引起的心肌梗塞和腦梗塞是死亡率最高的血管類疾病[15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DPQ或具有干預(yù)或治療動脈粥樣硬化的作用。FDPQ相較于傳統(tǒng)烘干西洋參，部分皂苷類成分含量有所提高，但由于干燥方式機(jī)理的不同，尚不確定皂苷類成分種類是否改變；同時(shí)，中藥數(shù)據(jù)庫中有效成分的信息來源單一，甚至陳舊，不能全面、及時(shí)地反映FDPQ中所含成分[16]。因此，本文先通過UPLC-QE-Orbitrap-MS/MS鑒定出FDPQ中的皂苷類成分，再以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接探索其治療AS的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制，并輔以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS/MS分析鑒定出了28種人參皂苷，包括人參皂苷Rb1、Rc、Rd等原人參二醇型，人參皂苷Re、Rh1、Rg4等原人參三醇型以及奧克梯隆型的擬人參皂苷F11。基于數(shù)據(jù)庫的篩選，獲得FDPQ治療AS的候選靶點(diǎn)117個(gè)，包括STAT3、EGFR、MAPK1、AKT1、PIK3CA、VEGFA等21個(gè)核心靶點(diǎn)。表明FDPQ治療AS具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)分析顯示，人參皂苷Rk3、人參皂苷Rh4、人參皂苷Rg4、擬人參皂苷F11、20(R/S)-人參皂苷Rh1等成分關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)較多，可能是FDPQ治療AS的重要成分。現(xiàn)有研究表明人參皂苷Rk3具有抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，可顯著降低NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的表達(dá)，顯著降低血清中AST和ALT水平，減少氧化應(yīng)激發(fā)生[17]。人參皂苷Rg4可顯著清除ROS，抑制ROS誘導(dǎo)的p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活，有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性[18]。擬人參皂苷F11是西洋參的特有成分，研究表明其可通過減輕自噬/溶酶體缺陷和抑制鈣超載，對中風(fēng)起到神經(jīng)保護(hù)作用，亦可通過激活BDNF/TrkB通路，改善腦卒中后長期神經(jīng)功能損傷，促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)發(fā)生，尤其是在缺血性腦卒中的慢性康復(fù)中有著巨大的潛在作用[19]。GO和KEGG富集結(jié)果提示FDPQ治療AS的機(jī)制主要與PI3K-Akt信號通路、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化相關(guān)通路(lipid and atherosclerosis)、MAPK信號通路、VEGF信號通路等相關(guān)，顯示出FDPQ治療AS具有多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。分子對接結(jié)果表明活性成分與潛在靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果具有一定的可靠性。

越來越多的研究支持AS是一種始于血管內(nèi)皮損傷的慢性炎癥疾病[20]，相關(guān)炎癥是由促炎細(xì)胞因子、炎癥信號通路、生物活性脂質(zhì)和黏附分子介導(dǎo)的。近年來的研究證實(shí)，PI3K/Akt信號通路在炎癥反應(yīng)中起著重要作用。PI3K是一類特異性催化磷脂酰肌醇脂類物質(zhì)的蛋白激酶，Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱蛋白激酶B。PI3K特異性催化PI產(chǎn)生的PIP3可使Akt完全活化，從而引起PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)，如調(diào)節(jié)NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的釋放[21]。調(diào)控這些信號通路可以達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激損傷，減輕脂質(zhì)沉積和內(nèi)皮損傷的作用[22]。NF-κB通路的激活在炎癥反應(yīng)中起著重要作用[23]。蛋白激酶MAPK是轉(zhuǎn)導(dǎo)信號引起細(xì)胞反應(yīng)的重要物質(zhì)。MAPK家族亞系p38MAPK應(yīng)激敏感性激酶被激活后，可通過磷酸化或促炎細(xì)胞因子(如TNF-α)來活化NF-κB，NF-κB被激活后亦通過其產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子反向激活p38MAPK，二者間的雙向作用加速了AS的發(fā)展[24]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)由多種細(xì)胞分泌，并與內(nèi)皮細(xì)胞中的同源酪氨酸激酶VEGF受體(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)結(jié)合，產(chǎn)生各種下游效應(yīng)，促進(jìn)新生血管的形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，進(jìn)而促進(jìn)心臟或腦組織缺血再灌注后的功能恢復(fù)[25]。VEGF-Akt是經(jīng)典的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生的信號通路。研究顯示，VEGF通過下游的PI3K-Akt信號級聯(lián)，以BAD途徑抑制細(xì)胞凋亡，以mTORC2和FOXO1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生[26]。在本研究中，對篩選出的可能機(jī)制展開了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明FDPQ可升高H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的線粒體膜電位，提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)MDA水平，同時(shí)上調(diào)PI3K/Akt的表達(dá)，提示FDPQ治療動脈粥樣硬化可能與其改善氧化損傷、抑制凋亡和炎癥有關(guān)。

本研究初步闡釋了FDPQ治療AS多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)，本研究的另一個(gè)局限性是未包括多糖、蛋白質(zhì)等大分子化合物，亦需要進(jìn)一步的研究。