谷麗，施智男，周 舒，趙靜婷，翟小玉，顧麗群，花卉*

(南通大學附屬南通第三醫(yī)院皮膚性病科，南通 226006)

皮膚是抵御人體外部環(huán)境的物理、化學或生物等各種刺激的第一道防線。皮膚過度暴露于紫外線(ultraviolet,UV)會導致各種皮膚疾病，如曬傷、紅斑、過早老化、炎癥和氧化損傷[1-2]。人類紫外線暴露的主要來源是太陽光，根據(jù)其波長可分為UVC(100～290 nm)、UVB(290～320 nm)和UVA(320～400 nm)[3]。到達地球表面的紫外線是由95%的UVA 和5%的UVB 組成，UVA 具有更強的穿透性，可達皮下組織，影響真皮和表皮的皮膚結(jié)構(gòu)[4]。皮膚過度暴露UVA輻射后，會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，引起細胞氧化應激，造成細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和膜以及細胞器的損傷，引發(fā)多種細胞反應，包括凋亡和炎癥[5-6]。現(xiàn)階段人們對生活品質(zhì)的追求越來越高，因此探尋一種安全、有效的新型光防護劑，已成為皮膚科研究領域的熱點之一。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是一種不依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黃素腺嘌呤二核苷酸的葡萄糖脫氫酶輔基，具有極強抗氧化還原功效，現(xiàn)已被認為是一種重要的營養(yǎng)生長因子，在調(diào)節(jié)細胞能量代謝過程中發(fā)揮重要的作用[7]。研究[8]表明PQQ 具有多種生理功能，包括保護神經(jīng)和心血管，促進生長和增殖，并作為一種抗氧化劑保護細胞免受氧化應激引起的損傷。然而，關于PQQ 對UVA引起的皮膚急性光損傷的影響鮮見報道。本研究以HaCaT 細胞為研究對象，探討PQQ 對UVA 誘導HaCaT 細胞急性光損傷的保護作用及潛在機制，為新型抗皮膚光損傷產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 HaCaT 細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司；PQQ 購于上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；DMEM 培養(yǎng)液購于美國Gibco 公司；細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、Annexin-V-FITC 凋亡檢測試劑盒、RIPA 緩沖液、BCA 試劑盒、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液購于上海碧云天生物公司；B 淋巴細胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、β-actin 抗體購于上海碧云天生物公司，Bcl-2-associated X 的蛋白質(zhì)(Bcl-2-associated X,Bax)抗體購于美國Abcam公司；UVA 輻射燈、紫外線輻射強度儀購于上海希格瑪高技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 細胞培養(yǎng) 復蘇HaCaT 細胞，接種于含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至近融合狀態(tài)，采用0.25%胰酶消化，按1∶3 傳代至培養(yǎng)皿中。

1.2.2 CCK-8 法測定細胞增殖活性 將細胞接種于96 孔板內(nèi)，待細胞生長至50%，每孔加入不同濃度(50、100、150、200、250 nmol/mL)的PQQ，每個濃度設3 個復孔，對照組加入相同體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育24 h，在450 nm 吸光度下用酶標儀檢測光密度(optical density,OD)值。

1.2.3 UVA 輻射 待細胞密度達80%～90%后，從細胞培養(yǎng)箱中取出，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)替換細胞培養(yǎng)基，用UVA 輻射強度儀標定UVA 照射儀的照射度，UVA 劑量=UVA照射度×時間(s)，光照劑量為UVA 10 J/cm2，培養(yǎng)皿距燈管距離10 cm，一次性連續(xù)照射，照射結(jié)束后，各組細胞換新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。

1.2.4 實驗分組 將HaCaT 細胞接種于細胞培養(yǎng)板，分為4 組：對照組、PQQ 組、UVA 組、UVA+PQQ組。對照組為正常生長的HaCaT 細胞，未予其他處理；PQQ 組用150 nmol/mL PQQ 培養(yǎng)24 h；UVA 組細胞予UVA 10 J/cm2照光；UVA+PQQ 組先予PQQ預處理后培養(yǎng)24 h，然后使用10 J/cm2劑量的UVA照射。

1.2.5 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 將細胞接種于6孔板里，待細胞生長至80%，按要求分別處理各組細胞，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。

1.2.6 細胞內(nèi)ROS 的測定 各組細胞予UVA 輻射后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除細胞培養(yǎng)液，使用無血清培養(yǎng)液1∶1 000 稀釋2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，每孔加入1 mL 蓋住細胞。37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS 水平。

1.2.7 細胞凋亡率檢測 各組細胞予UVA 輻射后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS 沖洗2 次，使用胰酶消化，將細胞懸液放入離心機中1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入流式管中，室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.8 Western Blot 檢測 各組細胞予UVA 輻射后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS 沖洗2 次，使用RIPA 裂解緩沖液裂解細胞，提取各組細胞總蛋白，用BCA 蛋白測定試劑盒(Beyotime)檢測蛋白質(zhì)濃度。制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫下，用5%脫脂牛奶在PBS 中封閉膜1 h，加Bcl-2、Bax 一抗(均1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜2 次，30 min/次，加二抗(1∶1 000)，室溫下孵育3 h 后用TBST 洗膜，最后采用Tanon 5200 全自動化學發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶表達情況。

1.2.9 統(tǒng)計學方法 所有實驗至少重復3 次。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,SanDiego,CA)軟件進行分析，檢測數(shù)據(jù)均以表示，應用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PQQ 對HaCaT 細胞增殖率的影響CCK-8 結(jié)果顯示，50、100、150 nmol/mL PQQ 對Ha-CaT 細胞的增殖活性無明顯影響(均P＞0.05)，濃度為200、250 nmol/mL 時，PQQ 可顯著抑制HaCaT 細胞的增殖活性(均P＜0.01)(圖1)。因此，選擇150 nmol/mL PQQ 用于后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度PQQ 對HaCaT 細胞增殖活性的影響

2.2 PQQ 對UVA 照射HaCaT 細胞形態(tài)學的影響正常的HaCaT 細胞生長狀態(tài)良好，密集分布；UVA照射后，HaCaT 細胞出現(xiàn)皺縮、體積變小，細胞間隙增大，細胞碎片增多，死亡細胞增加；PQQ 預處理后再予UVA 照射，細胞密度增加，細胞間隙減小，且細胞形態(tài)改善；PQQ 處理后對正常HaCaT 細胞的形態(tài)無影響(圖2)。

圖2 PQQ 對UVA 照射HaCaT 細胞形態(tài)學的影響(200×)

2.3 PQQ 對UVA 照射HaCaT 細胞ROS 水平的影響 與對照組相比，UVA 組的ROS 水平明顯升高(P＜0.05)，PQQ 組ROS 水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與UVA 組相比，UVA+PQQ 組的ROS 水平明顯下降(P＜0.05)；結(jié)果表明PQQ 可以顯著降低UVA誘導的ROS 生成(圖3)。

圖3 PQQ 對UVA 照射HaCaT 細胞ROS 水平的影響

2.4 PQQ 對UVA 照射HaCaT 細胞凋亡率的影響與對照組相比，UVA 組細胞的凋亡率明顯增加(P＜0.05)，PQQ 組凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與UVA 組相比，UVA+PQQ 組細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)(圖4)。

圖4 PQQ 對UVA 照射HaCaT 細胞凋亡率的影響

2.5 PQQ 對UVA 照射后HaCaT 細胞凋亡相關蛋白的影響 與對照組相比，UVA 組Bcl-2 的表達顯著降低，Bax 表達顯著增加(P＜0.05)；與UVA 組比較，UVA+PQQ 組Bcl-2 的表達顯著增加，Bax 的表達顯著降低(P＜0.05)(圖5)。

圖5 PQQ 對UVA 輻射后HaCaT 細胞凋亡相關蛋白的影響

3 討論

大量研究[9]證實UVA 輻射誘導的ROS 在皮膚細胞中發(fā)揮重要作用，并導致皮膚氧化應激損傷。因此，通過補充抗氧化劑來提高皮膚細胞的抗氧化能力，可能是預防UVA 導致皮膚光損傷的一個有價值的策略。PQQ 被定義為一種新型的維生素B，廣泛存在于各種食物(蔬菜、水果、牛奶等)中，已被證實具有抗氧化作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，PQQ 對高糖誘導的體外糖尿病腎病模型氧化應激損傷和細胞凋亡具有保護作用，其保護作用與抑制ROS 的產(chǎn)生和提高抗氧化劑超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的水平有關。PQQ可通過減輕軟骨細胞的氧化損傷、DNA 損傷和細胞衰老改善骨關節(jié)炎的癥狀[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外建立的UVA 誘導的光損傷模型中，PQQ 可以保護Ha-CaT 細胞免受氧化應激損傷，主要表現(xiàn)為明顯降低細胞ROS 含量，減少細胞凋亡的發(fā)生，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達及降低促凋亡蛋白Bax 的表達。

UVA 照射可以造成被輻射細胞發(fā)生不同程度的光損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，UVA 照射可引起HaCaT 細胞受損，出現(xiàn)皺縮、變圓，細胞活力降低。通過PQQ預處理后，發(fā)現(xiàn)PQQ 可明顯改善細胞形態(tài)，提高細胞活力，表明PQQ 可以保護細胞免受光損傷。UVA照射引起的ROS 過度釋放會對細胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，并導致皮膚癌、皺紋和光老化，因此控制ROS的水平是防御UVA 光損傷的重要環(huán)節(jié)[14]。研究[15]證明黃芪多糖處理后HaCaT 細胞活力顯著增加，ROS產(chǎn)生受到抑制，同時改善線粒體功能障礙，對UVA誘導的細胞光損傷具有保護作用。本研究采用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS 水平發(fā)現(xiàn)，10 J/cm2UVA 輻射可導致HaCaT 細胞產(chǎn)生ROS 增多，而加入PQQ預處理可明顯抑制ROS 產(chǎn)生。這些結(jié)果提示，PQQ通過清除UVA 照射產(chǎn)生的過量ROS，提高了細胞活力，從而保護HaCaT 細胞免受UVA 誘導的光損傷。

ROS 的穩(wěn)態(tài)是維持細胞正常生理的一個主要因素，ROS 的失衡可能促進線粒體功能障礙并觸發(fā)線粒體介導的凋亡，導致細胞程序性死亡[16]。本研究結(jié)果顯示，暴露于10 J/cm2UVA 后，HaCaT 細胞的凋亡程度顯著增加，而PQQ 處理顯著減少了細胞凋亡，證明PQQ 預處理可改善細胞凋亡情況，具有抗凋亡的作用。UVA 誘導的細胞凋亡是一個復雜的過程，涉及外在途徑和內(nèi)在途徑，內(nèi)在途徑主要是受Bcl-2 家族蛋白和p53 腫瘤抑制蛋白調(diào)控[14]。UVA誘導的細胞凋亡主要是通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，而UVB 誘導的細胞凋亡與p53 的積累有關[17]。S.WU等[18]發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷預處理能增加抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 的比值，從而降低UVA 輻射引起的成纖維細胞的凋亡。與本研究PQQ 預處理可通過上調(diào)Bcl-2 表達，并下調(diào)Bax的表達，進而達到抑制UVA 輻射導致的凋亡率增加的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究初步證實了PQQ 可通過降低ROS 水平，減少細胞凋亡率；同時通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax 的表達起到抗凋亡作用，進而保護HaCaT細胞免于UVA 導致的氧化應激損傷，為治療皮膚光損傷奠定了基礎，但其具體作用機制和靶點有待進一步深入研究。