楊嫻，遲愛秋，范思佳，張偉龍，張琪玟，唐天珍，王佳慧，張青，武藝笑，饒建，林社裕***

(1 南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226019；2 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院；3 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；4 南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

膠質(zhì)瘤是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引起的原發(fā)性腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分為3 種類型：星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，其中由星形膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的膠質(zhì)瘤稱為星形細(xì)胞瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是所有膠質(zhì)瘤中最具侵襲性的一種類型[1]。惡性GBM 具有高度的增殖性和侵襲性，盡管手術(shù)、放療和化療在不斷地改進(jìn)，但預(yù)后依然較差，5 年生存率＜5%[2]。與其他腫瘤相比，膠質(zhì)瘤可分泌多種分子，促進(jìn)腫瘤的生長和增殖，這種對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的固有抵抗可能是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差的主要原因[3-5]。因此，膠質(zhì)瘤患者迫切需要新的治療方案。

TOB1 是抗增殖蛋白家族的成員，在轉(zhuǎn)錄和mRNA衰減中起重要作用[6]。TOB1 的亞細(xì)胞定位表明，其分布在細(xì)胞質(zhì)并通過細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的穿梭作用抑制細(xì)胞增殖[7]。在乳腺癌中，TOB1 可抑制腫瘤發(fā)生，并可作為淋巴結(jié)陰性乳腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志物[8]。此外，TOB1 可通過激活Smad4 和抑制β-catenin 信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。然而，在膠質(zhì)瘤中，TOB1 基因是否仍具有抑瘤作用，是否促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖尚不清楚。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一種短的、非編碼的基因表達(dá)調(diào)控RNA，通過與特定靶mRNA 序列的3'-非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[10]。MiRNAs 已被報(bào)道參與了腫瘤的生長、增殖或凋亡[11]。

促凋亡還是抗凋亡由BCL-2 家族蛋白之間的平衡決定，該家族的抗凋亡成員包括BCL-2(BCL2 apoptosis regulator)、BCL-xl(BCL2 like 1)、BCL-W(BCL2 like 2)、MCL-1(MCL1 apoptosis regulator)和BFL-1(BCL2 related protein A1)，這些蛋白通過與促凋亡蛋白相互作用來抑制凋亡[12-13]。

本研究探討TOB1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和凋亡的影響，旨為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和樣本 收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本15 例及成人顱腦損傷需部分切除腦組織以降低顱內(nèi)壓的患者組織標(biāo)本10 例。所有人體樣本均按照南通大學(xué)附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)評(píng)審委員會(huì)制定的政策使用。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自Thermo Scientific 公司(上海,中國)。U251 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞周期分析、細(xì)胞活力檢測和蛋白提取的試劑盒購自中國海門碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗人TOB1 多克隆抗體購自LifeSpan BioSciences 公司(西雅圖,美國)、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體購自武漢博士德生物科技有限公司(武漢,中國)。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗購自KPL 公司(切斯特,美國)。

1.2 免疫組織化學(xué) 腦組織用預(yù)冷甲醇固定，然后乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片。緩沖液阻斷?？谷薚OB1 兔多克隆抗體、兔抗人BCL-2 或BCL-xl 單克隆抗體孵育。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌后，與生物素化的二抗反應(yīng)(博士德,武漢,中國)，并用SABC 試劑盒檢測，蘇木精復(fù)染，樹脂封片。

1.3 靶向TOB1 基因的miRNA 測定 利用在線軟件TarBase V7.0、miRTarbase 及TargetScan 預(yù)測靶向TOB1 的可能miRNA，這3 個(gè)軟件預(yù)測的原理是依據(jù)實(shí)驗(yàn)或種子區(qū)保守位點(diǎn)進(jìn)行搜索。將U251 細(xì)胞以1×105細(xì)胞/mL 的密度接種到6 cm 培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-25-3p、miR-32-5p 和miR-92a-5p，48 h 后，用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，Western Blot 檢測蛋白表達(dá)。

1.4 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)確認(rèn)TOB1 為miR-92a-3p 的靶基因 基因TOB1 3'-UTR 中miR-92a-3p 的互補(bǔ)序列被擴(kuò)增，并在BamHⅠ及SalⅠ酶切位點(diǎn)處克隆到pGL3-Promoter 載體中。然后，將U251細(xì)胞以3×105細(xì)胞/mL 的密度將接種于6 孔板。24 h后，分別轉(zhuǎn)染TOB1 3'-UTR 質(zhì)粒，TOB1 3'-UTR 突變質(zhì)粒及pGL3-Promoter 質(zhì)粒(陰性對(duì)照)。同時(shí)，這些細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic。48 h 后，收集細(xì)胞，用熒光素酶檢測試劑盒檢測，酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與感染 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251 用杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長到聚合度達(dá)70%～90%時(shí)，換為無血清培養(yǎng)基，并進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，感染病毒分別為TOB1 過表達(dá)慢病毒、TOB1 干擾慢病毒及對(duì)照慢病毒。

1.6 Western Blot 采用RIPA 裂解緩沖液提取蛋白，BCA 檢測試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，然后電泳，并轉(zhuǎn)移到Whatman 硝酸纖維素膜上。與一抗反應(yīng)過夜，二抗反應(yīng)4 h，最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影檢測。

1.7 U251 細(xì)胞活力的測定 采用噻唑藍(lán)比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測TOB1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 活力的影響。將U251 孵育24 h 后，加入MTT(5 mg/mL)，再孵育4 h。加入二甲亞砜150 μL/孔以溶解晶體。用酶標(biāo)儀在570 nm 波長處檢測光密度(optical density,OD)值。

1.8 U251 細(xì)胞周期測定 采用流式細(xì)胞術(shù)分析TOB1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 細(xì)胞周期的影響。首先用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS 洗滌碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.9 U251 細(xì)胞凋亡測定 采用流式細(xì)胞儀分析U251 細(xì)胞凋亡情況。收集U251 細(xì)胞，分別加入5 μL PE Annexin V 和5 mL 7-AAD。然后每管加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，混勻，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.10 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time polymerase chain reaction,Real-time PCR)分析 采用Trizol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并利用ABI PRISM 7500 系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增凋亡相關(guān)因子BCL-2、BCL-xl 等。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測、細(xì)胞活力、增殖指數(shù)、凋亡檢測及凋亡因子Real-time PCR 的分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，免疫組化實(shí)驗(yàn)灰度值統(tǒng)計(jì)分析采用Student t 檢驗(yàn)。數(shù)值用表示，雙尾P 值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOB1 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)受到抑制 免疫組化分析結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中TOB1 基因的表達(dá)受到抑制(P＜0.05)(圖1)。

圖1 腦膠質(zhì)瘤中TOB1 表達(dá)受到抑制

2.2 靶向TOB1 的miRNA 檢測 對(duì)在線軟件預(yù)測的miRNA 進(jìn)行Real-time PCR 檢測，初步篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向TOB1 的可能miRNA 包括miR-25-3p、miR-32-5p 和miR-92a-3p。這些miRNA 由Genepharma Inc.合成，并轉(zhuǎn)染到U251 細(xì)胞株中。通過Western Blot 檢測TOB1 的表達(dá)情況，結(jié)果表明，miR-25-3p、miR-32-5p 和miR-92a-3p 均能調(diào)控TOB1 基因的表達(dá)，其中miR-92a-3p 的作用最強(qiáng)(圖2A)。

構(gòu)建含有TOB1 的3'-UTR 的熒光素酶報(bào)告分析載體(TOB1-3'-UTR)和相應(yīng)的含有TOB1 的3'-UTR 突變的載體(TOB1-3'-UTR 突變)(圖2B)。這些質(zhì)粒包括pGL-3-promoter 質(zhì)粒(陰性對(duì)照)分別與miR-92a-3p mimics 共轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞。分析結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照及TOB1-3'-UTR 突變組相比，TOB1-3'-UTR 組的熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P＜0.01)(圖2C)。這些結(jié)果表明，miR-92a-3p 可以通過直接結(jié)合TOB1 基因的3'-UTR 調(diào)控TOB1 的表達(dá)。

圖2 靶向TOB1 的miRNA 表達(dá)分析，并確認(rèn)miR-92a-3p與TOB1 3'-UTR 的相互作用

2.3 基因TOB1 與細(xì)胞行為學(xué)的關(guān)系分析 將U251 細(xì)胞分別感染對(duì)照慢病毒(對(duì)照組)、TOB1 過表達(dá)慢病毒(過表達(dá)組)和TOB1 siRNA 慢病毒(干擾組)。感染后72 h，Western Blot 結(jié)果顯示，過表達(dá)組的TOB1 蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；干擾組的TOB1 蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)(圖3A)。然后對(duì)3 個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行MTT 檢測，結(jié)果表明：過表達(dá)組的U251 細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)；干擾組U251 細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖3B)。細(xì)胞周期分析顯示，過表達(dá)組PI 顯著低于干擾組(P＜0.05)(圖3C)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達(dá)組的凋亡細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組；干擾組的凋亡細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)(圖3D)。這些結(jié)果提示基因TOB1 可以通過降低U251 細(xì)胞活力，減少U251 細(xì)胞分裂，促進(jìn)U251 細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制U251 細(xì)胞的生長。

圖3 TOB1 對(duì)U251 細(xì)胞行為的影響

2.4 TOB1 對(duì)凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響 采用Realtime PCR 法檢測3 組細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，過表達(dá)組BCL-2 表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，干擾組BCL-2 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(均P＜0.05)；BCL-xl 的表達(dá)趨勢與BCL-2 相同(P＜0.05)，而其他凋亡相關(guān)因子表達(dá)情況說明其不受基因TOB1 的調(diào)控(圖4)。

圖4 Real-time PCR 分析TOB1 對(duì)凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響(*P＜0.05)

2.5 在膠質(zhì)瘤組織中驗(yàn)證TOB1 調(diào)控BCL-xl 和BCL-2 Western Blot 結(jié)果顯示，BCL-xl 和BCL-2的蛋白表達(dá)與mRNA 水平的變化趨勢相同(圖5A)。免疫組化分析結(jié)果顯示，正常腦組織中BCL-2 和BCL-xl 水平顯著低于膠質(zhì)瘤組織(圖5B～C)。提示BCL-2 和BCL-xl 參與TOB1 抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過程。

圖5 TOB1 對(duì)凋亡相關(guān)因子BCL-2、BCL-xl 表達(dá)的影響

3 討論

為探索基因TOB1 在膠質(zhì)瘤中的作用，本研究檢測了TOB1 在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示TOB1 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)下調(diào)。那么，TOB1 的下調(diào)是否與膠質(zhì)瘤的生長和增殖有關(guān)呢？為此，選擇U251 細(xì)胞株作為膠質(zhì)瘤的細(xì)胞模型，通過構(gòu)建TOB1 的過表達(dá)或干擾組，檢測不同模型組的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和凋亡情況，進(jìn)而確定基因TOB1與膠質(zhì)瘤的增殖相關(guān)性。結(jié)果表明，基因TOB1 可降低細(xì)胞活力，增加細(xì)胞凋亡率。因此，TOB1 在腦膠質(zhì)瘤中具有抑瘤作用，該發(fā)現(xiàn)與之前發(fā)現(xiàn)的TOB1 在其他癌癥[14-15]中的作用相一致。

為了探索基因TOB1 下調(diào)的原因，本研究分析了多個(gè)可能的miRNA，結(jié)果表明miR-92a-3p 是最有可能的miRNA。MiR-92a-3p 可以刺激腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素6，并進(jìn)而導(dǎo)致脂肪肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。在膠質(zhì)瘤中，miR-92a-3p 表達(dá)上調(diào)，抑制基因Bim 的表達(dá)，被認(rèn)為是癌基因[17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-92-3p 通過結(jié)合TOB1 基因的3'UTR 區(qū)域，降低了基因TOB1 的表達(dá)。還證實(shí)了基因TOB1 可以通過促進(jìn)U251 細(xì)胞的凋亡來抑制增殖，但是詳細(xì)的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍不清楚。為此，通過Western Blot 和Real-time PCR 檢測了不同處理組U251 細(xì)胞中9 種凋亡相關(guān)因子。結(jié)果表明，抗凋亡因子BCL-2 和BCL-xl 的變化與基因TOB1的變化密切相關(guān)。當(dāng)TOB1 基因上調(diào)時(shí)，BCL-2 和BCL-xl 的表達(dá)顯著降低，反之亦然。說明TOB1 通過下調(diào)抗凋亡因子來促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，此外，膠質(zhì)瘤組織中的免疫組化也提示BCL-2 和BCL-xl 參與了TOB1 基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

BCL-2，抗凋亡因子，通過增加突變細(xì)胞的生存，促進(jìn)了癌癥的形成和發(fā)展。事實(shí)上，BCL-2 還可以通過其具有的線粒體促凋亡BCL-2 家族成員的BCL-2 同源(BH)結(jié)構(gòu)域3(BH3)對(duì)細(xì)胞周期發(fā)揮抑制作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，BCL-2 可以調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)變化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)增加對(duì)凋亡的抵抗作用[18]。根據(jù)本研究結(jié)果，推測TOB1 誘導(dǎo)的BCL-2 基因的表達(dá)調(diào)控主要位于線粒體，抗凋亡蛋白BCL-2 表達(dá)于線粒體外壁，通過控制線粒體的通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。通常，BCL-2 與促凋亡蛋白，如Bax，形成異二聚體，抑制細(xì)胞色素C 釋放，調(diào)節(jié)線粒體跨膜電位，發(fā)揮其抗凋亡作用[19]。

BCL-xl 作為一種抗凋亡蛋白，可以阻止細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[20]?？沟蛲鲆蜃蛹易錌CL-2 的成員BCL-xl 在結(jié)構(gòu)上與Bax 相似，然而，它可以降低膜的滲透性，通過干擾復(fù)合物的形成，降低跨膜通道的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，TOB1 表達(dá)上調(diào)時(shí)，BCL-xl 的表達(dá)顯著下調(diào)，從而引發(fā)一系列凋亡相關(guān)事件，實(shí)現(xiàn)了TOB1 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在膠質(zhì)瘤中，TOB1 是一個(gè)腫瘤抑制基因，其表達(dá)可能受到miR-92a-3p 的調(diào)控而下調(diào)，TOB1 可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制其增殖。當(dāng)然，TOB1 在膠質(zhì)瘤中的更詳細(xì)的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。