王倩倩，劉永惠，王 蒙，孫連慶

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710061)

目前，全球范圍內(nèi)，糖尿病的患病率持續(xù)上升，據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2017年全球約有糖尿病患者4.15億，預(yù)計(jì)到2040年，全球糖尿病患者可能達(dá)到6.42億[1-2]。糖尿病周?chē)窠?jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，90%以上的糖尿病患者伴有不同程度的周?chē)窠?jīng)病變[3]。糖尿病周?chē)窠?jīng)病變是糖尿病患者高致殘率、高病死率的因素，目前針對(duì)DPN治療藥物卻非常有限[4-5]。臨床發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯在改善DPN臨床癥狀方面效果較好，但作用機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)分支學(xué)科。該方法既考慮了藥物之間的相互作用，也考慮了復(fù)方的復(fù)雜性和多樣性，與中醫(yī)的“整體觀念”“辨證論治”有異曲同工之妙。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛用于探究中藥復(fù)方干預(yù)疾病的作用機(jī)制研究。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和方法，對(duì)桃紅四物湯有效活性成分、靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，分析其治療DPN的作用機(jī)制，為桃紅四物湯治療DPN的基礎(chǔ)研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 本研究的文獻(xiàn)來(lái)源與分析平臺(tái)包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、Uni Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、String數(shù)據(jù)庫(kù)、Cytoscape 3.7.2軟件、R 3.8.6軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 桃紅四物湯主要活性成分及作用靶點(diǎn)篩選：TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)具有識(shí)別藥物有效成分、作用靶點(diǎn)的能力，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎六味中藥的化學(xué)成分，按照口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，類(lèi)藥性(Drug likeness,DL)≥0.18篩選藥物活性成分，進(jìn)而篩選有效成分作用靶點(diǎn)，利用Uni Prot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢?nèi)嗽窗械鞍?，進(jìn)而將靶蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的靶基因，最終獲得靶基因的縮寫(xiě)名稱。

1.2.2 疾病靶點(diǎn)篩選：以“Diabetic peripheral neuropathy”為關(guān)鍵詞，通過(guò)Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選DPN相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因信息，Excel中刪除重復(fù)基因并進(jìn)行合并，得到DPN的靶基因，再將DPN靶基因信息與桃紅四物湯的靶基因進(jìn)行匹配得到兩者的共同靶基因，即為桃紅四物湯治療DPN的潛在靶基因。

1.2.3 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將桃紅四物湯有效成分對(duì)應(yīng)靶基因和DPN靶基因輸入在線軟件作圖工具平臺(tái)繪制韋恩圖。兩者交集靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因間的蛋白互作分析，物種限定為Homo sapiens,設(shè)定置信度>0.4代表兩個(gè)蛋白間有互作關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。以網(wǎng)絡(luò)中各靶基因的節(jié)點(diǎn)連接度值(Degree)為指標(biāo)，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白質(zhì)靶標(biāo)，以R軟件繪制Degree 排名前30的靶點(diǎn)柱狀圖。

1.2.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)：基于桃紅四物湯活性成分靶點(diǎn)與DPN靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 GO富集和KEGG通路分析：為進(jìn)一步篩選出桃紅四物湯作用靶點(diǎn)蛋白，在基因功能及信號(hào)通路中的生物學(xué)效應(yīng)，采用R軟件Bioconductor包分別進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點(diǎn)篩選 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到桃紅四物湯化學(xué)成分，通過(guò)OB值、DL值篩選各單味藥中的潛在活性成分，共獲得桃紅四物湯43個(gè)活性成分。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出855個(gè)桃紅四物湯作用靶點(diǎn)，將篩選出的靶蛋白輸入U(xiǎn)ni Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢靶蛋白簡(jiǎn)稱，去重后得到桃紅四物湯212個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以“Diabetic peripheral neuropathy”為關(guān)鍵詞，篩選DPN相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因信息，去重后收集到DPN靶點(diǎn)基因4662個(gè)。

2.3 桃紅四物湯活性成分與DPN共同靶點(diǎn)韋恩圖 將桃紅四物湯活性成分相關(guān)的212個(gè)靶點(diǎn)和糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的4662個(gè)靶點(diǎn)輸入Bioinformatics & Evolutionary Genomics在線軟件作圖平臺(tái)，繪制韋恩圖，兩者交集為桃紅四物湯活性成分與DPN共同靶點(diǎn)，共150個(gè)(圖1)。圖中藍(lán)色代表桃紅四物湯活性成分靶基因，黃色代表DPN靶基因，二者交集為桃紅四物湯活性成分-DPN共同靶基因。

圖1 桃紅四物湯活性成分與DPN靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選出的桃紅四物湯活性成分與DPN的交集靶點(diǎn)基因?qū)朐诰€網(wǎng)站String進(jìn)行靶基因間的蛋白互作分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，每條邊則表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中共150個(gè)節(jié)點(diǎn)，2826條邊，節(jié)點(diǎn)平均度為37.7。通過(guò)R軟件繪制桃紅四物湯-DPN核心靶基因，其中AKT1、JUN、MAPK1、HSP90AA1、RELA是桃紅四物湯作用DPN的核心基因。

圖2 桃紅四物湯與DPN共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape軟件構(gòu)建桃紅四物湯藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病可視化圖(圖3)。圖中藍(lán)色代表桃紅四物湯；紅色代表桃紅四物湯中藥物的活性成分；綠色代表桃紅四物湯與DPN共有靶基因；黃色代表DPN。桃紅四物湯中作用于DPN的化學(xué)成分有43個(gè)，連接點(diǎn)多的藥物活性成分主要包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黃芩素。

圖3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析 使用R軟件Bioconductor對(duì)150個(gè)共同靶點(diǎn)基因做GO富集分析，得到GO條目155個(gè)，根據(jù)P-value值大小進(jìn)行排序，選取前20條目可視化得到氣泡圖(圖4)。圖中橫坐標(biāo)代表基因富集數(shù)，縱坐標(biāo)代表功能富集；結(jié)果顯示桃紅四物湯主要作用細(xì)胞膜，通過(guò)影響核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類(lèi)固醇激素受體、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等過(guò)程，參與化學(xué)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、抗生素、脂多糖等反應(yīng)。

圖4 桃紅四物湯與DPN共有靶基因GO富集分析

2.7 KEGG通路富集分析 使用R軟件Bioconductor對(duì)150個(gè)共同靶點(diǎn)基因做KEGG通路富集分析，得到166條通路，根據(jù)P-value大小進(jìn)行排序，選取前20條目可視化(圖5)。圖5A中橫坐標(biāo)代表通路中富集基因數(shù)目，縱坐標(biāo)代表通路富集。圖5B紅色大小代表通路中基因數(shù)目多少；綠色代表各個(gè)通路中的具體靶基因；綠色大小代表基因在通路中出現(xiàn)的次數(shù)。KEGG通路富集分析顯示靶點(diǎn)基因顯著富集于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、前列腺癌、TNF信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染等多種途徑。

圖5 桃紅四物湯與DPN通路富集分析圖

3 討 論

中醫(yī)將糖尿病歸屬于“消渴病”范疇，后世醫(yī)家根據(jù)DPN臨床表現(xiàn)將其歸屬于“消渴痿證”“消渴痹證”范疇[6]。歷代醫(yī)家對(duì)DPN的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探索，普遍認(rèn)為DPN多因消渴病程日久，陰損及陽(yáng)，使患者氣血虧虛，陰陽(yáng)失調(diào)，虛實(shí)夾雜，導(dǎo)致瘀血阻滯，脈絡(luò)痹阻，可見(jiàn)“瘀血”是糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的核心病機(jī)[7-8]。桃紅四物湯是活血化瘀的經(jīng)典方劑，在治療DPN方面具有較好的臨床效果，但作用機(jī)制尚不清楚[9-12]。

通過(guò)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)桃紅四物湯的成分進(jìn)行了分析，篩選出桃紅四物湯有效活性成分43個(gè)，其中Degree排名前6位的化學(xué)成分是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黃芩素。槲皮素是一種多酚類(lèi)黃酮化合物，主要通過(guò)調(diào)節(jié)谷胱甘肽、酶活性、活性氧及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑維持氧化平衡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素的攝入量與2型糖尿病的患病率成反比，槲皮素可通過(guò)降低組織中的山梨醇，改善Na+-K+-ATP酶活性，減輕四氧嘧啶誘發(fā)DPN損傷[14-15]。山奈酚是一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)其可降低血糖，改善胰島素敏感性，同時(shí)可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡，減少糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[16-17]。β-谷甾醇是一種常見(jiàn)的植物甾醇，研究發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)抗氧化、抗炎的作用抑制糖尿病及其并發(fā)癥的進(jìn)展[18]。豆甾醇是一種植物甾醇，研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇可通過(guò)增加血液中胰島素濃度，降低血糖濃度，同時(shí)豆甾醇可通過(guò)增加活動(dòng)的過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽發(fā)揮抗氧化活性作用，抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19-20]。木犀草素是一種天然黃酮類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可明顯改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗作用，通過(guò)抗氧化、抗炎途徑抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[21-23]。黃芩素是黃酮類(lèi)化合物之一，研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可減輕胰島損傷，通過(guò)抗氧化應(yīng)激，抑制PKC、p38MAPK及多元醇途徑延緩DPN的發(fā)生[24]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測(cè)桃紅四物湯治療DPN的有效成分主要為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黃芩素。

本研究篩選出藥物-疾病的共同靶標(biāo)蛋白150個(gè)，這些蛋白主要作用于細(xì)胞膜，通過(guò) AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、前列腺癌、TNF信號(hào)通路參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程。AKT1、JUN、MAPK1、HSP90AA1、RELA是以上信號(hào)通路中的核心蛋白。AKT1是AKT家族成員之一，AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。JUN、RELA屬于轉(zhuǎn)錄因子，主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)參與DPN的發(fā)生發(fā)展。MAPK1是MAPK家族的主要成員，在神經(jīng)元細(xì)胞死亡和再生中起重要作用。HSP90AA1是熱休克家族的重要成員，是細(xì)胞間重要的分子伴侶蛋白，主要參與細(xì)胞存活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和炎癥反應(yīng)過(guò)程，是DPN發(fā)生發(fā)展的重要分子。