王禎芝，張美玲，熊 康，王 淵，王 強(qiáng)，周 鋒

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712021)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，約占急性腦卒中的10%，具有高發(fā)病率和高病死率的特點(diǎn)[1-2]?；颊咄ǔ？沙霈F(xiàn)認(rèn)知障礙，嚴(yán)重影響患者日常功能、生活質(zhì)量[3]。海馬神經(jīng)元損傷是認(rèn)知障礙(Cognitive impairment，CI)的核心問題，蛛網(wǎng)膜下腔出血并發(fā)認(rèn)知障礙是海馬神經(jīng)元凋亡及增殖調(diào)控失常的結(jié)果[4]。目前，臨床對(duì)CI并無較好的治療方法，常用以鹽酸多奈哌齊為主的替代性療法，雖然對(duì)本病有一定治療效果，但存在長(zhǎng)期服用療效減退及不良反應(yīng)多等不足。因此，減緩海馬神經(jīng)元損傷，改善SAH并發(fā)認(rèn)知障礙的臨床表現(xiàn)，提高患者生活質(zhì)量為首要目標(biāo)。近年來，嗅三針作為治療神經(jīng)退行性疾病的特色療法效果較好[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)印跡法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過觀察半胱氨酸蛋白3(Caspase-3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白在大鼠海馬組織的表達(dá)情況，探討嗅三針療法對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠認(rèn)知障礙及Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：以60只清潔級(jí)雄性SD大鼠為研究對(duì)象，平均體重(250±20)g。大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)清潔鼠房，動(dòng)物處理遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：尼莫地平(北京星昊醫(yī)藥股份有限公司)；PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、Caspase-3抗體和二抗(湖北雪瑾生物技術(shù)有限公司)；PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：一次性針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；Vonfrey儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀、離心機(jī)(均為美國(guó)Thermo Fisher公司)，電泳儀、凝膠成像儀、定量PCR儀(均為美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、建模及干預(yù)：取60只成年SD雄性大鼠，隨機(jī)分為五組，即空白組、模型組、嗅三針組、尼莫地平組、假針刺組，每組12只。除空白組外，其余組采用經(jīng)視交叉池注血制備SAH模型，手術(shù)方法參照文獻(xiàn)[7]。術(shù)前將手術(shù)器械嚴(yán)格滅菌處理。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d后,禁水24 h，稱重后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉。待大鼠充分麻醉后，將大鼠俯臥位固定，頭頂剃毛，口齒固定低于雙耳桿平面3.6 mm，碘伏消毒，于頂部成10 mm×20 mm皮瓣，暴露前后囟，于前囟前2.5 mm、中線旁1.3 mm鉆孔，《大鼠立體定向圖譜》示此孔位于前顱窩底與額極交界處，顯微鏡下挑破軟腦膜，見清亮腦脊液溢出，即為蛛網(wǎng)膜下腔，將連接微量注射器的膠管頭由雙耳連線中點(diǎn)處，緊貼前顱底蛛網(wǎng)膜下腔置入約1.1 cm，其頂端至Willis環(huán)前，注入股動(dòng)脈血300 μl，隨后縫合皮膚。術(shù)中注意觀察大鼠呼吸、心跳等情況。待大鼠蘇醒后，送回鼠籠正常飼養(yǎng)。嗅三針組干預(yù)方法：取兩側(cè)迎香及印堂穴。迎香穴位于大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處；印堂穴位于大鼠兩眼眶上緣中點(diǎn)連線與正中線交點(diǎn)。電針方法：迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.2 cm，印堂向鼻根部平刺0.2 cm；正極接印堂，負(fù)極接一側(cè)迎香，刺激10 min，負(fù)極換接另側(cè)迎香，刺激10 min。電針參數(shù)：疏密波，頻率為2 Hz，強(qiáng)度為2 mA。療程：1次/d，5 d為1個(gè)療程，休息2 d，共進(jìn)行4個(gè)療程?？瞻捉M、模型組予嗅三針組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。假針刺組：即雙迎香穴及印堂穴各偏后0.5 cm處，按照嗅三針組時(shí)間留針，不做其他干預(yù)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬區(qū)Caspase-3、PI3K、AKT mRNA表達(dá)：新鮮組織加入Trizol液氮研磨，加入氯仿提取，DEPC雙蒸水沉淀總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，并根據(jù)Q-PCR試劑盒和擴(kuò)增條件，分3個(gè)階段。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，并設(shè)置質(zhì)量控制[8]。將標(biāo)準(zhǔn)品DNA稀釋后分別進(jìn)行基因擴(kuò)增，計(jì)算建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及數(shù)據(jù)收集(5’-3’)。引物序列：β-actin的上游引物為5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游引物為5’-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3’；Caspase-3的上游引物為5’-GTACAGAGCTGGACTGCGGTATTG-3’，下游引物為5’-AGTCGGCCTCCACTGGTATCTTC-3’；AKT的上游引物為5’-GGCAGGAGGAGGAGACGATGG-3’，下游引物為5’-TTCATGGTCACACGGTGCTTGG-3’；PI3K的上游引物為5’-CTGTGCCTTCTGCCTTACGGTTG-3’，下游引物為5’-GCAATCGTCGTGGCGTCCTTC-3’。

1.2.3 Western blot檢測(cè)Caspase-3、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)：取大鼠腦組織加入RIPA裂解液與PMSF，兩者體積比例100∶1，在無菌環(huán)境下，冰上研磨30 min，于4 ℃、12000 r/min條件下離心，15 min后取上清液置于離心管-80 ℃儲(chǔ)存。分離樣品蛋白，制備分離膠與濃縮膠，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量進(jìn)行蛋白上樣，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳1.5 h，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將其放置于5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h，于4 ℃冰箱分別置于Caspase-3、p-PI3K、p-AKT一抗中孵育過夜，TBST洗膜5 min，共3次；加二抗Goat anti Mouse IgG(H+L)HRP(1∶800)，避光室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，共3次；使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影后，用BIO-RAD Quantityone圖像分析軟件進(jìn)行掃描，分析Caspase-3、p-PI3K、p-AKT的灰度值，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3、PI3K、AKT mRNA表達(dá)比較 見表1。與空白組比較，模型組海馬區(qū)PI3K、AKT、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，嗅三針組和尼莫地平組海馬區(qū)PI3K、AKT mRNA表達(dá)均升高，且嗅三針組高于尼莫地平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，嗅三針組和尼莫地平組Caspase-3 mRNA表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3、PI3K、AKT mRNA表達(dá)比較

2.2 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)比較 見表2(圖1)。與空白組比較，模型組海馬組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)量降低，Caspase-3蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較，尼莫地平組、嗅三針組PI3K、AKT蛋白表達(dá)量均升高，Caspase-3蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)比較

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

SAH并發(fā)認(rèn)知障礙屬中醫(yī)“中風(fēng)”“健忘”“癡呆”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病病位在腦，病機(jī)為神機(jī)失用、腦髓空虛。《靈樞·刺節(jié)真邪篇》記載針刺治療本?。骸盀a其有余，補(bǔ)其不足，陰陽平復(fù)，用針若此，疾于解惑”，故臨床治療腦卒中患者認(rèn)知功能障礙以醒腦通絡(luò)，解郁活血為主。針灸作為中醫(yī)特色治療方法，通過針刺患者的特定穴位，具有醒腦開竅，活血化瘀的功效[9]。針灸治療本病選擇種類多樣，本研究所采用的嗅三針是由劉智斌教授創(chuàng)立治療神經(jīng)退行性病變的特色電針療法，已廣泛運(yùn)用臨床多年，療效較好。嗅三針由印堂、迎香穴組成，印堂乃督脈奇穴，而督脈為“陽脈之?！?，可“入絡(luò)腦”，刺之可調(diào)理督脈達(dá)醒腦之效；迎香屬手、足陽明經(jīng)交會(huì)穴，可調(diào)陽經(jīng)，刺之可宣通陽明達(dá)開竅之功。諸穴合用可益智開竅，改善腦部血液微循環(huán)，有助于提升認(rèn)知功能和日常生活能力[10]。針刺治療CI具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，臨床研究發(fā)現(xiàn)嗅三針治療可調(diào)節(jié)海馬區(qū)血液循環(huán)的血液流變學(xué)指標(biāo)，通過調(diào)節(jié)血管舒縮功能，改善患者全身血液循環(huán)，減低血液黏度，增加腦組織血液供應(yīng),促進(jìn)腦細(xì)胞功能恢復(fù)，暢通記憶、學(xué)習(xí)、執(zhí)行等環(huán)路[11-13]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，嗅三針能夠顯著增強(qiáng)CI大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，提高海馬ChAT和AchE活性，提高癡呆大鼠海馬ChAT、SOD的活性[14-15]。

正常情況下，海馬神經(jīng)元向大腦皮層存取記憶，形成認(rèn)知過程[16]，故海馬神經(jīng)元是認(rèn)知功能的核心。蛛網(wǎng)膜下腔出血后血性腦脊液會(huì)長(zhǎng)期損害海馬組織[17-19]，改變大腦內(nèi)微環(huán)境，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡加速[20]。病理學(xué)證實(shí)，過度凋亡是蛛網(wǎng)膜下腔出血海馬神經(jīng)元損傷的主要形式，抑制凋亡可以保護(hù)大鼠腦組織[21-23]。臨床發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元凋亡治療對(duì)CI患者并未取得預(yù)期效果[24]。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，單純提高蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠體內(nèi)具有抗凋亡作用的蛋白激酶B表達(dá)，凋亡改善并不明顯，而神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖可以抑制大鼠神經(jīng)元凋亡，保護(hù)腦組織[25]。有研究表明，SAH大鼠受損腦組織中成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)水平增高[24]，而bFGF主要存在于海馬組織，具有調(diào)控神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育及修復(fù)功能。大量研究表明，bFGF通過增加PI3K/AKT通路活性而抑制細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嗅三針對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的主要機(jī)制可能是通過激活大鼠腦組織PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)組織的炎性損傷。本實(shí)驗(yàn)為嗅三針臨床診療早期CI提供了思路和依據(jù)。針灸治療SAH并發(fā)認(rèn)知障礙雖處于初期探索階段，但在改善癥狀及提高患者生活質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。因此，臨證時(shí)應(yīng)重視中西醫(yī)結(jié)合的治療方式，聯(lián)合用藥，提高臨床療效。