石佳 朱秀梅 薛夢雨 余超 魏一鳴 楊鳳環(huán) 陳華民

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

植物轉錄因子在植物生長發(fā)育和響應外界環(huán)境刺激等方面發(fā)揮著重要的作用［1-2］，轉錄因子通過與DNA啟動子相結合進而調控下游靶基因的表達，從而發(fā)揮各種重要的生物學調控功能。因此，挖掘、驗證轉錄因子的靶基因是解析其生物學功能機制的關鍵環(huán)節(jié)。研究蛋白與DNA互作的常用方法有凝膠遷移阻滯試驗［3］、酵母單雜交系統(tǒng)［4］和熒光素酶報告系統(tǒng)［5］，這些方法都屬于體外方法，且更適用于具體蛋白和DNA作用的驗證，并不適合用于大規(guī)模篩選未知DNA序列。建立在蛋白質和DNA交聯基礎上的染色質免疫沉淀技術（chromatin immunoprecipitation，ChIP）［6-7］則是探索體內蛋白質-DNA復合物結合情況的重要技術手段。其原理是在活細胞狀態(tài)下用甲醛交聯固定蛋白質-DNA復合物，然后將染色質隨機破碎為一定長度范圍內的小片段，通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性的富集與目的蛋白結合的DNA片段，繼而通過對目的片段進行純化與檢測，獲得與蛋白質相互作用的DNA信息及調控基因信息［8］。近年來，隨著此技術的不斷完善和發(fā)展，尤其是與DNA芯片技術（ChIP-chip）和高通量測序（ChIP-seq）相結合，可以一次性得到目的蛋白在整個基因組上的結合分布，并得到目的蛋白的精確結合位點以及結合基序等信息［9］，因此染色質免疫沉淀技術逐漸成為分析表觀修飾和挖掘特定轉錄因子靶基因的強有力手段。

然而，ChIP試驗操作繁瑣，對目的DNA片段的富集高度依賴特異性抗體，容易出現假陰性/假陽性，重復性差等缺點，且在植物相關研究中，通常是利用過表達目的基因的轉基因植株作為研究材料，但構建轉基因材料耗時耗力，且有些蛋白在植物體內積累豐度較低，這些都對實驗的順利開展和圓滿完成帶來了不利因素。

植物轉錄因子NF-YA（nuclear factor Y subunit A，NF-YA核因子A亞基）與NF-YB和NF-YC共同組成異源三聚轉錄復合體NF-Y（又名血紅素激活蛋白，HAP；CCAAT結合因子，CBF）。NF-Y復合體廣泛存在于真核生物中，通過與CCAAT-box特異結合調控目的基因的表達。CCAAT-box是存在于25%以上的真核生物基因啟動子的一種順式作用元件，調節(jié)啟動子的活性［10］。NF-YA主要通過脫落酸（ABA）途徑調控植物對非生物和生物脅迫的響應［11-13］。研究表明NF-YA基因在調節(jié)植物耐旱性［14］、氮素吸收利用［15］、根瘤發(fā)育［16］、脫落酸（ABA）響應［17］和開花時間［18］等方面具有重要功能。

本研究在水稻原生質瞬時表達系統(tǒng)中，通過對甲醛交聯固定和免疫沉淀核酸的超聲波破碎等影響該試驗成功的關鍵因素進行優(yōu)化，建立了基于水稻原生質體的染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts，ChIP-RP），并以水稻轉錄因子OsNF-YA4為例，通過ChIP-RP技術完成了OsNF-YA4調控靶基因的富集驗證。此技術體系一方面可以最大限度地縮短樣品準備時間，另一方面水稻原生質體表達系統(tǒng)更接近于水稻體內環(huán)境，目的蛋白表達容易，干擾少，目的蛋白所占比重更大，不必再進行細胞核蛋白的分離，可以有效提高ChIP效果。本研究利用優(yōu)化后的水稻原生質體染色質免疫共沉淀技術驗證了轉錄因子OsNF-YAs對下游基因的富集作用，表明ChIPRP是一個可以用于水稻轉錄因子靶基因挖掘的技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 構建載體所需Primer Star MAX、rTaq mix等PCR試劑購于TaKaRa公司；限制性內切酶、T4連接酶購于北京NEB公司。大腸桿菌Trans-T1購于北京全式金生物技術有限公司。鼠源抗Myc標簽單克隆ChIP級別抗體購自Abcam（英國）。Magna ChIPTMProtein A+G Magnetic Beads 購自德國merck millipore 公司。MinElute PCR Purification Kit購自德國QIAGEN公司。超聲破碎儀XC96-11N購自南京新辰生物科技有限公司。染色質免疫共沉淀試驗所需的Lysis buffer、RIPA ChIP buffer、RIPA buffer、LiCl wash buffer、TE buffer均參考 Para 等［19］描述的方法進行配制。

1.1.2 材料 水稻品種日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）為實驗室所保存，所用載體質粒pRTV-Ubi-3Myc由中國農業(yè)科學院植物保護研究所寧約瑟［20］課題組饋贈。

1.2 方法

1.2.1 水稻的培養(yǎng) 挑選顆粒飽滿的水稻種子置于20 mL錐形瓶，加入75%酒精，搖晃1 min，倒掉酒精；加入40%次氯酸鈉，搖晃30 min消毒，倒掉次氯酸鈉；用滅菌蒸餾水清洗3-5次，將吸干表面水分的種子平鋪于1/2 MS（Murashige & Skoog basal medium with vitamins 2.21 g/L，蔗糖20 g/L，植物凝膠0.3 g/L）培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)10 d左右。

1.2.2 融合Myc標簽的NF-YA4表達載體的構建 以水稻cDNA為模板，采用引物NF-YA4-F：5'-ATAGAGCTCATGGAGTCGAGGCCGGGGGG-3'；NFYA4-R：5'- TATGGTACCTGTTTCCTTCTGTAGGAGC TG-3'擴增OsNF-YA4基因，經過SacI和KpnI雙酶切后，將其插入經過同樣雙酶切的pRTV-Ubi-3Myc載體，獲得pRTV-NF-YA4-3Myc重組載體。

1.2.3 原生質體的制備與轉化［21-22］按照原生質體制備方法分離提取4×107細胞，用40% PEG4000（40%（W/V）PEG4000，0.1 mol/L CaCl2，5 mmol/L MES，0.2 mol/L D-mannitol）介導質粒的轉化。

1.2.4 原生質體瞬時表達OsNF-YA4蛋白水平的檢測 1 000×g離心收集原生質體，沉淀用100 μL Tris-HCl buffer（50 mmol/L Tris-HCl pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-100，4 mol/L Urea，1 mmol/L PMSF） 懸 浮，4℃，13 300 r/min離 心 10 min，取上清加入5 × Loading buffer煮沸10 min。Western blot檢測在不同時間點NF-YA4蛋白的積累水平［14］。一抗采用抗Myc標簽的單克隆抗體（Gene Script）（稀釋度為1∶5 000），二抗采用山羊抗小鼠IgG抗體（華興博創(chuàng)）（稀釋度為1∶10 000）。

1.2.5 甲醛對原生質體狀態(tài)的影響 設置0.1%、0.3%、0.7%、1%等不同濃度甲醛分別處理原生質體細胞10 min，125 mmol/L甘氨酸處理5 min終止交聯，通過顯微鏡觀察細胞狀態(tài)，利用血球計數板統(tǒng)計64個視野下的細胞數目，計算處理后細胞數目占初始數目的百分比，數據為3次生物學重復所得。

1.2.6 DNA超聲破碎時間的篩選 取甲醛固定好的原生質體細胞，加入1 mL Lysis buffer，渦旋混勻，置于2 mL離心管中進行超聲破碎。超聲破碎儀功率39%，超聲時間設置為3 s，超聲間隔時間設置為9.9 s，超聲總時長分別設置為5 min、10 min、15 min、20 min、30 min。超聲破碎后4℃，13 300 r/min離心10 min，取上清65℃過夜解交聯并消化蛋白，酒精沉淀DNA，2% DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化效果。

1.2.7 免疫共沉淀

1.2.7.1 染色質樣品的預處理 將超聲破碎后的染色質樣品溶于5 mL RIPA ChIP buffer，4℃，13 300 r/min離心10 min，取上清于新的10 mL離心管。吸取500 μL染色質作為10% input對照，凍于- 20℃。在剩余染色質中加入20 μL protein A/G beads，4℃低溫混合處理樣品1 h，去除可與protein A/G beads非特異性結合的蛋白。

1.2.7.2 抗原抗體的特異性結合 將預處理的樣品等分為兩份，一份加與10 μg Myc標簽抗體結合的磁珠，標記為ChIPs+，一份加不與抗體結合的磁珠標記為ChIPs-，兩組處理同時置于4℃低溫，緩慢混合孵育處理6-8 h以形成磁珠-抗體-抗原蛋白-目的DNA免疫復合物。

1.2.7.3 磁珠-抗體-抗原蛋白-目的DNA免疫復合物的清洗 為減少非特異性結合，磁力架分離磁珠和染色質，依序用以下每種溶液清洗兩次，一次快洗，一次慢洗（4℃低溫洗5 min）。清洗溶液有：RIPA buffer，LiCl wash buffer，TE buffer。第一次 TE buffer后，ChIPs+樣品與ChIPs-樣品分別取200 μL，利用Western blot檢測免疫沉淀效果。

1.2.7.4 解交聯與DNA純化［23］磁力架捕獲磁珠，并除凈 TE buffer。加入 250 μL Elution buffer，65℃孵育15 min，用來洗脫抗體和染色質的復合物。磁力架分離把上清轉移至一個新的離心管。重復洗脫步驟，加入新的250 μL Elution buffer，65℃孵育30 min。把兩次洗脫液混合在一起，總體積為500 μL。每管加入 25 μL 4 mol/L NaCl，10 μL RNase A，37℃孵育2 h然后65℃孵育4 h以上至過夜以解交聯。

在離心管中加入 10 μL 0.5 mol/L EDTA，20 μL 1 mol/L Tris-HCl pH6.5，1 μL proteinase K（20 mg/mL），45℃孵育1.5 h以降解蛋白。利用QIAGEN公司的MinElute PCR Purification Kit回收所富集目的DNA片段，Nano Drop ND-1000儀定量檢測DNA濃度后-20℃保存。

1.2.8 相關基因啟動子CCAAT序列預測及富集DNA的特異性分析 Plant CARE軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［24］預 測NRTs相關基因啟動子序列中CCAAT序列的數目及位置（表1）。以 OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1為研究對象設計引物（表2），以染色質免疫沉淀純化后的DNA（ChIPs+，ChIPs-，input）為模板，利用RT-qPCR檢測染色質免疫共沉淀所富集DNA的特異性。以input為內參，按照2-ΔΔCt法計算，其中 ΔΔCt =（CtChIPs+- Ctinput）-（CtChIPs-- Ctinput），Ct為熒光閾值。

表1 NRTs基因啟動子區(qū)域調控元件的預測Table 1 Prediction of regulatory elements in the promoter region of NRTs genes

表2 RT-qPCR驗證所需的引物序列Table 2 Required primer sequences for RT-qPCR validation

2 結果

2.1 OsNF-YA4瞬時表達載體的構建

利用SacI和KpnI 同時酶切OsNF-YA4基因和pRTV-Ubi-3Myc，回收連接后轉入大腸桿菌Trans-T1，構建pRTV-NF-YA4-3Myc融合表達載體（圖1），挑選陽性菌落克隆送華大基因測序，測序結果表明，OsNF-YA4基因的重組表達載體pRTV-NFYA4-3Myc無堿基突變和移碼，說明pRTV-NF-YA4-3Myc載體構建成功。

圖1 pRTV-NF-YA4-3Myc載體示意圖Fig.1 Schematic diagram of pRTV-NF-YA4-3Myc vector

2.2 OsNF-YA4蛋白積累水平的變化

染色質免疫沉淀效果與目的蛋白的表達量有著緊密的聯系。水稻原生質體轉化是一個瞬時表達的過程，根據孵育時間的不同，蛋白表達水平會有所變化，為確定OsNF-YA4融合蛋白在水稻原生質體中積累水平較高的時間，分別在轉化后 12 h、18 h、24 h、36 h，1 000 ×g離心收集細胞，提取蛋白，采用anti-Myc單抗進行Western blot檢測OsNFYA4蛋白表達量。結果如圖2所示，轉化后12 h時，OsNF-YA4蛋白積累最多，隨著時間延長蛋白積累水平呈下降趨勢，轉化后36 h，蛋白水平明顯降低。因此，確定在水稻原生質體轉化后12 h進行甲醛固定處理。

圖2 原生質體轉化后OsNF-YA4蛋白表達水平的檢測Fig.2 Expressions detection of OsNF-YA4 protein after protoplast transformed

2.3 甲醛交聯濃度的篩選

甲醛處理可以固定蛋白質與DNA的結合，是染色質免疫沉淀至關重要的一步。通常采用1%甲醛真空壓滲來處理植物材料，鑒于原生質體本身比較脆弱易破，首先采用不同濃度甲醛處理原生質體細胞，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。結果表明不同的甲醛濃度都對原生質體的狀態(tài)造成一定的影響，隨著甲醛濃度的升高，原生質體細胞活性也隨之降低（表3）。0.1%甲醛處理后，原生質體的細胞活性為93%，影響相對輕微；1%甲醛濃度處理后，原生質體的細胞活性下降為48%，約一半細胞已破碎，難以保證正常的細胞生理功能。綜合甲醛處理的重要性和原生質體的細胞活性，選取0.7%甲醛來處理水稻原生質體細胞，交聯固定10 min。

表3 不同甲醛終濃度對原生質體細胞活性的影響Table 3 Effects of different final concentrations of formaldehyde on protoplasmic cell activity

2.4 染色質超聲波破碎時間的篩選

染色質片段大小在很大程度上影響了ChIP的實驗效果，通常在100 bp-500 bp之間為好，因此需要利用超聲破碎儀對染色質進行片段化處理。通過設置不同的超聲時長破碎染色質，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化效果。結果表明隨著超聲時長的增加，DNA片段逐漸變小（圖3-A）。當超聲時長為5 min時，部分DNA片段被打斷至1 000 bp左右，片段較大；當超聲時長為15 min和20 min時，DNA片段長度集中在100 bp-500 bp之間，符合后續(xù)實驗要求；當超聲時長為30 min時，大部分DNA片段已被破碎至200 bp左右，表明超聲過度（圖3-A）。在相同條件下，超聲時間過長，蛋白容易降解，所以確定超聲時長為15 min。超聲15 min后，將染色質免疫共沉淀中的input樣品解交聯后，用2%瓊脂糖凝膠檢測，結果表明，DNA片段在100 bp-500 bp之間，主帶在250 bp左右，符合后續(xù)高通量測序要求（圖3-B）。

圖3 OsNF-YA4蛋白ChIPs富集DNA的超聲破碎時間優(yōu)化（A）和效果檢測（B）Fig.3 Optimization of ultrasonic fragmentation time on OsNF-YA4 ChIPs-enriched DNA（A）and validation of the fragmentation（B）

2.5 染色質免疫共沉淀效果的檢測和富集DNA特異性的分析

ChIPs+樣品與ChIPs-樣品在第一次TE Buffer清洗后，吸取總樣品的20%，加5×Loading buffer，Western blot檢測免疫沉淀效果，結果如圖4-A所示，利用anti-Myc單抗可以檢測到ChIPs+樣品中NF-YA4融合蛋白的條帶，而在ChIPs-樣品中未檢測出條帶，說明免疫沉淀效果較好。ChIPs+樣品、ChIPs-樣品和input樣品經過解交聯，消化蛋白質，獲得已純化的DNA樣品。

圖4 染色質免疫共沉淀效果的檢測（A）和所富集DNA的特異性分析（B）Fig.4 Detection of the effect of chromosome immunoprecipitation（A）and specificity analysis of enriched DNA（B）

生物信息學分析發(fā)現NRT 家族成員啟動子區(qū)域分布著若干 OsNF-YAs 結合的CCAAT 序列（表1），推測轉錄因子 OsNF-YAs 可通過與 NRTs基因啟動子區(qū)域的 CCAAT結合，從而調控 NRT 家族成員的表達。所以以ChIP富集DNA為模板，OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1基因啟動子中含有CCAAT序列的片段為研究對象，OsNAR2.1基因啟動子中不含CCAAT序列的片段為陰性對照，RT-qPCR檢測染色質免疫共沉淀所富集DNA特異性。結果發(fā)現ChIPs+樣品相對ChIPs-樣品，基因OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1 啟動子中含有CCAAT序列的片段富集倍數從5倍到50倍不等，OsNAR2.1基因啟動子中不含CCAAT序列的片段無明顯富集，說明成功富集到轉錄因子NF-YA4特異性結合的DNA片段。

3 討論

蛋白質與DNA互作相關研究一直是表觀遺傳學領域的研究熱點，ChIP作為研究蛋白質與DNA互作的傳統(tǒng)手段，在動植物中得到了廣泛應用。然而，高特異性的蛋白抗體和高豐度的蛋白積累是植物材料ChIP的主要限制因素。構建穩(wěn)定遺傳的過表達植物材料可以在很大程度上突破上述問題對ChIP技術的限制，然而，構建穩(wěn)定遺傳材料耗時耗力。利用植物材料進行ChIP時，通常還要提取細胞核蛋白以避免植物中過多雜蛋白的干擾。此外，植物材料的次生代謝物和細胞壁會干擾甲醛交聯效果，甲醛交聯對ChIP結果的影響較大。甲醛處理的時間太短或甲醛濃度過低，會導致蛋白質和DNA形成的復合物交聯不牢固，很容易在超聲時分離；甲醛固定的時間太長，會使目的蛋白的抗原決定簇被屏蔽，不能和抗體有效結合，引起免疫沉淀效果降低［25］；甲醛濃度過高，葉綠素不易降解，導致與葉綠體連在一起的細胞核中的染色質難以純化［26］。植物細胞壁的存在阻礙了甲醛的穿透，不易利用ChIP-seq識別植物轉錄因子的靶基因結合位點，當交聯劑到達完整植物細胞的細胞核時，瞬時的轉錄因子相互作用可能已經停止［19］。

為規(guī)避以上不利因素，本文建立了基于水稻原生質體瞬時表達系統(tǒng)的染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitation based on rice protoplast transient expression system，ChIP-RP）。通過不同濃度梯度甲醛對原生質體細胞活性的影響，發(fā)現0.7%甲醛終濃度對細胞活性傷害相對較小，也可以滿足DNA與蛋白質的交聯效果。原生質體提取過程中剔除了植物細胞壁和絕大多數干擾蛋白，可以將交聯的原生質體直接震蕩破碎，超聲處理，避免了細胞核蛋白的提取步驟。染色質免疫共沉淀過程中，超聲破碎細胞染色質的程度對試驗成功至關重要。超聲不徹底會引起染色質蛋白復合物過大，抗體不易富集，影響后續(xù)試驗；超聲過度會引起蛋白降解或蛋白抗原表位被破壞，影響后續(xù)免疫沉淀過程［27］。一般認為DNA打斷片段在100 bp-500 bp之間，主帶在250 bp左右符合后期的高通量測序建庫要求。我們采用不同時長超聲破碎，結果表明超聲功率39%，3 s運行，9.9 s間歇，超聲15 min是水稻原生質體染色質破碎最適條件。

OsNF-YAs作為轉錄因子可以與CCAAT序列特異結合，從而通過調控NRT家族基因的表達而發(fā)揮其生物學功能。我們以OsNF-YA4為目標蛋白，通過ChIP-RP技術免疫沉淀了OsNF-YA4結合的DNA序列，qRT-PCR檢測說明含CCAAT序列的片段得到了明顯的富集，其中OsNRT2.1啟動子片段富集高達50多倍，而不含CCAAT的對照片段則沒有富集，表明OsNF-YA4富集到的DNA具有明確的特異性。

4 結論

本研究通過對水稻原生質體瞬時表達、甲醛交聯濃度、超聲破碎條件等關鍵條件的優(yōu)化，建立了基于水稻原生質體的染色質免疫共沉淀技術體系（ChIP-RP），并通過水稻轉錄因子OsNF-YA4免疫沉淀富集到DNA的特異性驗證了ChIP-RP的適用性。本技術體系可用于快速篩選和挖掘水稻轉錄因子直接調控的靶基因，為解析水稻轉錄因子的分子機制提供了極大的便利。