張瑞，石嘉琪，王雪蓉，顧夏夢(mèng)，陳曉嵐

(1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226001；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)被報(bào)道[1-2]具有促進(jìn)血管生成，減少炎癥反應(yīng)，從而加速腎功能恢復(fù)和損傷部位的修復(fù)，防止腎臟進(jìn)一步受損的作用。BM-MSCs 主要通過細(xì)胞因子的旁分泌或自分泌來改變微環(huán)境，調(diào)節(jié)炎癥和纖維化對(duì)組織和細(xì)胞的損傷[3-4]。BM-MSCs 分泌的外泌體富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 和miRNA 等生物活性分子，可以調(diào)節(jié)組織或生物體的微環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體修復(fù)[5-6]。越來越多的研究[7-8]顯示miRNAs 在慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用，有報(bào)道[9]稱微小RNA-93-5P(microRNA-93-5P,miR-93-5P)可以作為一種非侵入性的生物標(biāo)志物，用于檢測(cè)順鉑刺激的近端腎小管損傷。此外，上調(diào)miR-93-5P 能夠抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)誘導(dǎo)的小管細(xì)胞纖維化[10]。因此，本研究通過建立小鼠腎臟單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction models,UUO)模型，用BM-MSCs 外泌體(BM-MSCs exosomes,BMexo)的miR-93-5P 進(jìn)行干預(yù)，以探討其對(duì)腎臟纖維化的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料來源 MiR-93-5P 抑制劑、陰性對(duì)照(NC)抑制劑(RiboBio，廣州，中國)，水通道蛋白1(aquaporin,AQP1)(Proteintech，武漢，中國)，TRIzol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green real-time PCR Master Mix試劑盒(諾唯贊，南京，中國)，α 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)、纖連蛋白(fibronectin,FN)、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)和α-Tubulin(Abcam，英國)。

1.2 BM-MSCs 的提取、培養(yǎng)和鑒定[11]用等體積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)稀釋正常人骨髓并輕輕混合。之后，加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋的骨髓輕輕置于淋巴細(xì)胞分離器上，離心后分為4 層，吸出第二層(白色透明層)并與2～3 mL PBS 混合。離心，棄上清，將沉淀重懸于2～3 mL PBS 中。該步驟重復(fù)2 次。離心后棄上清液，加入低糖培養(yǎng)基(89% DMEM/低糖+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液)重懸細(xì)胞沉淀。培養(yǎng)3 d 后不棄培養(yǎng)基，直接加入3～5 mL 低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，5～7 d 后細(xì)胞完全貼壁時(shí)更換培養(yǎng)基。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD 抗原(亦稱白細(xì)胞分化抗原)CD29、CD90、CD34、CD45 特異性抗體染色BM-MSCs，流式細(xì)胞儀分析。

1.3 外泌體的分離和鑒定[12]取培養(yǎng)的第3～5 代BMMSCs，將培養(yǎng)基更換為DMEM/低糖，培養(yǎng)24～48 h。使用差速離心法分離外泌體，在透射電子顯微鏡下觀察外泌體的形態(tài)。分離后，將10 μL 外泌體稀釋在1 mL 過濾后的PBS 中，通過Zetaview(PMX120-Z，德國)測(cè)量大小分布。Western Blot 鑒定外泌體分子標(biāo)志物CD9 和CD63。通過蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法(Bicinchoninic acid,BCA)測(cè)量總蛋白確定外泌體的數(shù)量，每次使用的外泌體量為200 μg/每只小鼠。分別用200 nmol/L miR-93-5P 抑制劑或NC 抑制劑轉(zhuǎn)染BM-MSCs 48 h，然后收集BM-exo。

1.4 動(dòng)物模型的建立 健康雄性BaLB/c 小鼠，6～8周齡，質(zhì)量(20±2) g，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物倫理審批號(hào)：220191465)。使用0.08 mL/10 g質(zhì)量的10%戊巴比妥麻醉小鼠。將小鼠固定并消毒，在恥骨聯(lián)合上方腹部中線左側(cè)5～6 mm 處切開腹壁。分離左側(cè)輸尿管并用4-0 絲線結(jié)扎，然后整層縫合。假手術(shù)組(Sham 組)的左輸尿管被隔離但不結(jié)扎。在UUO術(shù)后的第1、3、5 天給UUO 模型組尾靜脈注射PBS(0.1 mL/小鼠)，BM-exo 組小鼠尾靜脈注射正常人BM-exo(200 μg 外泌體溶于0.1 mL PBS/小鼠)，BMexo/miR-93-5P 抑制劑組小鼠注射含有miR-93-5P抑制劑的MSC-BM-exo(200 μg 外泌體溶于0.1 mL PBS/小鼠)。7 d 后處死小鼠。收集血液樣本以確定血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)。收集腎組織并在液氮中速凍，并儲(chǔ)存在-80 ℃以提取RNA 和蛋白質(zhì)。

1.5 外泌體的熒光標(biāo)記 BM-MSCs 用細(xì)胞示蹤劑Dil-C18(碧云天，中國)標(biāo)記1 h，用PBS 洗滌3 次。從Dil 標(biāo)記的BM-MSCs 的條件培養(yǎng)基中收獲外泌體，并在UUO 術(shù)后的第1、3、5 天分別注射到小鼠體內(nèi)(200 μg 外泌體溶于0.1 mL PBS/小鼠)，第7 天處死取腎進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

1.6 Western Blot 用蛋白裂解液提取腎組織蛋白，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取50 μg 腎組織樣本，用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜。封閉、滴加一抗(α-SMA、FN、E-cadherin，均1∶500)后在4 ℃過夜，滴加二抗并孵育，TBST 清洗，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。Image J 軟件掃描條帶灰度值，以α-Tubulin 作為內(nèi)參照，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫組化和病理組織學(xué)染色 腎組織石蠟切片脫蠟水化后，分別行α-SMA(1∶1 000)、FN(1∶1 000)、E-cadherin(1∶500)免疫組化染色以及HE、過碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)和Masson 染色。每只小鼠任選4 張切片，每個(gè)切片任選5 個(gè)視野，在200×視野下檢測(cè)α-SMA、FN 和E-cadherin 陽性染色的表達(dá)強(qiáng)度，觀察腎組織細(xì)胞形態(tài)、分布以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并隨機(jī)拍攝腎組織圖像。以Image Pro Plus 6.0 為工具對(duì)陽性區(qū)域的積分光密度(integral optical density,IOD)進(jìn)行量化，并測(cè)量每個(gè)視野下腎小球PAS 陽性染色(紫紅色部分)面積和腎小球面積，Masson 染色下陽性膠原沉積(藍(lán)色部分)面積，計(jì)算膠原沉積面積占整個(gè)視野面積的百分比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)、非參數(shù)t 檢驗(yàn)、單因素方差分析(ANOVA)等方法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs 的流式鑒定結(jié)果 BM-MSCs 的表面標(biāo)志物CD29、CD90 呈陽性表達(dá)，CD34、CD45 的表達(dá)呈陰性，證明外泌體來源的細(xì)胞為人BMMSCs，見圖1。

圖1 BM-MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34、CD45 的流式鑒定

2.2 BM-exo 的表征 通過連續(xù)離心和超離心從MSCs 培養(yǎng)上清中純化外泌體，透射電鏡顯示分離的MSC 囊泡具有典型的杯狀異物形狀，具有雙層膜結(jié)構(gòu)。納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示，顆粒的直徑均在30～200 nm 范圍內(nèi)。此外，Western Blot 分析證實(shí)了外泌體CD9 和CD63 的表達(dá)，而作為陰性對(duì)照組的BM-MSCs 不表達(dá)這兩種分子，見圖2。以上結(jié)果表明收集到的BM-MSCs 的分泌顆粒為外泌體。

圖2 BM-exo 的鑒定

2.3 BM-exo 中miR-93-5P 的表達(dá)和體內(nèi)吞噬結(jié)果BM-MSCs 經(jīng)miR-93-5P 抑制劑處理后，收集的BM-exo 中miR-93-5P 的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)，經(jīng)Dil 處理過的外泌體尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)后，免疫熒光顯示，Dil 標(biāo)記的BM-exo 被AQP1 標(biāo)記的腎小管上皮細(xì)胞吞噬，提示腎小管上皮細(xì)胞能吞噬外泌體，見圖3。

圖3 BM-exo 中miR-93-5P 的表達(dá)和腎小管細(xì)胞吞噬圖

2.4 各組小鼠血清BUN、Scr 生化指標(biāo)的變化 與注射PBS 的UUO 小鼠相比，尾靜脈注射BM-exo 的UUO 小鼠第7 天的血BUN、Scr 水平降低，而注射BM-exo/miR-93-5P 抑制劑的UUO 小鼠腎功能并沒有改善(均P＜0.05)，見圖4。

圖4 4 組小鼠BUN、Scr 的表達(dá)變化

2.5 各組小鼠腎組織病理學(xué)改變 Sham 組小鼠腎小球和腎小管未見明顯病理改變。術(shù)后7 d，UUO 模型組和BM-exo/miR-93-5P 抑制劑組小鼠PAS 染色顯示腎小球病變不明顯，而腎小管上皮細(xì)胞扁平，刷狀緣脫落，腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)呈纖維化樣改變，散在炎性細(xì)胞浸潤；Masson 染色顯示UUO 模型組和BM-exo/miR-93-5P 抑制劑組腎間質(zhì)見膠原纖維沉積。而BM-exo 組小鼠腎間質(zhì)病理改變較UUO 模型組和BM-exo/miR-93-5P 抑制劑組輕。量化分析表明BM-exo 組小鼠的腎間質(zhì)纖維化面積顯著低于UUO 模型組和BM-exo/miR-93-5P 抑制劑組(均P＜0.05)。提示BM-exo 可通過miR-93-5P 介導(dǎo)減輕UUO 小鼠腎間質(zhì)的損害程度(圖5，見封三)。

圖5 4 組小鼠病理學(xué)變化

2.6 各組小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的變化 通過對(duì)相關(guān)蛋白的免疫組化染色和Western Blot 分析，發(fā)現(xiàn)UUO 小鼠腎小管上皮標(biāo)志物E-cadherin 的表達(dá)降低，而成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA 的表達(dá)顯著增加，F(xiàn)N 的表達(dá)也明顯增加。與UUO 小鼠相比，BM-exo 能顯著抑制UUO小鼠腎臟FN 和α-SMA 的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)；與BM-exo 組小鼠相比，BM-exo/miR-93-5P抑制劑組小鼠的腎臟纖維化加重(均P＜0.05)。這些結(jié)果表明BM-exo 可通過miR-93-5P 介導(dǎo)抑制UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化，見圖6。

圖6 各組小鼠α-SMA、E-cadherin、FN 的表達(dá)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要特征是間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥介質(zhì)的釋放，而成纖維細(xì)胞的活化和增殖可導(dǎo)致過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積[13]。因此，需要進(jìn)一步闡明腎纖維化的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療干預(yù)措施。BM-MSCs 可改善損傷區(qū)的微環(huán)境，對(duì)受損的腎臟具有保護(hù)作用，其分泌的外泌體富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核糖核酸和miRNA 等生物活性分子，可以調(diào)節(jié)組織或生物體的損傷微環(huán)境[14]。MiRNA 作為非編碼RNA，由于其多樣性具有沉默某些蛋白分子的功能，近些年已經(jīng)成為BM-MSCs 外泌體中研究最為廣泛的生物活性物質(zhì)。其作為外泌體中的一部分，由囊泡包裹分泌到細(xì)胞外，通過細(xì)胞的自分泌或旁分泌功能到達(dá)受損部位發(fā)揮生物活性作用[15-16]。

根據(jù)本研究先前的高通量測(cè)序結(jié)果，與正常人相比，CKD 患者BM-exo 中miR-93-5P 下調(diào)，在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建UUO 小鼠腎纖維化模型，檢測(cè)BM-exo 是否通過miR-93-5P 介導(dǎo)對(duì)小鼠腎臟纖維化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-93-5P 在UUO 誘導(dǎo)的纖維化小鼠的腎臟中表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，提示小鼠腎臟miR-93-5P 的下調(diào)和其纖維化發(fā)生有關(guān)。體內(nèi)吞噬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，BM-exo 能順著尾靜脈血流到達(dá)腎臟，因此，通過尾靜脈注射BM-exo 和加入miR-93-5P 抑制劑的BM-exo 觀察二者對(duì)腎臟纖維化的影響，結(jié)果表明，BM-exo 組UUO 小鼠腎臟病理損傷、腎纖維化明顯改善，而BM-exo/miR-93-5P 抑制劑組對(duì)小鼠腎臟纖維化的進(jìn)展沒有改善作用，提示BM-exo 通過miR-93-5P 介導(dǎo)減輕腎臟纖維化。以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的腎纖維化在腎臟病的發(fā)展中起了核心作用，腎小管上皮細(xì)胞在獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的同時(shí)失去了上皮細(xì)胞的表型，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量大量增加，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，UUO 小鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，而細(xì)胞間黏附分子E-cadherin 的丟失是EMT 發(fā)生的重要決定因素[18]。本研究結(jié)果也證實(shí)，BM-exo 通過miR-93-5P 介導(dǎo)降低UUO 小鼠腎組織中的α-SMA 和FN 沉積，減少E-cadherin 的丟失。

綜上所述，BM-exo 可通過miR-93-5P 介導(dǎo)減輕小鼠腎臟纖維化。本研究結(jié)果為BM-exo 介導(dǎo)的miRNAs 基因療法應(yīng)用于未來慢性腎纖維化的臨床治療提供思路。